本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域 具體涉及一種靶向脂質(zhì)體-環(huán)二核苷酸的組成、制備方法及其在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
脂質(zhì)體(liposomes)是由脂質(zhì)雙分子層所形成的一種超微球形載體制劑，是納米載藥系統(tǒng)的典型代表。當(dāng)兩性分子如磷脂分散于水相時(shí)，分子的疏水尾部聚集在一起，親水頭部暴露在水相，形成具有雙分子層結(jié)構(gòu)的封閉囊泡( vesicles)。在囊泡內(nèi)水相和雙分子膜內(nèi)可以包裹多種不同極性的藥物。由于脂質(zhì)體的結(jié)構(gòu)類似生物膜，故又稱為人工生物膜。由天然膜成分組成的脂質(zhì)體，其脂質(zhì)體膜的雙層結(jié)構(gòu)原則上與天然細(xì)胞膜一樣。另外，脂質(zhì)體還可以由人工合成的脂質(zhì)組成，以改善它們的化學(xué)性質(zhì)和生物學(xué)性質(zhì)。
脂質(zhì)體的大小從幾十納米到幾十微米不等，按照結(jié)構(gòu)類型的不同，可以分為單室脂質(zhì)體(unilamellar vesicles)、多室脂質(zhì)體(multilamellar large vesicles，MLV)和多囊脂質(zhì)體(multivescular liposomes，MVL)。其中單室脂質(zhì)體是由一層雙分子層脂質(zhì)膜形成的囊泡，又分為小單層脂質(zhì)體(small unilamellar vesicles，SUV)和大單層脂質(zhì)體(large unilamellar vesicles，LUV)。
脂質(zhì)體作為一種藥物載體，主要有以下四個(gè)方面的優(yōu)點(diǎn)：
（1） 靶向性和淋巴定向性；（2） 緩釋作用：緩慢釋放，延緩腎排泄和代謝，從而延長(zhǎng)作用時(shí)間；（3）降低藥物毒性；（4）提高藥物穩(wěn)定性。
脂質(zhì)體因具有組織相容性、細(xì)胞親和性、靶向性和緩釋性等性質(zhì)，被廣泛地用于抗腫瘤藥物的研發(fā)中。采用聚乙二醇(PEG)及其衍生物進(jìn)行修飾，減弱脂質(zhì)體長(zhǎng)期儲(chǔ)存的聚集，增加再分散性，提高脂質(zhì)體的穩(wěn)定性。這主要是由于PEG能產(chǎn)生6nm厚度的立體位阻層，從而減弱血漿蛋白的作用和內(nèi)皮網(wǎng)狀系統(tǒng)的攝取作用，延長(zhǎng)藥效。其次PEG能夠提高膜表面親水性，降低脂質(zhì)體與單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)的親合作用。修飾后的脂質(zhì)體稱為長(zhǎng)效脂質(zhì)體或空間穩(wěn)定脂質(zhì)體。利用脂質(zhì)體表面易被修飾獲得靶向作用的特點(diǎn)，可以制備出靶向于腫瘤細(xì)胞表面上某些特定靶點(diǎn)的分子靶向脂質(zhì)體，減少肝腎蓄積毒性，提高生物利用度，使脂質(zhì)體在特定部位發(fā)揮藥效。脂質(zhì)體作為藥物載體的研發(fā)重點(diǎn)主要集中在三個(gè)方面：1.包裹抗腫瘤化療藥物，因?yàn)橹|(zhì)體可以有效降低這些化療藥物的副作用，提高藥物治療效果；2.用作蛋白質(zhì)-多肽疫苗以及DNA疫苗的載體，由于脂質(zhì)體是一種有效的免疫佐劑，作為疫苗載體可以增強(qiáng)機(jī)體的免疫反應(yīng)；3.用作核酸類藥物的載體，以脂質(zhì)體為載體進(jìn)行基因治療可以避免病毒類載體的不良反應(yīng)。
癌癥作為威脅全球人類健康和生命的第二大殺手，其高發(fā)生率和高復(fù)發(fā)率使得抗腫瘤藥物的研究成為熱點(diǎn)領(lǐng)域。大多數(shù)抗腫瘤藥物的靶向性不明顯，而且會(huì)對(duì)人體正常組織產(chǎn)生副作用，造成不可逆?zhèn)Γ绊懓┌Y的治療。脂質(zhì)體載藥系統(tǒng)由于其低毒性和可以進(jìn)行靶向性等特性受到了廣泛關(guān)注。目前國(guó)內(nèi)外已經(jīng)有許多種脂質(zhì)體藥物已經(jīng)被批準(zhǔn)上市或進(jìn)行臨床研究來(lái)進(jìn)行癌癥治療。
分子靶向脂質(zhì)體是在脂質(zhì)體表面連接上某種分子配體，該配體能夠特異性識(shí)別腫瘤細(xì)胞表面的某種受體，使脂質(zhì)體藥物能夠富集到靶細(xì)胞，減少對(duì)正常細(xì)胞的傷害。適當(dāng)?shù)陌邢蚺潴w能夠提高藥物的生物利用度。按照配體的類型，分子靶向脂質(zhì)體可分為抗體靶向型脂質(zhì)體和非抗體靶向型脂質(zhì)體。
抗體靶向脂質(zhì)體又稱為免疫脂質(zhì)體(immunoliposomes, ILs)，通常將單克隆抗體或抗體的抗原結(jié)合片段(fragment of antigen binding, Fab)共價(jià)結(jié)合到載藥的脂質(zhì)體表面，依靠抗體與靶細(xì)胞表面的抗原或受體的識(shí)別作用，將藥物運(yùn)送到特殊部位。作為一種新型藥物載體，免疫脂質(zhì)體具有很多優(yōu)勢(shì)，包括對(duì)腫瘤靶細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的選擇性殺傷作用，且殺傷活性比游離藥物、非特異抗體脂質(zhì)體、單獨(dú)單抗等更強(qiáng)；在荷瘤動(dòng)物體內(nèi)呈特異性分布，腫瘤病灶藥物濃度升高，藥物毒副作用較??；體內(nèi)循環(huán)半衰期長(zhǎng)及運(yùn)載藥物量大等。目前已有多種抗體靶向脂質(zhì)體處于研究階段。
由于腫瘤細(xì)胞周?chē)h(huán)境的改變，腫瘤細(xì)胞表面會(huì)過(guò)度表達(dá)一些受體，而正常細(xì)胞表面不表達(dá)或低表達(dá)這些受體，因此可以在脂質(zhì)體表面連接這些受體的靶向配體，發(fā)揮其特異性識(shí)別靶向作用。非抗體靶向型脂質(zhì)體的常見(jiàn)配體有葉酸、轉(zhuǎn)鐵蛋白、多肽和糖類等，本發(fā)明專利屬于非抗體靶向型脂質(zhì)體，脂質(zhì)體鏈接的靶向配體是葉酸。
在感染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中微生物和病毒DNA能通過(guò)刺激干擾素分泌誘導(dǎo)內(nèi)源強(qiáng)有力的免疫應(yīng)答。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）受體蛋白（STING）對(duì)胞質(zhì)DNA的免疫應(yīng)答是必需的因素。最近的研究表明，環(huán)化cGMP-AMP二核苷酸合成酶（cGAS）在結(jié)合DNA后的活化條件下，內(nèi)源性地催化cGAMP的合成。cGAMP是一種胞質(zhì)DNA傳感器，它作為第二信使通過(guò)STING刺激INF-β的感應(yīng)，介導(dǎo)TBK1和IRF-3的活化，進(jìn)而啟動(dòng)INF-β基因的轉(zhuǎn)錄。最近報(bào)道，重組cGAS在DNA結(jié)合條件下催化環(huán)化cGMP-AMP二核苷酸GAMP。cGAS結(jié)合雙鏈dsDNA的復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)也已被報(bào)道，cGAMP結(jié)合STING，使轉(zhuǎn)錄因子IRF3激活并產(chǎn)生β干擾素。
環(huán)二核苷酸合成酶(cGAS)是先天性免疫通路中重要的細(xì)胞質(zhì)DNA感受器。cGAMP作為二級(jí)信使分子通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的STING蛋白通路誘導(dǎo)干擾素IFN-β和其他細(xì)胞因子的產(chǎn)生，調(diào)節(jié)下游蛋白質(zhì)表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)停滯和凋亡，產(chǎn)生抗病毒效應(yīng)。STING通路可以調(diào)節(jié)免疫原性腫瘤的先天免疫識(shí)別，促進(jìn)干擾素的抗腫瘤作用。IFN-γ在體內(nèi)通過(guò)TRAIL(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand)發(fā)揮抗腫瘤作用，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。cGAMP是cGAS-cGAMP-STING-IRF3介導(dǎo)的先天免疫反應(yīng)的關(guān)鍵刺激物，是STING的內(nèi)源性激活劑，因此，cGAMP具有促進(jìn)抗腫瘤免疫應(yīng)答的作用。
STING是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的跨膜蛋白，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上具有一種ENPP1的水解酶。在細(xì)胞質(zhì)中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)ENPP1活性。相反，它被發(fā)現(xiàn)在肝細(xì)胞中的質(zhì)膜的基底側(cè)表面上和肝臟的粗糙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)部分。其催化結(jié)構(gòu)域駐留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)空腔中，且需要高濃度鈣離子供其活動(dòng)。ENPP1水解酶可以降解2’3’-cGAMP。實(shí)驗(yàn)顯示2’3’-cGAMP是良好的重組ENPP1的底物。因此，用脂質(zhì)體包裹c(diǎn)GAMP可以抑制其與ENPP1水解酶的接觸，延長(zhǎng)其代謝時(shí)間，提高藥效。脂質(zhì)體具有免疫佐劑的作用，可以進(jìn)行腫瘤細(xì)胞靶向，提高藥物利用率， 因此，靶向脂質(zhì)體包含的cGAMP具有制備抗腫瘤藥物的優(yōu)勢(shì)和潛在應(yīng)用。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供靶向脂質(zhì)體-環(huán)二核苷酸cGAMP的組成、制備方法及其在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。該靶向脂質(zhì)體包裹的環(huán)二核苷酸cGAMP藥物，具有靶向遞送、增強(qiáng)細(xì)胞滲透性、延長(zhǎng)藥物代謝周期，提高藥物利用率。由于脂質(zhì)體具有免疫佐劑的作用，靶向脂質(zhì)體-環(huán)二核苷酸cGAMP具有更好的免疫抗腫瘤藥效。
本發(fā)明制備的靶向脂質(zhì)體-環(huán)二核苷酸的組成包括：卵磷脂（lipoid EPCs）、膽固醇（CH）、 二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇（DSPE-PEG2000）和二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇-葉酸（DSPE-PEG-Folic Acid）組成的靶向脂質(zhì)體，該脂質(zhì)體包裹環(huán)二核苷酸cGAMP（或cGAMP的衍生物）。靶向脂質(zhì)體-環(huán)二核苷酸cGAMP（或cGAMP的衍生物）的制備方法包括逆向蒸發(fā)法和硫酸銨梯度法。
本發(fā)明實(shí)驗(yàn)研究表明，靶向脂質(zhì)體包裹的環(huán)二核苷酸cGAMP可以抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，具有明顯的抗腫瘤作用，抗腫瘤藥效明顯優(yōu)于cGAMP單獨(dú)用藥，可用于制備抗腫瘤藥物。
本發(fā)明還涉及利用靶向脂質(zhì)體包裹的環(huán)二核苷酸cGAMP所制備的抗腫瘤藥。所述的腫瘤包括但不限于肺癌、胃癌、結(jié)腸直腸癌、黑色素瘤、卵巢癌等。
本發(fā)明所述的靶向脂質(zhì)體包括但不限于由卵磷脂（lipoid EPCs）、膽固醇（CH）、 二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇（DSPE-PEG2000）和二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇-葉酸（DSPE-PEG-Folic Acid）組成的靶向脂質(zhì)體。
本發(fā)明所述的環(huán)二核苷酸，指的是2’3’-cGAMP或 Cyclic [G(2’,5’)pA(3’,5’)p]，但不限于2’3’-cGAMP，包括cGAMP的衍生物。
本發(fā)明所用的靶向脂質(zhì)體包裹的環(huán)二核苷酸cGAMP緩釋抗腫瘤藥物能夠延長(zhǎng)cGAMP代謝周期，增強(qiáng)抗腫瘤治療效果，優(yōu)于單獨(dú)使用cGAMP抗腫瘤治療效果。
具體實(shí)施方式
下面通過(guò)實(shí)施例具體說(shuō)明本發(fā)明的內(nèi)容。在本發(fā)明中，以下所述的實(shí)施例是為了更好地闡述本發(fā)明，并不是用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1：靶向脂質(zhì)體-cGAMP的組成和制備方法
通過(guò)逆向蒸發(fā)法和硫酸銨梯度法分別制備包裹c(diǎn)GAMP藥物的靶向脂質(zhì)體，并對(duì)其進(jìn)行性質(zhì)表征。
1、脂質(zhì)體原料：卵磷脂（lipoid EPCs）、膽固醇（CH）、 二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇（DSPE-PEG2000）和二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇-葉酸（DSPE-PEG-Folic Acid），均購(gòu)買(mǎi)自西安瑞禧生物科技有限公司。
2、脂質(zhì)體制備方法
（1）逆向蒸發(fā)法
（A）磷脂膜材溶解于有機(jī)溶劑三氯甲烷中，磷脂膜材比例為：
EPC : CH : DSPE-PEG2000 : DSPE-PEG2000-FA = 10 : 10 : 1 : 0.01 （molar ratio）；形成有機(jī)相溶液。
（B）cGAMP藥物溶解于超純水中，形成水相溶液。
（C）有機(jī)相磷脂溶夜 ：水相cGAMP溶夜=3:1（V ：V），cGAMP : 磷脂膜材總量 =1:10，將藥物水溶液加入到磷脂有機(jī)相溶液中。
（D）探頭超聲，功率200W，20分鐘（超聲5秒，停3秒），形成穩(wěn)定的W/O型乳劑。
（E）真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑（水浴45℃，轉(zhuǎn)速90rpm）。
（F）將所得的脂質(zhì)體溶液進(jìn)行水浴超聲，減小粒徑。
（G）用超濾管（MWCO=3000Da）超濾除去未包封藥物。
(2) 硫酸銨梯度法
（A）磷脂膜材溶解于有機(jī)溶劑三氯甲烷中，磷脂膜材比例為
EPC : CH : DSPE-PEG2000 : DSPE-PEG2000-FA = 10 : 10 : 1 : 0.01 （molar ratio）；
（B）將磷脂溶液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜（水浴溫度35℃，轉(zhuǎn)速90rpm，真空度0.09Mpa），后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)掉有機(jī)溶劑；
（C）向磷脂膜中加入120mmol/L的硫酸銨溶液，振搖（120rpm、5分鐘）形成空白脂質(zhì)體溶液。
（D）將空白脂質(zhì)體溶液在超純水中透析過(guò)夜。
（E）cGAMP溶解于超純水中，加入到空白脂質(zhì)體溶液中，65℃孵育20分鐘；
（F）水浴超聲減小粒徑；
（G）用超濾管（MWCO=3000Da）超濾除去未包封藥物。
3、靶向脂質(zhì)體-cGAMP的表征
（1）粒徑表征
利用動(dòng)態(tài)光散射 （Dynamic Light Scattering，DLS）測(cè)量脂質(zhì)體的粒徑和粒徑分布（PDI）。其基本原理為微小粒子懸浮在液體中會(huì)無(wú)規(guī)則地運(yùn)動(dòng)（布朗運(yùn)動(dòng)），光通過(guò)膠體時(shí)，粒子會(huì)將光散射，在一定角度下可以檢測(cè)到光信號(hào)。大顆粒運(yùn)動(dòng)緩慢，散射光斑的強(qiáng)度也將緩慢波動(dòng)；小粒子運(yùn)動(dòng)快速，散射光斑的密度也將快速波動(dòng)，最后通過(guò)光強(qiáng)波動(dòng)變化和光強(qiáng)相關(guān)函數(shù)計(jì)算出粒徑及其分布。PDI表示粒徑的均一度，是方差的概念。所制備的脂質(zhì)體粒徑約100 nm左右，PDI=0.426。
（2）Zeta電位
Zeta電位是連續(xù)相與附著在分散粒子上的流體穩(wěn)定層之間的電勢(shì)差。一般用來(lái)評(píng)價(jià)或預(yù)測(cè)微粒分散體系的物理穩(wěn)定性,一般Zeta電位絕對(duì)值越高,其粒子間的靜電斥力也就越大,物理穩(wěn)定性也就越好。一般Zeta電位絕對(duì)值達(dá)到30mV就認(rèn)為體系比較穩(wěn)定。本發(fā)明制備的脂質(zhì)體Zeta 電位絕對(duì)值為29.5 mV，較為穩(wěn)定。
（3）包封率
將靶向脂質(zhì)體與游離cGAMP藥物分離，通過(guò)紫外分光光度計(jì)作標(biāo)準(zhǔn)曲線法,測(cè)定游離的cGAMP藥物量，計(jì)算脂質(zhì)體包封率：EE(％)=(1一Cf／Ct)×100％。其中：EE—cGAMP脂質(zhì)體包封率；Cf一游離cGAMP含量；Ct一總cGAMP含量。根據(jù)計(jì)算，利用逆向蒸發(fā)法制備的脂質(zhì)體包封率在60%左右，利用硫酸銨梯度法制備的脂質(zhì)體包封率在75%以上。
實(shí)施例2：cGAMP的制備
cGAMP （環(huán)化-GMP-AMP）按文獻(xiàn)方法在結(jié)合DNA后的活化條件下，由環(huán)化cGMP-AMP二核苷酸合成酶（cGAS）催化合成。純度在98％以上。（Li P.W，et al., Immunity, 2013, 39(6), 1019-1031.）
實(shí)施例3：采用荷瘤鼠模型進(jìn)行檢測(cè)脂質(zhì)體包裹的cGAMP緩釋藥物的抗腫瘤作用即對(duì)動(dòng)物皮下移植瘤生長(zhǎng)的抑制作用。
動(dòng)物
種屬、品系、性別、體重、來(lái)源、合格證
BALB/c普通小鼠、C57/BL6普通小鼠，雄性，體重16-18g，6-8周齡， SPF級(jí)，購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：SCXK （滬）2007-0005 ] 。
飼養(yǎng)條件
所有小鼠均自由覓食和飲水，在室溫（23±2）℃下飼養(yǎng)于中國(guó)人民解放軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。飼料及水均經(jīng)高壓滅菌處理，全部實(shí)驗(yàn)飼養(yǎng)過(guò)程為SPF級(jí)。
劑量設(shè)置
靜脈注射小鼠，設(shè)置1個(gè)劑量組：10 mg/kg
試驗(yàn)對(duì)照
陰性對(duì)照：生理鹽水溶液
陽(yáng)性對(duì)照：cGAMP，劑量10mg/kg
給藥方法
給藥途徑：尾靜脈注射給藥
給藥體積：100 微升/只
給藥次數(shù)：每天1次，連續(xù)21天
每組動(dòng)物數(shù)：10只
腫瘤細(xì)胞株
小鼠結(jié)直腸癌細(xì)胞株CT26，小鼠肺癌Lewis瘤株 LL/2，人卵巢癌細(xì)胞株SK-OV-3，人黑色素瘤細(xì)胞株A375，人胃癌細(xì)胞株MNK-45均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。
試驗(yàn)主要步驟
1．腫瘤模型鼠的建立與干預(yù)
細(xì)胞培養(yǎng)，傳代，在細(xì)胞對(duì)數(shù)期收集細(xì)胞，做成濃度為(1.0×107)每毫升的細(xì)胞懸液，小鼠右前肢腋下注射0.2 ml細(xì)胞懸液(細(xì)胞數(shù)目為2.0×106個(gè)/只)，10 天左右腫瘤長(zhǎng)至直徑約5 mm，致瘤成功，隨機(jī)均分為3組。分別為A：陰性對(duì)照組（靜脈注射生理鹽水組）； B：cGAMP組(靜脈注射cGAMP)10mg/kg;C：靶向脂質(zhì)體-cGAMP組(靜脈注射脂質(zhì)體-cGAMP)10mg/kg。每天給藥1次，連續(xù)給藥21天。21天后，處死小鼠并稱瘤體重量，抑瘤率=[1-實(shí)驗(yàn)組平均瘤重(B、C組) ／A組平均瘤重)]×100％。
分別制備皮下移植瘤模型：小鼠結(jié)直腸癌細(xì)胞株CT26，移植到BalB/C普通小鼠；小鼠肺癌Lewis瘤株 LL/2，移植到C57/BL6小鼠，觀察抗腫瘤效果。
2．統(tǒng)計(jì)分析
數(shù)據(jù)用x±s表示，利用SPSS10.0軟件進(jìn)行處理，采用單因素方差分析（one-way ANOVA）檢驗(yàn)比較各組瘤重差異的顯著性，顯著性水平a=0.05。
結(jié)果
小鼠皮下接種腫瘤細(xì)胞后制備成功皮下移植瘤模型，靶向脂質(zhì)體-cGAMP和cGAMP均可明顯抑制腫瘤生長(zhǎng)，給藥21天后的瘤重均顯著低于陰性對(duì)照組（P<0.05 ，P<0.01），靶向脂質(zhì)體-cGAMP優(yōu)于cGAMP單獨(dú)用藥，表明靶向脂質(zhì)體-cGAMP具有更優(yōu)的抗腫瘤作用。具體結(jié)果表1-表5：
表1、脂質(zhì)體-cGAMP對(duì)BalB/C小鼠結(jié)直腸癌細(xì)胞CT26皮下移植瘤的作用
（n=10，mean±SD）
組別 平均瘤重（g） 平均抑瘤率（%）
陰性對(duì)照組 2.266±0.244 （g） -
cGAMP組 0.748±0.182 （g）** 67.0
脂質(zhì)體-cGAMP組 0.428±0.154 （g）** 81.0
注：*P<0.05 vs 陰性對(duì)照組；**P<0.01 vs 陰性對(duì)照組.
表2、脂質(zhì)體-cGAMP對(duì)C57小鼠肺癌Lewis瘤株 LL-2皮下移植瘤的作用
（n=10，mean±SD）
組別 平均瘤重（g） 平均抑瘤率（%）
陰性對(duì)照組 2.640±0.378 （g） -
cGAMP組 0.782±0.245 （g）** 70.4
脂質(zhì)體-cGAMP組 0.505±0.128 （g）** 80.8
注：*P<0.05 vs 陰性對(duì)照組；**P<0.01 vs 陰性對(duì)照組.
表3、 脂質(zhì)體-cGAMP對(duì)人黑色素瘤細(xì)胞株A375鼠皮下移植瘤的作用
（n=10，mean±SD）
組別 平均瘤重（g） 平均抑瘤率（%）
陰性對(duì)照組 2.680±0.368 （g） -
cGAMP組 0.768±0.254 （g）** 71.3
脂質(zhì)體-cGAMP組 0.498±0.135 （g）** 81.4
注：*P<0.05 vs 陰性對(duì)照組；**P<0.01 vs 陰性對(duì)照組.
表4、 脂質(zhì)體-cGAMP對(duì)人胃癌細(xì)胞株MNK-45鼠皮下移植瘤的作用
（n=10，mean±SD）
組別 平均瘤重（g） 平均抑瘤率（%）
陰性對(duì)照組 2.668±0.382 （g） -
cGAMP組 0.786±0.265 （g）** 70.5
脂質(zhì)體-cGAMP組 0.510±0.128 （g）** 80.8
注：*P<0.05 vs 陰性對(duì)照組；**P<0.01 vs 陰性對(duì)照組.
表5、 脂質(zhì)體-cGAMP對(duì)人卵巢癌細(xì)胞株SK-OV-3鼠皮下移植瘤的作用
（n=10，mean±SD）
組別 平均瘤重（g） 平均抑瘤率（%）
陰性對(duì)照組 2.728±0.336 （g） -
cGAMP組 0.769±0.258 （g）** 71.8
脂質(zhì)體-cGAMP組 0.509±0.156 （g）** 81.3
注：*P<0.05 vs 陰性對(duì)照組；**P<0.01 vs 陰性對(duì)照組.
實(shí)施例3 脂質(zhì)體-cGAMP的急性毒性研究
實(shí)驗(yàn)材料
ICR 小鼠20 只（購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：SCXK （滬）2007-0005 ] ），雌雄各半，體重18～22g，動(dòng)物以顆粒飼料喂養(yǎng)，自由攝食和飲水。
脂質(zhì)體-cGAMP由實(shí)施例1制備，用生理鹽水配制成濃度為200mg/mL 的溶液。
實(shí)驗(yàn)方法
ICR小鼠按體重單次尾靜脈注射2g/kg 的脂質(zhì)體-cGAMP緩釋藥物，觀察給藥后小鼠14天內(nèi)的毒性反應(yīng)及死亡情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小鼠單次尾靜脈注射給藥后，小鼠活動(dòng)正常。給藥后14天內(nèi)，小鼠未出現(xiàn)死亡，第15天，全部小鼠處死，解剖，肉眼檢查各臟器，均未見(jiàn)明顯病變。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
上述急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，靜脈注射給藥最大耐受量MTD 不低于2 g/Kg，說(shuō)明脂質(zhì)體-cGAMP藥物的急性毒性低。