本發(fā)明涉及藥物化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種利用天然糖抗體靶向免疫治療腫瘤的脂質(zhì)體及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

鼠李糖(rhamnose,Rha)是一種單糖，存在于許多細(xì)菌中，但人體中卻不能合成。大量研究已經(jīng)表明鼠李糖具有免疫原性。而最近的研究發(fā)現(xiàn)，在人體血清中具有高滴度的鼠李糖抗體，并且其含量比α-Gal豐富，而改造過的α-Gal已被利用多價(jià)效應(yīng)能有效殺傷腫瘤細(xì)胞。而且在野生型小鼠中，anti-Rha比anti-α-Gal數(shù)量多很多，anti-α-Gal幾乎沒有，說明如果做小鼠實(shí)驗(yàn)的話，利用anti-α-Gal需要將小鼠體內(nèi)的半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因進(jìn)行敲除，而利用anti-Rha則不用；另外，鼠李糖的結(jié)構(gòu)也比α-Gal簡單，更容易通過化學(xué)方法進(jìn)行改造。這提示我們，應(yīng)用鼠李糖作為免疫抗原進(jìn)行改造，用作抗腫瘤藥物研究會(huì)有更好的效果。

脂質(zhì)體是一種很好的運(yùn)送載體，很多研究都利用脂質(zhì)體包裹藥物。但是脂質(zhì)體載藥普遍面臨一大問題，即包封率不高且容易泄露，另外許多藥物本身毒副作用大，這些都極大地限制了脂質(zhì)體包封藥物的應(yīng)用。而且腫瘤細(xì)胞有許多分子特征，特別是一些腫瘤細(xì)胞表面會(huì)過表達(dá)許多受體，如表皮生長因子受體(EGFR)、葉酸受體(FR)等；其中葉酸受體在90％的腫瘤細(xì)胞表面過表達(dá)，如卵巢癌、乳腺癌、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、腎癌、膀胱癌、胰腺癌、黑色素瘤、骨肉瘤等。況且，葉酸分子結(jié)構(gòu)簡單，易于進(jìn)行化學(xué)改造。本發(fā)明采用鼠李糖和葉酸修飾的磷脂作為原料制備脂質(zhì)體，無需包裹、靶向性好，充分利用人體天然免疫高效殺傷腫瘤細(xì)胞，毒副作用極小。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個(gè)目的提供一種新型磷脂類衍生物，其可用于制備靶向免疫治療腫瘤的脂質(zhì)體，利用補(bǔ)體依賴毒性免疫靶向殺傷腫瘤細(xì)胞。

本發(fā)明提供了一種新型的磷脂類衍生化合物，其具有如式(I)所示的結(jié)構(gòu)：

其中，R₁選自如下的基團(tuán)：

R₂選自如下的基團(tuán)：

其中，式(I)結(jié)構(gòu)中的m為大于零的正整數(shù)；優(yōu)選的，m的范圍為1-500的正整數(shù)；更優(yōu)選的，m的范圍為1-40、40-50或50-500的正整數(shù)；更優(yōu)選的，m的范圍為20-40、40-50或50-150的正整數(shù)；最優(yōu)選的，m為正整數(shù)45；

其中，R₁基團(tuán)中的R₃選自H，Na，K，更優(yōu)選為H；

其中，R₂基團(tuán)中的R₄為一價(jià)陽離子，選自H⁺，Na⁺，K⁺，NH₄⁺，優(yōu)選為NH₄⁺；

其中，R₂基團(tuán)中的n為10-20的正整數(shù)；優(yōu)選的，n為正整數(shù)12，14或16；更優(yōu)選的，n為正整數(shù)16；

其中，R₂基團(tuán)中的p和q各自為5-15的正整數(shù)；優(yōu)選的，p和q各自為5-10的正整數(shù)；更優(yōu)選的，p和q分別為正整數(shù)7。

優(yōu)選的,式(I)選自如下結(jié)構(gòu)的化合物：

(1)

(2)

式(I)的化合物是由PEG修飾的磷脂與葉酸或鼠李糖反應(yīng)生成。其中，磷脂主體結(jié)構(gòu)的如R₂所示，優(yōu)選的磷脂種類為1,2-二油酰-SN-甘油-3-磷脂酰乙醇胺(DOPE)，二-十二?；字Ｒ掖及?DLPE),二-十四酰基磷脂酰乙醇胺(DMPE),1,2-二硬酯酸-3-磷脂酰乙醇胺(DSPE),棕櫚酰油酰磷脂酰膽堿(POPC)。更優(yōu)選的磷脂種類為1,2-二油酰-SN-甘油-3-磷脂酰乙醇胺(DOPE)或1,2-二硬酯酸-3-磷脂酰乙醇胺(DSPE)。

修飾磷脂的聚乙二醇分子量優(yōu)選為1000-200000道爾頓，優(yōu)選為1000-50000道爾頓，更優(yōu)選為2000-20000道爾頓。

將聚乙二醇修飾的磷脂與葉酸(Folate)或鼠李糖(Rhamnose)反應(yīng)生成磷脂-PEG-Folate或磷脂-PEG-Rhamnose,其通式結(jié)構(gòu)如式(I)所示。優(yōu)選的，當(dāng)所述的PEG分子量為2000時(shí)，通式中的m值為45。更優(yōu)選的，當(dāng)所述的磷脂為DSPE時(shí)，可以得到兩種類型的具體化合物，1,2二硬酯酸-3磷脂酰乙醇胺－聚乙二醇－葉酸(DSPE-PEG-Folate)，1,2二硬酯酸-3磷脂酰乙醇胺－聚乙二醇－鼠李糖(DSPE-PEG-Rhamnose)。其中，優(yōu)選的分子DSPE-PEG2000-Folate和DSPE-PEG2000-Rhamnose的結(jié)構(gòu)式分別如(1)和(2)所述。

本發(fā)明的另一目的是提供一種磷脂-PEG-Folate分子的制備方法，所述方法包括如下的步驟：

(1)將葉酸與聚乙二醇修飾的磷脂在合適的溶劑及催化劑環(huán)境下反應(yīng)；

(2)分離得到磷脂-PEG-Folate分子，該分子結(jié)構(gòu)如式(I)所示：

其中，R₁基團(tuán)的結(jié)構(gòu)如下所示：

R₂選自如下的基團(tuán)：

其中，式(I)結(jié)構(gòu)中的m為大于零的正整數(shù)；優(yōu)選的，m的范圍為1-500的正整數(shù)；更優(yōu)選的，m的范圍為1-40、40-50或50-500的正整數(shù)；更優(yōu)選的，m的范圍為20-40、40-50或50-150的正整數(shù)最優(yōu)選的，m為正整數(shù)45；

其中，R₁基團(tuán)中的R₃選自H，Na，K，更優(yōu)選為H；

其中，R₂基團(tuán)中的R₄為一價(jià)陽離子，選自H⁺，Na⁺，K⁺，NH₄⁺，優(yōu)選為NH₄⁺；

其中，R₂基團(tuán)中的n為10-20的正整數(shù)；優(yōu)選的，n為正整數(shù)12，14或16；更優(yōu)選的，n為整數(shù)16；

其中，R₂基團(tuán)中的p和q各自為5-15的正整數(shù)；優(yōu)選的，p和q各自為5-10的正整數(shù)；更優(yōu)選的，p和q分別為正整數(shù)7。

上述反應(yīng)步驟(1)中，優(yōu)選的PEG修飾的磷脂種類為DOPE-PEG-NH₂，DLPE-PEG-NH₂,DMPE-PEG-NH₂,DSPE-PEG-NH₂，POPC-PEG-NH₂。更優(yōu)選的PEG修飾的磷脂種類DOPE-PEG-NH₂或DSPE-PEG-NH₂。修飾磷脂的聚乙二醇分子量優(yōu)選為1000-200000道爾頓，優(yōu)選為1000-50000道爾頓，更優(yōu)選為2000-20000道爾頓。一種優(yōu)選的PEG修飾的磷脂為DSPE-PEG2000-NH₂。

上述反應(yīng)步驟(1)中，所述合適的溶劑選自二甲亞砜(DMSO)、甲醇、乙醇、氯仿、丙酮、乙醚及乙酸乙酯中的一種或其混合物，優(yōu)選為二甲亞砜(DMSO)。反應(yīng)條件為將葉酸(Folate)溶解在DMSO中，再加入PEG修飾的磷脂(例如DSPE-PEG-NH2或DOPE-PEG-NH₂)和吡啶。其中葉酸和PEG修飾的磷脂的摩爾比為1:1-20:1，優(yōu)選為1:1-10:1，更優(yōu)選為1:1-5:1。反應(yīng)溫度為0℃-45℃，優(yōu)選為10℃-30℃，優(yōu)選為室溫環(huán)境。

上述反應(yīng)步驟(1)中，所述合適的催化劑為常用縮合劑，如二環(huán)己基二亞胺(DCC)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)等，更優(yōu)選為二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)。

上述反應(yīng)步驟(2)中，反應(yīng)完成后加熱蒸發(fā)去除溶劑，加入水溶解，離心收取上清，透析后，凍干得到磷脂-PEG-Folate分子。

本發(fā)明的另一目的是提供一種磷脂-PEG-Rhamnose分子的制備方法，所述方法包括如下的步驟：

(1)將鼠李糖衍生物(RhaNBuacid)與聚乙二醇修飾的磷脂在合適的溶劑及催化劑環(huán)境下反應(yīng)；其中，鼠李糖衍生物的結(jié)構(gòu)

如下所示：

(2)分離得到磷脂-PEG-Rhamnose分子，其結(jié)構(gòu)如式(I)所示：

其中，R₁基團(tuán)的結(jié)構(gòu)如下所示：

R₂選自如下的基團(tuán)：

其中，式(I)結(jié)構(gòu)中的m為大于零的正整數(shù)；優(yōu)選的，m的范圍為1-500的正整數(shù)；更優(yōu)選的，m的范圍為1-40、40-50或50-500的正整數(shù)；更優(yōu)選的，m的范圍為20-40、40-50或50-150的正整數(shù)；最優(yōu)選的，m為正整數(shù)45；

其中，R₁基團(tuán)中的R₃選自H，Na，K，更優(yōu)選為H；

其中，R₂基團(tuán)中的R₄為一價(jià)陽離子，選自H⁺，Na⁺，K⁺，NH₄⁺，優(yōu)選為NH₄⁺；

其中，R₂基團(tuán)中的n為10-20的正整數(shù)；優(yōu)選的，n為正整數(shù)12，14或16；更優(yōu)選的，n為整數(shù)16；

其中，R₂基團(tuán)中的p和q各自為5-15的正整數(shù)；優(yōu)選的，p和q各自為5-10的正整數(shù)；更優(yōu)選的，p和q分別為正整數(shù)7。

上述反應(yīng)步驟(1)中，優(yōu)選的PEG修飾的磷脂種類為DOPE-PEG-NH₂，DLPE-PEG-NH₂,DMPE-PEG-NH₂,DSPE-PEG-NH₂,POPC-PEG-NH₂。更優(yōu)選的PEG修飾的磷脂種類DOPE-PEG-NH₂或DSPE-PEG-NH₂。修飾磷脂的聚乙二醇分子量優(yōu)選為1000-200000道爾頓，優(yōu)選為1000-50000道爾頓，更優(yōu)選為2000-20000道爾頓。一種優(yōu)選的PEG修飾的磷脂為DSPE-PEG2000-NH₂。

上述反應(yīng)步驟(1)中，所述合適的溶劑選自二甲亞砜(DMSO)、甲醇、乙醇、氯仿、丙酮、乙醚及乙酸乙酯中的一種或其混合物，優(yōu)選為二甲亞砜(DMSO)。反應(yīng)條件為將RhaNBuacid溶解在DMSO中，再加入PEG修飾的磷脂(例如DSPE-PEG-NH2或DOPE-PEG-NH₂)和吡啶。其中RhaNBuacid和PEG修飾的磷脂的摩爾比為1:1-20:1，優(yōu)選為5:1-20:1，更優(yōu)選為10:1-20:1。反應(yīng)溫度為0℃-45℃，優(yōu)選為10℃-30℃，優(yōu)選為室溫環(huán)境。

上述反應(yīng)步驟(1)中，所述合適的催化劑為常用縮合劑，如二環(huán)己基二亞胺(DCC)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)等，更優(yōu)選為二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)。

上述反應(yīng)步驟(2)中，反應(yīng)完成后加熱蒸發(fā)去除溶劑，加入水溶解，離心收取上清，透析后，凍干得到磷脂-PEG-Rhamnose分子。

上述反應(yīng)中步驟(1)中，其中鼠李糖衍生物RhaNBuacid的合成過程如圖2-2所示。具體為鼠李糖在酸酐和吡啶環(huán)境下使糖分子上的羥基乙?；?，然后在TMSN₃和SnCl₄環(huán)境下反應(yīng)得到之后該化合物通過兩步反應(yīng)與琥珀酐生成之后在堿環(huán)境下脫去保護(hù)基團(tuán)得到鼠李糖衍生物RhaNBuacid。

本發(fā)明的另一目的是提供一種含有式(I)所述磷脂類衍生物的脂質(zhì)體藥物組合物，其可用于靶向免疫治療腫瘤，利用補(bǔ)體依賴毒性免疫靶向殺傷腫瘤細(xì)胞。

本發(fā)明所述的脂質(zhì)體藥物組合物，包含磷脂，磷脂-PEG-Folate和磷脂-PEG-Rhamnose，其中磷脂：磷脂-PEG-Folate：磷脂-PEG-Rhamnose的摩爾比為100～1000：0.1～1:1～5000。優(yōu)選的摩爾比為500～1000：0.5～1：100～5000，更優(yōu)選的摩爾比為500～1000：1：100～5000，最優(yōu)選的摩爾比為1000：1：100～3000。

上述藥物組合物中，磷脂選自為1,2-二油酰-SN-甘油-3-磷脂酰乙醇胺(DOPE)，二-十二?；字Ｒ掖及?DLPE),二-十四?；字Ｒ掖及?DMPE),1,2-二硬酯酸-3-磷脂酰乙醇胺(DSPE),二油酰磷脂酰膽堿(DOPC)。優(yōu)選的磷脂為DOPE和DOPC，更優(yōu)選的磷脂為DOPE。

上述藥物組合物中，磷脂-PEG-Folate分子優(yōu)選為DOPE-PEG-Folate，DLPE-PEG-Folate,DMPE-PEG-Folate,DSPE-PEG-Folate。其中，PEG分子量優(yōu)選為1000-200000道爾頓，優(yōu)選為1000-50000道爾頓，更優(yōu)選為2000-20000道爾頓。一種優(yōu)選的磷脂-PEG-Folate分子為DSPE-PEG2000-Folate分子。

上述藥物組合物中，磷脂-PEG-Rhamnose分子優(yōu)選為DOPE-PEG-Rhamnose，DLPE-PEG-Rhamnose,DMPE-PEG-Rhamnose,DSPE-PEG-Rhamnose。其中，PEG分子量優(yōu)選為1000-200000道爾頓，優(yōu)選為1000-50000道爾頓，更優(yōu)選為2000-20000道爾頓。一種優(yōu)選的磷脂-PEG-Rhamnose分子為DSPE-PEG2000-Rhamnose分子。

膽固醇可調(diào)節(jié)磷脂雙分子層膜的流動(dòng)性，使膜通透性降低，減少藥物滲漏。同時(shí)可使脂膜維持一定柔韌性，增強(qiáng)脂質(zhì)體囊泡抗擊外部條件變化的能力。并對磷脂的氧化有一定保護(hù)作用。制備普通載藥脂質(zhì)體，膽固醇是必須的添加物，用量一般為膽固醇:磷脂＝0.3-1(摩爾比)。因磷脂(PC)和藥物的不同，存在膽固醇的最佳用量。在一定范圍內(nèi)，脂質(zhì)體的粒徑、氧化穩(wěn)定性、物理穩(wěn)定性與膽固醇添加量成正相關(guān)，超出范圍時(shí)，超過膜負(fù)荷，會(huì)造成部分脂質(zhì)體破裂。另外，膽固醇的添加會(huì)對膜相變溫度有一定影響，臨界值以內(nèi)使相變溫度降低，臨界值以上，使相變溫度升高。如果不載藥的話，可以選擇不添加膽固醇。

作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的技術(shù)方案，本發(fā)明公開了一種脂質(zhì)體藥物組合物，包含磷脂，膽固醇，磷脂-PEG-Folate和磷脂-PEG-Rhamnose，其中磷脂：膽固醇：磷脂-PEG-Folate：磷脂-PEG-Rhamnose的摩爾比為100～1000：100～1000：0.1～1:1～5000。上述藥物組合物中,磷脂：膽固醇：磷脂-PEG-Folate：磷脂-PEG-Rhamnose的摩爾比優(yōu)選為500～1000：500～1000：0.5～1：100～5000，更優(yōu)選的摩爾比為500～1000：500～1000：1：100～5000，最優(yōu)選的摩爾比為1000：1000：1：100～3000。

作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的技術(shù)方案，本發(fā)明公開了一種脂質(zhì)體藥物組合物，包含磷脂，膽固醇，磷脂-PEG-Folate和磷脂-PEG-Rhamnose，其中磷脂：膽固醇：磷脂-PEG-Folate：磷脂-PEG-Rha的摩爾比為100～1000：100～1000：0.1～1:1～5000；其中所述的磷脂為DOPE，磷脂-PEG-Folate為DSPE-PEG-Folate，磷脂-PEG-Rhamnose為DSPE-PEG-Rhamnose。

作為本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的技術(shù)方案，本發(fā)明公開了一種脂質(zhì)體藥物組合物，包含磷脂，膽固醇，磷脂-PEG-Folate和磷脂-PEG-Rhamnose，其中磷脂：膽固醇：磷脂-PEG-Folate：磷脂-PEG-Rha的摩爾比為500～1000：500～1000：1：100～3000；其中所述的磷脂為DOPE，磷脂-PEG-Folate為DSPE-PEG-Folate，磷脂-PEG-Rhamnose為DSPE-PEG-Rhamnose。

作為本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的技術(shù)方案，本發(fā)明公開了一種脂質(zhì)體藥物組合物，包含磷脂，膽固醇，磷脂-PEG-Folate和磷脂-PEG-Rhamnose，其中磷脂：膽固醇：磷脂-PEG-Folate：磷脂-PEG-Rha的摩爾比為1000：1000：1：100～3000；其中所述的磷脂為DOPE，磷脂-PEG-Folate為DSPE-PEG2000-Folate，磷脂-PEG-Rhamnose為DSPE-PEG2000-Rhamnose。

本發(fā)明脂質(zhì)體組分中，通過優(yōu)化DSPE-PEG-Rhamnose與DSPE-PEG-Folate的摩爾比，可使補(bǔ)體依賴的毒性達(dá)到最佳。例如，當(dāng)DSPE-PEG2000-Rhamnose與DSPE-PEG2000-Folate的摩爾比為100：1，CDC％為20％；DSPE-PEG2000-Rhamnose與DSPE-PEG2000-Folate的摩爾比為1000：1，CDC％為29％；DSPE-PEG2000-Rhamnose與DSPE-PEG2000-Folate的摩爾比為2500：1，CDC％為58.5％。

優(yōu)選的，上述的組合物中還可進(jìn)一步包括附加劑，例如陽離子脂質(zhì)體DOTMA或DOTAP，優(yōu)選為DOTAP；其中，磷脂-PEG-Folate相對于陽離子脂質(zhì)體的摩爾比為1:1-1:10，優(yōu)選為1:2-1:6，更優(yōu)選為1:4。

本發(fā)明提供的脂質(zhì)體藥物組合物粒徑范圍在80～200nm之間，Zeta電位值為|zeta電位|>30mV。制備靶向脂質(zhì)體，作為本發(fā)明的重要改進(jìn)與完善，本發(fā)明中所優(yōu)化的脂質(zhì)體濃度以葉酸的濃度來計(jì)算，并且其最佳工作濃度為10^-7M。

本發(fā)明的另一目的是提供一種制備上述脂質(zhì)體藥物組合物方法，其包括如下的步驟：

(1)、取按摩爾比為1～5000的磷脂-PEG-Rhamnose，0.1～1的磷脂-PEG-Folate，100～1000的磷脂，加入適量有機(jī)溶劑，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶媒，形成薄的均勻的脂質(zhì)膜；

(2)加入pH范圍6.0-8.5的緩沖液洗滌脂質(zhì)膜，超聲；

(3)將溶液通過薄膜擠壓器反復(fù)擠壓，得到粒徑大小均勻的脂質(zhì)體。

上述方法步驟(1)中，磷脂-PEG-Rhamnose，磷脂-PEG-Folate和磷脂的定義如前所述，其優(yōu)選的摩爾比范圍亦如前所述。

若脂質(zhì)體組合物含有膽固醇，則步驟(1)為取按摩爾比為1～5000的磷脂-PEG-Rhamnose，0.1～1的磷脂-PEG-Folate，100～1000的磷脂，100～1000的膽固醇，加入適量有機(jī)溶劑，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶媒，形成薄的均勻的脂質(zhì)膜；

所述方法步驟(1)中，有機(jī)溶劑為二甲亞砜(DMSO)、甲醇、乙醇、氯仿、丙酮、乙醚及乙酸乙酯中的一種或其混合物，優(yōu)選為氯仿和甲醇的混合液，其體積比氯仿：甲醇為1:1～10:1(V/V)，優(yōu)選為9：1(V/V)。

所述方法步驟(2)中，緩沖液選自水溶液狀態(tài)下pH值為6.0-8.5的緩沖液，例如PBS、HEPES、Hanks或者生理鹽水，優(yōu)選為PBS。

所述方法步驟(3)中，薄膜選自孔徑大小為80nm～200nm多聚碳酸(PC)膜，優(yōu)選為Whatman 200nm PC膜。脂質(zhì)體多次通過擠出膜的過濾使單室脂質(zhì)體的粒徑呈正態(tài)分布，優(yōu)選經(jīng)過10-20次的反復(fù)擠壓，最后獲得的脂質(zhì)體粒徑大小為80nm～200nm。

作為一種優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明中具體的靶向脂質(zhì)體制備方法如下：三種組分均溶解在氯仿/甲醇＝9：1的混合溶液中。稱量配制母液為10^-3M的DSPE-PEG2000-Folate，10^-2M的DSPE-PEG2000-Rhamnose和10^-1M的DOPE.按上述摩爾比，分別加入一定量體積的三種組分稀釋在氯仿/甲醇＝9：1的混合溶液中。然后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋干，形成脂質(zhì)膜后，通往一股氮?dú)鈿饬?，真空避光旋干過液，第二天加入3g直徑約2mm的干凈玻璃珠和一定量pH 7.4的PBS再次通入一股氮?dú)鈿饬骱?，旋轉(zhuǎn)洗滌脂質(zhì)膜30分鐘，接著水浴超聲2分種，最后用200nm的多聚碳酸(PC)膜，擠出理想粒徑大小的脂質(zhì)體。

本發(fā)明的另一目的是提供了式(I)的化合物以及由式(I)的化合物制備得到的脂質(zhì)體組合物在制備治療腫瘤疾病藥物中的用途。

本發(fā)明所制備的脂質(zhì)體可以利用配體與受體高度特異性的親和力，將帶有葉酸和鼠李糖的脂質(zhì)體準(zhǔn)確地靶向到葉酸受體過表達(dá)的腫瘤細(xì)胞，相比于葉酸受體低表達(dá)的正常細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞會(huì)利用高親和力和多價(jià)效應(yīng)使得細(xì)胞表面帶上更多數(shù)量的鼠李糖抗原，該鼠李糖抗原會(huì)招募人體血清里面天然的鼠李糖抗體，從而結(jié)合補(bǔ)體系統(tǒng)中的C1q蛋白，進(jìn)而啟動(dòng)了蛋白酶活性，形成攻膜復(fù)合物，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的裂解。本發(fā)明獲得的脂質(zhì)體制劑能發(fā)揮高效的補(bǔ)體依賴毒性，可用于治療多種實(shí)體瘤，例如卵巢癌、乳腺癌、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、腎癌、膀胱癌、胰腺癌、黑色素瘤、骨肉瘤等葉酸受體過表達(dá)的腫瘤，在體外實(shí)驗(yàn)中殺傷這些腫瘤細(xì)胞明顯，更為重要的是在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中也能夠發(fā)揮顯著作用，說明本發(fā)明所采用的策略制備脂質(zhì)體，療效可靠。本發(fā)明制備的脂質(zhì)體制劑可經(jīng)注射途徑給藥，如靜脈、肌肉或皮下注射給藥。

本發(fā)明技術(shù)與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明技術(shù)所用脂質(zhì)體的量的數(shù)量級為10^-7M，而相比現(xiàn)有技術(shù)包裹脂質(zhì)體用藥的數(shù)量級10^-6M-10^-3M，其用藥量更少，生產(chǎn)更為廉價(jià)，濃度低、無需包封、穩(wěn)定性更好；除此之外，本發(fā)明技術(shù)是利用人體天然糖抗體發(fā)揮補(bǔ)體毒性作用，因此，毒副作用更低；而且，本發(fā)明技術(shù)是針對癌細(xì)胞表面過表達(dá)的受體，要利用多價(jià)效應(yīng)才能發(fā)揮作用，不針對正常細(xì)胞，所以靶向性更好；能夠利用免疫小鼠進(jìn)行活體實(shí)驗(yàn)，更加適用于臨床研究和工業(yè)化生產(chǎn)。因此，若采用此技術(shù)開發(fā)新型腫瘤免疫靶向藥物將會(huì)產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)效益。

附圖說明

圖1：免疫靶向脂質(zhì)體的設(shè)計(jì)策略圖

圖2-1：DSPE-PEG2000-Folate的合成路線圖

圖2-2：DSPE-PEG2000-Rhamnose的合成路線圖

圖3：實(shí)施例3中所獲得的脂質(zhì)體的粒徑分布和zeta電位值

圖4：實(shí)施例3中所獲得的脂質(zhì)體靶向性測定的激光共聚焦圖

圖5：體外實(shí)驗(yàn)中實(shí)施例3所獲得的脂質(zhì)體的補(bǔ)體依賴毒性

圖6：實(shí)施例3所獲得的脂質(zhì)體在體內(nèi)小鼠實(shí)驗(yàn)中發(fā)揮的CDC效應(yīng)

具體實(shí)施方式

下面通過具體實(shí)例來詳細(xì)闡述本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出的是，以下所描述的實(shí)施例中采用的條件都不是孤立的，而是經(jīng)過反復(fù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化組合的。本發(fā)明的實(shí)施例只是作為一種示范，而不是作為本發(fā)明權(quán)利要求范圍的限制。對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言，基于本發(fā)明進(jìn)行的適當(dāng)修改或變通仍然屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

實(shí)施例1：鼠李糖偶聯(lián)的聚乙二醇二硬脂酸磷酸酰乙醇胺

精確稱量40mg RhaNBuacid，溶解于0.78ml二甲基亞砜(DMSO)，再在此溶液當(dāng)中加入27mg 1,2二硬酯酸-3磷脂酰乙醇胺－聚乙二醇－氨基(DSPE-PEG2000-NH2)和0.39ml吡啶(pyridine),接下來加入81mg二環(huán)已基碳二亞胺，室溫反應(yīng)4小時(shí)。形成霧狀后的混合液通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法去除吡啶，并加入10ml單蒸水。再通過離心收取上清，該上清用3000分子量的透析膜，50mM 2L鹽溶液透析兩次，2L去離子水透析三次，最后通過將透析物進(jìn)行凍干得到白色固體的DSPE-PEG2000-Rhamnose。合成路線如圖2-2所示。

實(shí)施例2：葉酸偶聯(lián)的聚乙二醇二硬脂酸磷酸酰乙醇胺

精確稱量79mg葉酸，溶解于2ml二甲基亞砜(DMSO)，再在此溶液當(dāng)中加入50mg 1,2二硬酯酸-3磷脂酰乙醇胺－聚乙二醇－氨基(DSPE-PEG2000-NH2)和1ml吡啶(pyridine)，接下來加入96mg二環(huán)已基碳二亞胺，室溫反應(yīng)4小時(shí)。形成霧狀后的混合液通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法去除吡啶，并加入10ml單蒸水。再通過離心收取上清，該上清1000分子量的透析膜，50mM 2L鹽溶液透析兩次，2L去離子水透析三次，最后通過將透析物進(jìn)行凍干得到黃色固體的DSPE-PEG2000-Folate。合成路線如圖2-1所示。

實(shí)施例3：免疫靶向脂質(zhì)體的制備

配制1,2-二油酰-SN-甘油-3-磷脂酰乙醇胺(DOPE)，實(shí)施例1所得鼠李糖偶聯(lián)的聚乙二醇二硬脂酸磷酸酰乙醇胺(DSPE-PEG2000-Rhamnose)，實(shí)施例2所得葉酸偶聯(lián)的聚乙二醇二硬脂酸磷酸酰乙醇胺(DSPE-PEG2000-Folate)三種成分濃度分別為0.1M,0.01M和0.001M的母液，儲(chǔ)存于-80℃。

取20μl DOPE,200μL DSPE-PEG2000-Rhamnose和2μl DSPE-PEG2000-Folate配成摩爾比為1000:1000:1的混合液(稀釋于10ml氯仿/甲醇(9/1))中，并置于250ml潔凈圓底燒瓶中，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上以60轉(zhuǎn)/分鐘的速度進(jìn)行旋干。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)時(shí)，圓底燒瓶要浸于40℃水浴中，并且旋干出現(xiàn)均勻脂質(zhì)膜以后繼續(xù)旋干。15分鐘后，圓底燒瓶離開水面，通入一股氮?dú)鈿饬骱?，將圓底燒瓶用錫箔紙進(jìn)行避光，高真空下5轉(zhuǎn)/分鐘低速旋轉(zhuǎn)過夜(一般14h)。第二天取下圓底燒瓶加入3g直徑為2mm的玻璃珠和2ml PH7.4的PBS，再次通入一股氮?dú)鈿饬骱螅哒婵障率覝乇芄庑D(zhuǎn)洗滌脂質(zhì)膜30分鐘。接著將圓底燒瓶進(jìn)行水浴超聲2分鐘后，吸出大多室脂質(zhì)體，用mini-extruder(avanti polar lipid)通過200nm多聚碳酸膜(Whatman PC membrane)來回至少11次，最終得到理想粒徑的單室脂質(zhì)體。其它比例的脂質(zhì)體，只需改變DSPE-PEG2000-Rhamnose起始旋干時(shí)的母液體積(1000:500:1為100μl,1000:2500:1為500μl)。對照脂質(zhì)體中不加入DSPE-PEG2000-Folate。

實(shí)施例4：脂質(zhì)體的粒徑和zeta電位的測定

將實(shí)施例3中所制備的脂質(zhì)體取1μl用PBS稀釋1000倍，用馬爾文激光粒度儀進(jìn)行粒徑的測定；將實(shí)施例3中所制備的脂質(zhì)體取1μl用去離子水稀釋1000倍，用馬爾文激光粒度儀進(jìn)行zeta電位測定(圖3)。

實(shí)施例5：脂質(zhì)體靶向性的測定

進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，首先將Hela細(xì)胞用含10％FBS無Folic acid 1640培養(yǎng)基傳代5次得到FR⁺Hela細(xì)胞(葉酸受體過表達(dá)Hela細(xì)胞)。FR⁺Hela以40％的匯合度鋪于24孔板中，貼壁后，用f-rha-lip,f-rha,f-lip,f-lip+rha四組脂質(zhì)體孵育6h(脂質(zhì)體的濃度用葉酸的濃度計(jì)算并且其孵育最終嘗試為10^-7M)。吸出脂質(zhì)體,PBS洗滌2次，4％多聚甲醛(PFA)室溫固定10分鐘，PBS洗滌兩次，1：200人血清中純化的鼠李糖抗體和1：200兔源葉酸受體抗體室溫孵育1h,再次用PBS洗滌兩次，1：500AF488偶聯(lián)的羊抗人抗體和1：500驢抗兔抗體室溫孵育1h，PBS洗滌兩次。最后用Hoechst33342室溫染色10分鐘，PBS洗滌兩次后，在激光共聚焦顯微鏡下觀察熒光(圖4)帶葉酸和鼠李糖的脂質(zhì)體能夠很好地靶向到葉酸受體過表達(dá)的腫瘤細(xì)胞(如FR⁺Hela,4T1)表面。

實(shí)施例6：免疫靶向脂質(zhì)體藥效的體外測定

首先培養(yǎng)FR⁺Hela細(xì)胞，以1×10⁴cells/well的密度接種于96孔板中培養(yǎng)過夜，第二天每孔中加入脂質(zhì)體孵育6小時(shí)，然后用100μl含20％人血清的無葉酸1640培養(yǎng)基替換舊培養(yǎng)基孵育2h,不加人血清的孔作為對照組，另外加入9％H₂O₂(用含20％人血清的無葉酸1640培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋)的孔作為最大殺傷力(max killing)組，最后在每孔中加入100μl Cell Titer Glo(Promega)，每組處理至少進(jìn)行3次重復(fù).室溫振蕩2分鐘誘導(dǎo)細(xì)胞裂解，繼續(xù)室溫靜止穩(wěn)定10分鐘，用Synergy H1(Bio Tek)測發(fā)光強(qiáng)度(圖5)鼠李糖靶向脂質(zhì)體能夠很好地靶向到葉酸受體過表達(dá)的腫瘤細(xì)胞(如FR⁺Hela,4T1)并有效殺傷細(xì)胞，而且殺傷力會(huì)隨著鼠李糖濃度的增加而增加。CDC％＝100％-(with human serum-max killing)/(without human serum-max killing)。

實(shí)施例7：免疫靶向脂質(zhì)體藥效的體內(nèi)測定

進(jìn)行免疫靶向脂質(zhì)體藥效的體內(nèi)測定首先將五到六周大小的BALB/c小鼠，在兩周內(nèi)每次用30μg Rhamnose-BSA免疫三次。一周后將1×10⁶小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞接種于裸鼠中成瘤。共養(yǎng)15只小鼠，平均分成三組，分別用實(shí)施例3中制備的脂質(zhì)體f-lip-rha,f-lip和PBS連續(xù)處理六周。在第十周對小鼠進(jìn)行無痛致死處理并取出腫瘤。小鼠腫瘤大小用游標(biāo)卡尺每兩周測一次(圖6)。用以下公式計(jì)算腫瘤體積：腫瘤體積＝長度×寬度²/2。

實(shí)施例8：含膽固醇的免疫靶向脂質(zhì)體的制備

具體制備工藝參照實(shí)施例3所述的實(shí)驗(yàn)參數(shù)。其中，免疫靶向脂質(zhì)體組合物包含膽固醇，組分中DOPE：膽固醇：DSPE-PEG2000-Rhamnose：DSPE-PEG2000-Folate的摩爾比為1000:1000：1000:1。最后獲得的脂質(zhì)體粒徑大小為80nm～200nm。

實(shí)施例9：含膽固醇和陽離子脂質(zhì)體DOTAP的免疫靶向脂質(zhì)體的制備

具體制備工藝參照實(shí)施例3所述的實(shí)驗(yàn)參數(shù)。其中，免疫靶向脂質(zhì)體組合物包含膽固醇和陽離子脂質(zhì)體DOTAP，組分中DOPE：膽固醇：DSPE-PEG2000-Rhamnose：DSPE-PEG2000-Folate:DOTAP的摩爾比為1000:1000：1000:1:4。最后獲得的脂質(zhì)體粒徑大小為80nm～200nm。