一種DNMT3A基因檢測的方法與流程

文檔序號：11936983閱讀：1351來源：國知局

導(dǎo)航： X技術(shù)> 最新專利>有機(jī)化合物處理,合成應(yīng)用技術(shù)

本發(fā)明涉及基因檢測領(lǐng)域，尤其涉及一種DNMT3A基因檢測的方法。

背景技術(shù)：

惡性血液病包括急慢性白血病、惡性淋巴瘤、骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndrome，MDS)、多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)和骨髓增殖性腫瘤(myeloproliferative neoplasms,MPN)等，發(fā)病率成逐年上升趨勢，嚴(yán)重危害人類的健康。

尤其是白血病，在我國各年齡組惡性腫瘤的死亡率中分別占第6位(男性)和第8位(女性)，在兒童及35歲以下成人中居第一位研究顯示，惡性血液病的發(fā)生、發(fā)展、演變及預(yù)后均與基因的異常變化相關(guān)。

隨著人類基因組計(jì)劃(human genome project，HGP)的實(shí)施和完成，一門重要的新生學(xué)利——基因組學(xué)應(yīng)運(yùn)而生。它主要研究生物體內(nèi)全部基因的分子特征，而腫瘤基因組學(xué)是其研究的重要內(nèi)容。2005年12月13日，美國宣布啟動(dòng)“腫瘤基因組計(jì)劃”，研究人員初步發(fā)現(xiàn)，每一個(gè)腫瘤都有自己獨(dú)特的基因組藍(lán)圖。每個(gè)腫瘤的發(fā)生都是多種基因變化的積累和多個(gè)腫瘤相關(guān)基因協(xié)同作用的結(jié)果，一個(gè)基因的改變只是完成其中的一個(gè)步驟，往往還需要經(jīng)過不同腫瘤相關(guān)基因的激活與失活的多階段演變。而“腫瘤基因組計(jì)劃”的目的是破譯癌癥密碼，建立一個(gè)共享數(shù)據(jù)庫，造福于人類健康。

最近研究發(fā)現(xiàn)，惡性血液病的患者DNMT3A基因發(fā)生了突變，為此，我們研究了一種DNMT3A基因檢測的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種DNMT3A基因檢測的方法，包括的步驟有：基因組DNA的提取、DNA產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測、PCR反應(yīng)擴(kuò)增DNMT3A基因、PCR產(chǎn)物測序、結(jié)果判定。

(一)基因組DNA的提取

1.試劑準(zhǔn)備：

1)在蛋白酶K粉中加入3.3ml純凈去離子水，震蕩溶解，室溫下，靜置30分鐘以上，待徹底溶解后分裝，于4℃保存?zhèn)溆茫?/p>

2)將160ml無水乙醇加入洗滌液中混勻備用；

3)檢查細(xì)胞裂解液，如果里面有沉淀可37℃溫育，使其徹底溶解，冷至室溫后備用；

2.抽取患者外周血約2ml，EDTA抗凝，按以下步驟提取基因組DNA：

1)取1.5ml離心管，并加250μl細(xì)胞裂解液到離心管中；

2)加200μl抗凝全血到細(xì)胞裂解液中，用移液器來回吸注幾次，以徹底溶解殘留在吸頭上的血液，且充分混合以確保完全釋放基因組DNA；

3)每管加30μl蛋白酶K，旋滿振蕩混勻15S，室溫下5000rpm瞬時(shí)離心，再56℃孵育約3分鐘，根據(jù)血細(xì)胞裂解情況可適當(dāng)延長至5分鐘，裂解完全應(yīng)為褐色；

4)在上述裂解完全的混合液中加入250ul無水乙醇，上下顛倒幾次后放在旋禍振蕩器上震蕩15秒，室溫下5000rpm瞬時(shí)離心；

5)將過濾離心柱置于1.5ml收集管(試劑盒內(nèi)提供)中，再將步驟4)中所得混合液轉(zhuǎn)入過濾離心柱中，室溫下8000rpm離心1分鐘；

6)丟棄含廢液的收集管，將過濾離心柱置于一個(gè)新的1.5ml收集管中，并

在離心柱中加入750ul洗滌液，室溫下8000rpm離心1分鐘；

7)重復(fù)上一步；

8)將洗脫液置恒溫金屬浴上預(yù)熱到65℃以提高洗脫效率；

9)丟棄含廢液的1.5ml收集管，將過濾離心柱置于另一潔凈的1.5ml離心管中，在離心柱中央加入200ul預(yù)熱的洗脫液，室溫靜置2-3分鐘；8000rpm離心1分鐘洗脫基因組DNA；

10)將離心管蓋好，-20℃保存?zhèn)溆茫?/p>

(二)DNA產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測

1.膠液的制備：

稱取0.5g瓊脂糖于錐形瓶中，加入100rnL0.5xTAE電泳緩沖液，在微波爐中加熱至煮沸使瓊脂糖顆粒完全溶解至溶液透明，此時(shí)瓊脂糖凝膠濃度為0.5％；

2.膠板的制備：

1)用膠帶將洗凈、干燥的制膠板兩端封好，水平放置在工作臺上，調(diào)整好梳子的高度；調(diào)節(jié)梳子與底板間的距離約1mm，和擋板平行安放；

2)向冷卻至45-50攝氏度的瓊脂糖凝膠液中放入漠化乙錠(ethidhimbromide,EB)，輕輕搖勾使其終濃度為0.5ng/mL；然后用溶化的凝膠將膠帶內(nèi)側(cè)封嚴(yán)；

3)將瓊脂糖凝膠小心倒入制膠板中，使膠液緩慢展幵，直到整個(gè)制膠板表面形成均勻膠層，一般厚度5mm左右，注意不要有氣泡；

4)室溫靜置約一小時(shí)，待膠充分凝固后拔出梳子備用，注意不要損傷梳子底部的凝膠；

5)將制膠板連同膠一起放入電泳槽，加IxTAE電泳緩沖液至浸沒膠約1mm左右；

3.點(diǎn)樣：

將電泳樣品與溴酚藍(lán)按6:1比例混合均勻后，用微量移液器將樣品依次點(diǎn)入加樣孔中；注意要及時(shí)更換Tip頭，避免損壞凝膠或?qū)⒛z底部刺穿；

4.電泳：

點(diǎn)樣完成后，蓋上電泳槽蓋，接通電源，采用3V/cm的電壓；當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑電泳條帶在凝膠的中下段時(shí)，停止電泳；

5.觀察結(jié)果：

用紫外凝膠成像儀觀察電泳膠板，并記錄結(jié)果，在23000bp處出現(xiàn)較亮條帶的即為提取成功，可繼續(xù)進(jìn)行下一步PCR反應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小為845bp，擴(kuò)增完成后，取2ul產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測；

6.PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳：

按照以上DNA產(chǎn)物瓊脂糖檢測的方法制備膠液，此時(shí)瓊脂糖凝膠溶液濃度應(yīng)為1％、制備膠板、點(diǎn)樣和電泳；在紫外燈下觀察結(jié)果顯示：樣本在約845bp處出現(xiàn)較亮的DNA擴(kuò)增條帶，用紫外凝膠成像儀拍照并保存結(jié)果；

(三)PCR反應(yīng)擴(kuò)增DNMT3A基因

1、目的基因的選擇及引物合成：

針對DNMT3A基因突變熱點(diǎn)，第882位精氨酸殘基密碼子(R882)位點(diǎn)設(shè)計(jì)合成引物，上游引物：AGGAGTTGGTGGGTGTGAGT；下游引物：TGCTCCTATCTGATCAGGCT；加TE緩沖液稀釋至50pmol/ul，-20℃保存；進(jìn)行PCR反應(yīng)前需要將TE緩沖液進(jìn)一步稀釋至10pmol/ul；

2.PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件：

反應(yīng)體系總體積為20μl，包括如下：

反應(yīng)條件如下，循環(huán)35次：

3.PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳：

擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小為845bp，擴(kuò)增完成后，取2ul產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測；按照以上DNA產(chǎn)物瓊脂糖檢測的方法制備膠液，此時(shí)瓊脂糖凝膠溶液濃度應(yīng)為1％，制備膠板、點(diǎn)樣和電泳；在紫外燈下觀察結(jié)果顯示：幾乎所有樣本均在約845bp處出現(xiàn)較亮的DNA擴(kuò)增條帶，用紫外凝膠成像儀拍照并保存結(jié)果；

(四)PCR產(chǎn)物測序

PCR擴(kuò)增完成后，將產(chǎn)物-20℃凍存?zhèn)溆?，用DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行產(chǎn)物純化，用ABI3730測序儀和BigDyeTerminators試劑盒進(jìn)行DNA測序，以Sanger雙脫氧鏈終止法進(jìn)行；

(五)結(jié)果判定

將DNA測序結(jié)果用Chrosmas軟件進(jìn)行分析，并與DNA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源比較，其基因序列號為：NG_029465.1，判斷各患者中有無DNMT3A基因突變，如果發(fā)現(xiàn)，則初步判定為患有惡性血液病。

進(jìn)一步，所述的紫外燈為臺式三用紫外分析儀。

進(jìn)一步，所述的離心是采用低速自動(dòng)平衡離心機(jī)或高速離心機(jī)進(jìn)行。

本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明所述的一種DNMT3A基因檢測的方法，使用方便，檢測準(zhǔn)確率高，用此方法檢查惡心血液病，可以減輕患者檢測中所受的痛苦。

具體實(shí)施方式

以下將結(jié)合本發(fā)明的實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)敘述。

一種DNMT3A基因檢測的方法，包括如下步驟：