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一種poolfq-pcr聯(lián)合檢測(cè)腫瘤耐藥基因的方法及其試劑盒的制作方法

文檔序號(hào):581704閱讀:764來源:國(guó)知局
專利名稱:一種pool fq-pcr聯(lián)合檢測(cè)腫瘤耐藥基因的方法及其試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于核酸診斷領(lǐng)域,涉及腫瘤多藥耐藥(multidrug resistance, MDR)基 因MDR、MRP1、MRP2、MRP4、LRP、BCRP和GSTs的基因檢測(cè)的方法,特別是涉及使用一種Pool FQ-PCR(小池-熒光PCR)的方法對(duì)腫瘤多藥耐藥(multidrug resistance,MDR)基因進(jìn)行 檢測(cè),該方法進(jìn)一步涉及一種檢測(cè)試劑盒,用于檢測(cè)腫瘤患者組織、血樣等樣本中多藥耐藥 基因mRNA,用于對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥的輔助診斷及其病人藥物治療的療效監(jiān)控。
背景技術(shù)
腫瘤細(xì)胞多藥耐藥性(multidrug resistance,MDR)是造成化療失敗的重要原因, 耐藥的機(jī)制雖有很多,但總結(jié)起來不外乎是腫瘤細(xì)胞內(nèi)各種耐藥相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和酶類量的 改變。而這種量的改變是由編碼這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和酶類的耐藥相關(guān)基因過度表達(dá)或表達(dá)下調(diào) 造成的。腫瘤細(xì)胞在受到一定的抗腫瘤藥作用后,甚至在抗腫瘤藥物作用之前產(chǎn)生了針對(duì) 這種藥物及相關(guān)藥物,甚至無關(guān)藥物的抗性,稱為多藥耐藥性。狹義的多藥耐藥性是指由 于MDRl基因表達(dá)的P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)及其MDR相關(guān)蛋白(MDR-related protein, MRP)的表達(dá)而產(chǎn)生的抗藥性。而廣義的多藥耐藥則是指由于MDR、MRP、LRP、TAP、 BRCP基因表達(dá)以及谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)基因、拓?fù)洚悩?gòu)酶(Τ0Ρ0)基因、熱休克蛋白 (HSP)基因、蛋白激酶 C(PKC)基因、癌基因(c-Ha-ras、bcl-2、bcr-abl、erbB-2、fos、jun、 MDM-2等)、細(xì)胞因子(IL-6、TGFi3、IGF-2等)、抗氧化相關(guān)基因、DNA修復(fù)基因以及各種化 療藥物代謝相關(guān)基因的表達(dá)引起的對(duì)于抗腫瘤化療藥物的抗性。1.MDR 基因MDR基因是研究最早的耐藥相關(guān)基因,人類基因組有兩種已知的MDR基因MDR1和 MDR3。兩者均定位于染色體7q21. 1,且編碼的蛋白質(zhì)有80%同源。MDRl基因編碼轉(zhuǎn)運(yùn)蛋 白并呈現(xiàn)多藥耐藥表型。MDR轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白中研究最深入的是P-gp,它是由MDRl基因編碼的分子量為170kDa 的跨膜性糖蛋白。P-gp分子可以分為氨基酸順序幾乎相等的兩部分,12個(gè)疏水性氨基酸在 膜內(nèi)排列成6對(duì),使P-gp嵌于膜內(nèi),在膜外側(cè)的部分連接糖基,在膜內(nèi)側(cè)親水區(qū)有兩個(gè)核苷 酸結(jié)合位點(diǎn),屬于轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族,即ABC (ATP binding cassette family)家族。P_gp的 跨膜結(jié)構(gòu)具有通道蛋白的特性,具有能量依賴性藥泵的功能。P-gp與抗腫瘤藥物結(jié)合,同時(shí) 在其核苷酸結(jié)合位點(diǎn)上結(jié)合ATP,ATP水解后所釋放的能量使藥物轉(zhuǎn)出細(xì)胞外,結(jié)果使藥物 濃度下降,其細(xì)胞毒作用因而減弱或完全喪失,細(xì)胞由此產(chǎn)生耐藥性,此為經(jīng)典的多藥耐藥 途徑。惡性腫瘤細(xì)胞P-gp表達(dá)上調(diào)的機(jī)制還不十分清楚,MDRl基因表達(dá)水平的提高主 要是轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)的升高。對(duì)蛋白激酶C具有激活作用的因子可以誘導(dǎo)MDRl基因的表達(dá)。 對(duì)于MDRl基因啟動(dòng)子基因區(qū)的序列和結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)有一段高度保守的DNA序列可與熱休克蛋白結(jié)合稱之為熱休克元件(HSE,heat shock element),提示MDRl基因的表達(dá)水 平可能會(huì)受到熱休克蛋白的調(diào)節(jié)。還有研究顯示細(xì)胞因子、腫瘤抑制基因P53及其突變體 對(duì)MDRl基因的表達(dá)也具有一定的調(diào)節(jié)作用,而且還具有細(xì)胞種類的特異性。2. MRP 基因自從第一個(gè)MRP基因,即MRPl被分離以來,其余幾種同源基因也相繼被發(fā)現(xiàn), 包括 MRP2 (cMOAT)、MRP3、MRP4、MRP5、MRP6、MRP7、MRP8、MRP9 禾口 MRP10。MRP 位于染色體 16pl3. 12-pl3,編碼一種具有1522個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì),此蛋白質(zhì)被稱為多藥耐藥相關(guān)蛋 白。其分子量為190kDa,故又被稱為P-190。與P_gp相似,MRP上有ATP結(jié)合位點(diǎn),兩者同 屬于ATP依賴性跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白類,即ABC超家族的成員。不過P-gp與MRP又有許多不同 之處P_gp主要分布于胞膜,而MRP則分布于胞膜和質(zhì)膜;P-gp是將胞內(nèi)藥物排出胞外,降 低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度,而MRP除部分將藥物排出胞外之外,還使胞內(nèi)藥物重新分布,從而呈現(xiàn) MDR表型。MRP主要作為一種谷胱甘肽偶聯(lián)物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,降低細(xì)胞內(nèi)GSH濃度會(huì)影響MRP介導(dǎo) 的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)。除了化療藥物外,MRP還可轉(zhuǎn)運(yùn)半胱氨酰白三烯(尤其是LTC4)、谷胱甘肽和 葡萄糖醛酸偶聯(lián)物(包括類固醇、前列腺素A2、膽鹽衍生物和黃曲霉毒素Bi)。但GSH并不 是必需與藥物偶聯(lián)轉(zhuǎn)運(yùn)才能進(jìn)行,而可能是與藥物一起聯(lián)合轉(zhuǎn)運(yùn)的,Mariska等認(rèn)為多肽才 是MRP跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的底物。最近Gupta等發(fā)現(xiàn)MRP可能參與轉(zhuǎn)運(yùn)像成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子這樣 分子量達(dá)16,000大小的蛋白質(zhì)。3. LRP 基因該基因定位于染色體16p,全長(zhǎng)^88bp,編碼896個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì),相對(duì)分子量 IlOkDa,此蛋白質(zhì)被命名為肺耐藥相關(guān)蛋白(Lung resistance-relatedprotein)。LRP不 是一種ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,沒有跨膜結(jié)構(gòu)域和ATP結(jié)合位點(diǎn)。LRP與鼠編碼的主要穹隆體蛋白 (major vault protein,MVP),有81 %的同源性,推測(cè)LRP可能是人類的MVP。穹隆體為一 細(xì)胞器,可能參與胞質(zhì)中囊泡的運(yùn)輸及核質(zhì)物質(zhì)的運(yùn)輸。LRP可能通過兩種機(jī)制引起MDR: 一方面使那些以細(xì)胞核為靶點(diǎn)的藥物不能進(jìn)入胞核;另一方面使胞質(zhì)中的藥物進(jìn)入運(yùn)輸囊 泡,通過胞吐機(jī)制排出胞外。直接轉(zhuǎn)導(dǎo)LRPcDNA并不傳導(dǎo)耐藥表型,這說明LRP可能與其他 分子聯(lián)合起作用,單獨(dú)并不能產(chǎn)生多藥耐藥現(xiàn)象。4. BCRP 基因乳腺癌耐藥蛋白(breastcancer resistance protein,BCRP)是最近剛發(fā)現(xiàn)的一 種ABC不完全性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。由BRCP基因編碼,位于染色體4q22_q23,BRCP分子量為72kDa。 BRCP基因產(chǎn)生兩種轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物,它們?cè)?’端稍有區(qū)別,并編碼一種655個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可分成完全性和不完全性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白兩類,前者包括兩組由一個(gè)親脂 性跨膜結(jié)構(gòu)和一個(gè)ATP結(jié)合結(jié)構(gòu)組成的區(qū)域,而后者只有一組。不完全性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白必需形 成二聚體或多聚體才能具有轉(zhuǎn)運(yùn)功能。通常完全性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白位于胞膜上,而不完全性轉(zhuǎn)運(yùn) 蛋白位于質(zhì)膜上,如線粒體上的M-ABCl和ABC7、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的TAPl和TAP2以及過氧化小體 上的ALD亞家族成員等。BCRP是目前發(fā)現(xiàn)的第一種主要位于胞膜上的ABC不完全性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋 白。Rocchi等用Wfestern blot和免疫化學(xué)染色法證實(shí)BCRP/MXR在許多耐藥細(xì)胞株上表 達(dá),而且被定位于血漿側(cè)生物膜,而不同于其他不完全性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。Ross等用RT-PCR法檢 測(cè)了 20例AML,1例ALL患者腫瘤細(xì)胞BCRP mRNA的表達(dá),結(jié)果差異很大,近一半樣本表達(dá)量高出對(duì)照1000倍,另一半則BCRP mRNA低表達(dá)或幾乎測(cè)不出陽(yáng)性結(jié)果。BCRP高表達(dá)和 P-gp高表達(dá)并無緊密相關(guān)性,提示對(duì)P-gp陰性患者BCRP可能引起對(duì)某些抗白血病藥耐藥。 AML患者BCRP mRNA高表達(dá)發(fā)生率很高,這就為深入的研究來證明疾病亞型、預(yù)后與BCRP表 達(dá)及功能的關(guān)系提供了保證?,F(xiàn)今BCRP的所有研究主要集中在BCRP mRNA水平,由于沒有多抗和單抗血漿來 有效檢測(cè)BCRP,故蛋白水平的檢測(cè)仍未建立。腫瘤細(xì)胞BCRP表達(dá)和定位情況知之甚少。 Scheffer等用BCRP專門的單抗BXP-34檢測(cè)了一組人類腫瘤細(xì)胞,結(jié)果顯示除一例小腸腫 瘤BCRP輕微陽(yáng)性表達(dá)外,一組人類原發(fā)腫瘤的冷凍標(biāo)本BCRP都為陰性。甚至在原發(fā)耐藥 相對(duì)高水平的腎腺癌BCRP也未檢出。而且在以用藥物治療的乳腺癌或AML,也不能檢測(cè)到 BCRP。盡管以上資料可能提示在耐藥病例BCRP臨床發(fā)生率有限,但化療后乳腺癌腫塊則有 顯著縮小。還有在AML患者病情復(fù)發(fā)獨(dú)立于使用過藥物的類型等原因,因此,腫瘤細(xì)胞檢測(cè) 的結(jié)果不能反映真實(shí)耐藥情況。當(dāng)前尚需開發(fā)其他BCRP特異的單抗,采用合適的檢測(cè)手 段,進(jìn)行大規(guī)模腫瘤樣本的篩選,這些研究將對(duì)BCRP陽(yáng)性的腫瘤組織耐藥機(jī)制的探討提供 線索。Rabindran等在逆轉(zhuǎn)BCRP介導(dǎo)耐藥方面的研究資料表明,F(xiàn)TC(Fumitremorgin C) 在P-gp或MRP無表達(dá)的耐藥細(xì)胞株中,有潛在逆轉(zhuǎn)耐藥的作用。因?yàn)樗幬锖Y選的細(xì)胞株可 能包含MDR的多種耐藥機(jī)制,檢測(cè)FTC在BCRP基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株MCF-7中的逆轉(zhuǎn)作用,結(jié) 果顯示FTC在體外幾乎完全逆轉(zhuǎn)BCRP介導(dǎo)的耐藥。FTC的進(jìn)一步研究保證了其在BCRP功 能分析中的作用,并且可能成為臨床調(diào)節(jié)化療的修飾劑。

發(fā)明內(nèi)容
熒光定量PCR技術(shù)其原理是在常規(guī)PCR擴(kuò)增系統(tǒng)中加入一段與靶基因特異互補(bǔ)的 熒光標(biāo)記探針。探針的5'端標(biāo)記有報(bào)告基團(tuán),如FAM、VIC等,3'端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán), 如TAMRA等。當(dāng)探針完整的時(shí)候,報(bào)告基團(tuán)所發(fā)射的熒光能量被淬滅基團(tuán)吸收,儀器檢測(cè)不 到熒光信號(hào)。隨著PCR擴(kuò)增的進(jìn)行,Taq酶在鏈延伸過程中遇到與模板結(jié)合的探針就會(huì)將探 針切斷產(chǎn)生熒光信號(hào)。用熒光檢測(cè)儀檢測(cè)熒光值的變化,即可準(zhǔn)確判定擴(kuò)增產(chǎn)物的量。熒 光定量PCR方法就是根據(jù)此原理。在PCR過程中,連續(xù)不斷地檢測(cè)反應(yīng)體系中熒光信號(hào)的 變化。當(dāng)信號(hào)增強(qiáng)到某一閾值,此時(shí)的循環(huán)次數(shù)(用循環(huán)閾值Ct表示)就被記錄下來。Ct 值和PCR體系中起始模板的對(duì)數(shù)之間有著嚴(yán)格的線性關(guān)系,利用各梯度陽(yáng)性定量標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò) 增的Ct和定量模板數(shù)經(jīng)對(duì)數(shù)擬合作圖制成標(biāo)準(zhǔn)曲線,再根據(jù)待測(cè)樣品的Ct值就可以準(zhǔn)確 定出起始模板核酸的數(shù)量。基于熒光定量PCR技術(shù)原理,為了克服現(xiàn)有檢測(cè)技術(shù)中的缺陷和不足,本發(fā)明 提供了一種使用小池?zé)晒釶CR(Poc)I FQ-PCR)技術(shù)快速準(zhǔn)確檢測(cè)腫瘤多藥耐藥基因MDR、 MRP1、MRP2、MRP4、LRP、BCRP和GSTS的方法及其試劑盒。該方法的主要原理和過程是首先 針對(duì)腫瘤多藥耐藥基因MDR、MRP1、MRP2、MRP4、LRP、BCRP和GSTs的序列設(shè)計(jì)特異性引物和 熒光探針,采用熒光定量PCR方法,在擴(kuò)增儀上多管(Pool,小池)同時(shí)進(jìn)行。主要過程包 括(1)采集和運(yùn)送樣品;( 樣本預(yù)處理和提取RNA ; (3) Pool FQ-PCR體外擴(kuò)增法對(duì)樣本 進(jìn)行檢測(cè)合成特定引物和熒光探針,用Pool FQ-PCR技術(shù)并用擴(kuò)增反應(yīng)液(PCRMIX)對(duì)樣 本進(jìn)行檢測(cè);(4)擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)每個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)的熒光強(qiáng)度對(duì)相應(yīng)樣本進(jìn)行分析,從而判斷所采集的樣本中腫瘤多藥耐藥基因的存在。 首先,對(duì)腫瘤多藥耐藥基因序列進(jìn)行分析,從Genbank下載所有腫瘤多藥耐藥基 因(MDR、MRPU MRP2、MRP4、LRP、BCRP和GSTs等),經(jīng)過生物信息學(xué)分析反復(fù)比對(duì),設(shè)計(jì)特 異性引物和探針序列,詳細(xì)如下
NO. 6); NO. 9); NO. 12) NO. 18)
MDR 上游引物5,-CTGGACAAGCACTGAAAGATAAGA-3,(SEQ IDN0. 1); MDR 下游引物5,-CAACGGTTCGGAAGTTTTCT-3,(SEQ ID NO. 2); MDR 熒光探針5,-FAM-TCTGGGAAGATCGCTACTGAAGCA-TAMRA-3,(SEQ ID N0. 2); -CGTTAGAGCCCAAAGTGGAATC-3,(SEQ ID N0. 4); -AGTCGGCGGCGTAATTCTTA-3’ (SEQ ID N0. 5); 針5’ -FAM-TGAGGCTGCCCCAAGACTCAGACTTG-TAMRA-3’ (SEQ ID
MRPl上游引物5' MRPl下游引物5' MRPl熒光探
MRP2上游引物5' MRP2下游引物5' MRP2熒光探
MRP4上游引物5' MRP4下游引物5' MRP4熒光探
-CATCAAAGAAAGTGGAACAGGA-3,(SEQ ID N0. 7); -TGCGTCTGGAACGAAGACTC-3,(SEQ ID N0. 8); 針5, -FAM-CTGTTCCACTTTCTTTGATGAAACAA-TAMRA-3, (SEQ ID
-GGTGGCTCAATCCCTTGTTT-3 ‘ (SEQ ID N0. 10); -AAGGTGCTGTGAGCGGTCTT-3 ‘ (SEQ ID N0. 11); 針5’ -FAM-CCATAAACGGAGATTAGAGGAAGATG-TAMRA-3’ (SEQ ID
LRP 上游引物:5,-GGAGTCACCATGGCAACTGA-3,(SEQ ID N0. 13);
LRP 下游引物:5,-TTCTGGTCCAGCACATGGATAT-3,(SEQ ID N0. 14);
LRP 熒光探針5,-FAM-AGTTCATCATCCGCATCCCCCCATA-TAMRA-3,(SEQ ID NO. 15);
BCRP 上游引物:5,-CCTCCACCTGTTAGTCCCATTT-3,(SEQ ID N0. 16);
BCRP 下游引物5,-TGGTGCCACAACTCCTTGGT-3,(SEQ ID N0. 17);
BCRP 熒光探針5,-FAM-TCTCCGGCTGCACAGAAGGCATTTC-TAMRA-3,(SEQ ID
GSTs 上游引物:5,-GCTCCACTACTTCAATGCACG-3,(SEQ ID N0. 19);
GSTs 下游引物5,-CTTGTCCAAATCTTCTGCAGAT-3,(SEQ ID N0. 20);
GSiTs 熒光探針5,-FAM-AGAATGGAGTCCACCCGGTGGCTC-TAMRA-3,(SEQ ID NO. 21);同時(shí)弓I入人 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH),基因?yàn)閮?nèi)標(biāo), 特異性引物和熒光探針如下GAPDH 上游引物5,-CAGGTGGTCTCCTCTGACTTCA-3,(SEQ IDN0. 22);GAPDH 下游引物5,-GTGGTCGTTGAGGGCAATG-3,(SEQ ID N0. 13);GAPDH 熒光探針5,-FAM-ACACCCACTCCTCCACCTTTGACGCTAMRA-3,(SEQ ID N0. 24)。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案,上述各引物合成后需經(jīng)過HPLC(高效液相色 譜)的方法純化,各熒光探針均為在5’標(biāo)記有Fam熒光素,作為報(bào)告基團(tuán),3’標(biāo)記有Tamra, 作為淬滅基團(tuán)。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案,為了完成本發(fā)明的檢測(cè)方法首先采集標(biāo) 本,適用標(biāo)本類型包括腫瘤新鮮組織或新鮮血樣(EDTA2-Na抗凝)等。標(biāo)本應(yīng)立即用于測(cè) 試,也可保存于_80°C或液氮待測(cè),標(biāo)本運(yùn)送時(shí)應(yīng)采用0°C冰壺。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案,為了完成本發(fā)明的檢測(cè)方法對(duì)上述各種標(biāo)本提 取RNA 取固體組織50mg左右用玻璃勻漿器勻漿或剪刀剪碎,加入500 μ IRNA提取液,研磨 或振蕩至勻漿狀,轉(zhuǎn)移到1. 5ml的EP管中;或者全血應(yīng)用紅細(xì)胞裂解液(或淋巴細(xì)胞分離 液)分離淋巴細(xì)胞,沉淀加入500 μ 1 Trizol reagents,反復(fù)吹打。然后加入氯仿、異丙醇、 75% DEPC乙醇處理,最終用20 μ 1 DEPC Η20溶解沉淀,即為本實(shí)驗(yàn)需要的RNA。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案,為了完成本發(fā)明的檢測(cè)方法,首先要合成cDNA, 取上述提取的RNA2 μ 1,加1 μ 1逆轉(zhuǎn)錄酶系,7 μ 1逆轉(zhuǎn)錄緩沖液,充分混勻后短暫離心, 420C 30分鐘,后95°C 5min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案,為了完成本發(fā)明的檢測(cè)方法,擴(kuò)增體系按照如 下方式配制,各上游引物(IOuM)=Iul各下游引物(IOuM)=Iul各熒光探針(IOuM)0. 5ulPCR 反應(yīng)液17. 5ul_Total20. 0μ 1根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案,上述PCR反應(yīng)液包含F(xiàn)Q buffer (由 5 XFQbuffer經(jīng)雙蒸水稀釋為IX作為工作濃度)、四種核苷酸單體(dNTPs)等成分。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案,上述用IXFQ buffer工作液各主要成分和濃度 如下50mM Tris-HCl (pH8.0)、5mM MgC12、50mM KC1、0. 01 %的明膠等。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案,所檢測(cè)的腫瘤多藥耐藥基因包括MDR、MRP、LRP 和BCRP等,也就是說,對(duì)于某標(biāo)本進(jìn)行腫瘤多藥耐藥基因檢測(cè),需要對(duì)該標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行 MDR、MRPl、MRP2、MRP4、LRP、BCRP 禾口 GSTs 等幾個(gè)檢測(cè)反應(yīng)。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案,用于腫瘤多藥耐藥基因MDR、MRP1、MRP2、MRP4、 LRP、BCRP和GSTs檢測(cè)的幾個(gè)反應(yīng)管(Pool)作為一個(gè)整體同步進(jìn)行,各自檢測(cè)不同的基因, 所以稱為“小池?zé)晒釶CR(Poc)I FQ-PCR) ”,實(shí)現(xiàn)了快速準(zhǔn)確檢測(cè)的目的。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案,本發(fā)明的小池?zé)晒釶CR(P001 FQ-PCR)檢測(cè)方法 引入了一種陽(yáng)性質(zhì)控品,作為實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性對(duì)照和實(shí)驗(yàn)控制,該組陽(yáng)性質(zhì)控品是由MDR、MRP1、 MRP2、MRP4、LRP、BCRP和GSTs等幾個(gè)基因擴(kuò)增的特異性片段經(jīng)克隆構(gòu)建的重組質(zhì)粒組成, 其中各自濃度均為107COpieS/ml,而陰性質(zhì)控品是一種經(jīng)過高壓滅菌的TE緩沖液。所以, 本發(fā)明的方法不但可以進(jìn)行檢測(cè),還可一對(duì)mRNA進(jìn)行定量。陽(yáng)性質(zhì)控品擴(kuò)增曲線,如圖1。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案,本發(fā)明的小池?zé)晒釶CR(P001 FQ-PCR)檢測(cè) 方法,各小池(反應(yīng)管)的反應(yīng)體系設(shè)置為25ul,具體配制方法是上述檢測(cè)擴(kuò)增體系 (PCR-MIX) 20ul、Taq耐熱DNA聚合酶系2ul以及合成的cDNA或者陽(yáng)性質(zhì)控品或者陰性質(zhì) 控品分別為Ml。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案,本發(fā)明的試劑盒在ABI PRISM 7700、 ABIPRISM5700.ABI GeneAmp7000、ABIPRISM7300/7500、MJ Opticon 等熒光定量擴(kuò)增儀的擴(kuò) 增條件為93°C— 2分鐘,然后93°C 30秒一55°C 45秒,采集熒光,40個(gè)循環(huán)。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案,反應(yīng)結(jié)束后,使用手動(dòng)調(diào)整閾值使陰性質(zhì)控品Ct值在40以上,Ct值小于35個(gè)循環(huán)的為陽(yáng)性;Ct值在35-40個(gè)循環(huán)之間,為灰區(qū),需要進(jìn) 行重復(fù)試驗(yàn)。重復(fù)試驗(yàn)之后,如果Ct值仍然在35-40個(gè)循環(huán)之間,判斷為陽(yáng)性,沒有熒光值 增長(zhǎng)為陰性。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案,用TE buffer稀釋陽(yáng)性質(zhì)控品(107COpieS/ml), 濃度梯度為每 ml 1· 0Χ106、1· 0Χ105、1· 0Χ104、1· 0Χ103、1· 0Χ102、1· OxiOlCopies,進(jìn)行 靈敏度實(shí)驗(yàn),結(jié)果證實(shí)本試劑盒檢測(cè)靈敏度為ι. ο X 102copies/ml,比RT-PCR方法更為敏 感和精確,如圖2和3。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案,用經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證的陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行特異性實(shí)驗(yàn),結(jié) 果證實(shí),本試劑盒特異性較好,吻合度為100%。本發(fā)明的試劑盒經(jīng)過多次不同的重復(fù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證證實(shí),具有良好的重復(fù)性好和穩(wěn)定 好的性能。在-20°C條件下試劑盒可有效期可以達(dá)12個(gè)月。


圖1顯示MDR、MRP1、MRP2、MRP4、LRP、BCRP和GSTs等擴(kuò)增曲線較好,呈標(biāo)準(zhǔn)的 S型擴(kuò)增曲線。圖2為用TE buffer稀釋陽(yáng)性質(zhì)控品(107COpies/ml),濃度梯度依次為 1. 0 XlOVml >1. 0 X105/ml >1. 0 XioVml >1. OX 103/ml >1. 0 X102/ml >1. 0 XlOVml,進(jìn)行靈 敏度實(shí)驗(yàn),結(jié)果證實(shí)本小池?zé)晒釶CR(PoolFQ-PCR)檢測(cè)試劑盒靈敏度為1. 0 X IO2Copies/ ml,比RT-PCR方法更為敏感和精確,如圖3,1 6為梯度稀釋的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品PCR反應(yīng)產(chǎn)物, 2%瓊脂瓊脂糖凝膠,樣品濃度分別為 1. OX 107/ml、1. OX 106/ml、1. 0XlO5Ail、1. OXlO4/ ml、1. 0X 103/mlU. OX 102/ml)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 腫瘤多藥耐藥基因檢測(cè)標(biāo)本的采集適用標(biāo)本類型包括腫瘤新鮮組織或新鮮血樣(EDTA2_Na抗凝)等標(biāo)本。標(biāo)本采集 腫瘤新鮮組織,取活檢或手術(shù)病人腫瘤組織約50-100mg (約黃豆大小),放于1. 5mlDEPC水 處理的滅菌離心管中,密閉送檢。新鮮血液,無菌注射器抽取受檢者靜脈血3-5毫升,注入 EDTA2Na抗凝管中,充分混勻送檢。實(shí)施例2 腫瘤多藥耐藥基因mRNA的提取固體組織,取50mg左右組織用玻璃勻漿器勻漿或剪刀剪碎,加入0. 5mLTrizol reagents,研磨或振蕩,轉(zhuǎn)移到1. 5mL的EP管中,室溫放置5min。全血,應(yīng)用紅細(xì)胞裂解液 (或淋巴細(xì)胞分離液)分離淋巴細(xì)胞,沉淀加入500 μ 1 Trizolreagents,反復(fù)吹打,室溫放 8 5πι η0加入IOOul氯仿,用力震蕩15s,室溫靜置5min,4°C 13,OOOrpm離心5min。小心將 上層水相轉(zhuǎn)移到干凈離心管中,加等體積異丙醇,充分混勻,13,OOOrpm離心5min。棄上清, 加入500 μ 1 75%的DEPC乙醇,充分混勻,13,OOOrpm離心5min,小心吸去大部分乙醇。將 提取管敞口在室溫空氣中干燥lOmin,用20 μ 1 DEPC Η20溶解沉淀。陰性質(zhì)控品,取100 μ 1 加入500ul Trizol reagents充分震蕩,余按上述操作。實(shí)施例3 腫瘤多藥耐藥基因cDNA的合成取2 μ 1上述提取的RNA,加1 μ 1逆轉(zhuǎn)錄酶系,7 μ 1逆轉(zhuǎn)錄緩沖液,充分混勻后短 暫離心,42°C 30分鐘,后95°C 5min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。即得到cDNA。
實(shí)施例4 小池?zé)晒釶CR(Pool FQ-PCR)方法對(duì)多藥耐藥基因進(jìn)行檢測(cè)從試劑盒中取出PCR MIX、Taq酶系,室溫融化并振蕩混勻后,10, OOOrpm離心IOs 進(jìn)行PCR擴(kuò)增,各小池(Pool)對(duì)應(yīng)的檢測(cè)體系為
權(quán)利要求
1.一種Pool FQ-PCR聯(lián)合檢測(cè)腫瘤多藥耐藥基因MDR、MRPl、MRP2、MRP4、LRP、BCRP和 GSTs的方法及其試劑盒,試劑盒采用的特異性引物和探針序列如下MDR 上游引物5,-CTGGACAAGCACTGAAAGATAAGA-3,(SEQ ID NO. 1); MDR 下游引物5,-CAACGGTTCGGAAGTTTTCT-3,(SEQ ID NO. 2); MDR 熒光探針5,-FAM-TCTGGGAAGATCGCTACTGAAGCA-TAMRA-3,(SEQ ID NO. 2); MRPl 上游引物:5,-CGTTAGAGCCCAAAGTGGAATC-3,(SEQ ID NO. 4); MRPl 下游引物:5,-AGTCGGCGGCGTAATTCTTA-3,(SEQ ID NO. 5); MRPl 熒光探針5,-FAM-TGAGGCTGCCCCAAGACTCAGACTTG-TAMRA-3,(SEQ ID NO. 6); MRP2 上游引物5,-CATCAAAGAAAGTGGAACAGGA-3,(SEQ ID NO. 7); MRP2 下游引物5,-TGCGTCTGGAACGAAGACTC-3,(SEQ ID NO. 8); MRP2 熒光控針5,-FAM-CTGTTCCACTTTCTTTGATGAAACAA-TAMRA-3,(SEQ ID NO. 9); MRP4 上游引物:5,-GGTGGCTCAATCCCTTGTTT-3,(SEQ ID NO. 10); MRP4 下游引物:5,-AAGGTGCTGTGAGCGGTCTT-3,(SEQ ID NO. 11); MRP4 熒光探針5,-FAM-CCATAAACGGAGATTAGAGGAAGATG-TAMRA-3,(SEQ ID NO. 12); LRP 上游引物:5,-GGAGTCACCATGGCAACTGA-3,(SEQ ID NO. 13); LRP 下游引物:5,-TTCTGGTCCAGCACATGGATAT-3,(SEQ ID NO. 14); LRP 熒光探針5,-FAM-AGTTCATCATCCGCATCCCCCCATA-TAMRA-3,(SEQ ID NO. 15); BCRP 上游引物:5,-CCTCCACCTGTTAGTCCCATTT-3,(SEQ ID NO. 16); BCRP 下游引物:5,-TGGTGCCACAACTCCTTGGT-3,(SEQ ID NO. 17); BCRP 熒光探針5,-FAM-TCTCCGGCTGCACAGAAGGCATTTC-TAMRA-3,(SEQ ID NO. 18); GSTs 上游引物:5,-GCTCCACTACTTCAATGCACG-3,(SEQ ID NO. 19); GSTs 下游引物5,-CTTGTCCAAATCTTCTGCAGAT-3,(SEQ ID NO. 20); GSTs 熒光探針5,-FAM-AGAATGGAGTCCACCCGGTGGCTC-TAMRA-3,(SEQ ID NO. 21); 同時(shí)弓I入人 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH),基因?yàn)閮?nèi)標(biāo),特異 性引物和熒光探針如下GAPDH 上游引物5,-CAGGTGGTCTCCTCTGACTTCA-3,(SEQ ID NO. 22); GAPDH 下游引物5,-GTGGTCGTTGAGGGCAATG-3,(SEQ ID NO. 13); GAPDH 熒光探針5,-FAM-ACACCCACTCCTCCACCTTTGACGC TAMRA-3,(SEQ ID NO. 24)。 上述各引物合成后需經(jīng)過HPLC的方法純化,各熒光探針均在5’標(biāo)記有Fam熒光素,作 為報(bào)告基團(tuán),3’標(biāo)記有Tamra,作為淬滅基團(tuán)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種PoolFQ-PCR(小池-熒光PCR)聯(lián)合檢測(cè)腫瘤多藥耐 藥基因MDR、MRP1、MRP2、MRP4、LRP、BCRP和GSTs的方法及其試劑盒,用于檢測(cè)的多個(gè)反應(yīng) 管(小池,Pool),作為一個(gè)整體同步進(jìn)行,各自檢測(cè)不同的耐藥基因,所以稱為“小池?zé)晒?PCR(Pool FQ-PCR) ”,實(shí)現(xiàn)了快速準(zhǔn)確檢測(cè)的目的。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種分型檢測(cè)試劑盒,根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案,為 了完成本發(fā)明的檢測(cè)方法,首先要合成cDNA,取上述提取的RNA2y 1,加1 μ 1逆轉(zhuǎn)錄酶系, 7μ 1逆轉(zhuǎn)錄緩沖液,充分混勻后短暫離心,42°C 30分鐘,后95°C 5min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。然后 每個(gè)小池分型檢測(cè)所用的擴(kuò)增體系按照如下方式配制上游引物(IOuM) =Iul下游引物(IOuM) =Iul 熒光探針(IOuM) 0. 5ul PCR 反應(yīng)液 17. 5μ1Total20. 0μ 1PCR反應(yīng)液(PCR MIX)包含F(xiàn)Q buffer (由5XFQ buffer經(jīng)雙蒸水稀釋為IX作為工 作液)、四種核苷酸單體(dNTPs)等成分。其中IXFQ buffer工作液各主要成分和濃度為 50mM Tris-HCl (pH8.0)、5mM MgC12、50mM KC1、0. 01 %的明膠等。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種Pool FQ-PCR聯(lián)合檢測(cè)腫瘤多藥耐藥基因MDR、MRP1、MRP2、MRP4、LRP、BCRP和GSTs的方法及其試劑盒,為臨床檢測(cè)腫瘤多藥耐藥基因提供了新的方法,該檢測(cè)過程包括(1)采集待檢測(cè)樣品;(2)樣品預(yù)處理和提取腫瘤多藥耐藥基因的mRNA并合成cDNA;(3)Pool FQ-PCR體外擴(kuò)增法對(duì)樣本進(jìn)行檢測(cè)合成特定分型引物和熒光探針,用Pool FQ-PCR技術(shù)并用擴(kuò)增反應(yīng)液(PCR MIX)對(duì)樣本進(jìn)行檢測(cè);(4)擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)每個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)的熒光強(qiáng)度對(duì)相應(yīng)樣本進(jìn)行分析,從而判斷所采集的樣品中腫瘤耐藥基因MDR、MRP1、MRP2、MRP4、LRP、BCRP和GSTs的存在。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102121048SQ201010000468
公開日2011年7月13日 申請(qǐng)日期2010年1月11日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月11日
發(fā)明者任美峰, 史成軍, 張建業(yè), 徐貴峰, 符立梧, 那寧 申請(qǐng)人:中山大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院, 北京索奧生物醫(yī)藥科技有限公司, 廣州醫(yī)學(xué)院
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