專利名稱：心腦血管疾病相關(guān)標(biāo)志物的聯(lián)合并行檢測方法及診斷試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種體外診斷檢測方法及其診斷試劑盒，特別是涉及心腦血管疾病相 關(guān)標(biāo)志物的液相芯片聯(lián)合并行檢測方法及其診斷試劑盒。
背景技術(shù)：
心腦血管疾病是中國城市人口和西方發(fā)達(dá)國家的主要疾病和主要死亡原因之一， 主要包括以冠心病、高血壓等為代表的心血管疾病，以及缺血性腦血管病和出血性腦血管 病。缺血性腦血管病，又稱急性缺血性腦血管綜合癥(AICQ，包括腦梗死(亦稱腦梗塞，Cl) 和短暫性腦缺血性發(fā)作(TIA)；出血性腦血管病包括腦出血和蛛網(wǎng)膜下腔出血。心腦血管 疾病生物標(biāo)志物的聯(lián)合檢測已成為心腦血管疾病的危險因素篩查或預(yù)測、早期診斷、疾病 進(jìn)程、療效監(jiān)測和預(yù)后判斷的非常重要的指標(biāo)，而多指標(biāo)聯(lián)合并行檢測的高通量迅速性、準(zhǔn) 確性和穩(wěn)定性就更加至關(guān)重要。白介素18(IL18)是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種具有多向性效應(yīng)的促炎癥因子，是預(yù)測 心腦血管疾病的一種較獨立的預(yù)測因子。近年來研究發(fā)現(xiàn)的與心腦血管疾病的發(fā)生發(fā)展相 關(guān)的標(biāo)志物還包括可溶性P選擇素(sP-Selectin)、可溶性血管細(xì)胞粘附分子1 (sVCAMl)、 白介素8 (IL8)、白介素10 (ILlO)、白介素1 β (ILl β )。目前，對于心腦血管疾病相關(guān)標(biāo)志物的測定已有多種檢測方法，包括免疫比濁分 析、酶聯(lián)免疫分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)、磁分離酶聯(lián)免疫分析(EIMA)等。但是這 些技術(shù)都存在著檢測通量的局限性，且操作繁瑣、靈敏度較差，不能真正滿足臨床診斷檢測 的需要。而固相生物芯片技術(shù)存在著可重復(fù)性差、靈敏度不夠好以及操作繁瑣的缺點。液相芯片(xMAP)又稱液態(tài)芯片，是一種可廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)、基因、受體/配體等 多種生物反應(yīng)的新一代生物芯片技術(shù)，主要包括顏色編碼的微球(Color-coded Beads)、探 針分子、被檢測物和報告分子四種成分。在微球的制造過程當(dāng)中，摻入了兩種不同的紅色分 類熒光，根據(jù)這兩種熒光的比例不同把球形基質(zhì)分為100種，可以標(biāo)記上100種不同的探針 分子，能同時對一個樣品中多達(dá)100種不同的目標(biāo)分子進(jìn)行檢測。反應(yīng)過程中，探針和報告 分子都分別與目標(biāo)分子特異性結(jié)合。反應(yīng)結(jié)束后，使單個的微球通過檢測通道，使用紅、綠 雙色激光同時對微球上的紅色分類熒光和報告分子上的綠色報告熒光進(jìn)行檢測，可確定所 結(jié)合的檢測物的種類和數(shù)量。本發(fā)明基于液相芯片技術(shù)的極高通量性、高靈敏度、高特異性、重復(fù)性好、操作簡 便、線性范圍寬、檢測迅速等突出優(yōu)點，對心腦血管疾病相關(guān)的多種標(biāo)志物進(jìn)行聯(lián)合并行檢 測，能夠在臨床檢測上得到更好的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題之一是提供一種用于心腦血管疾病相關(guān)標(biāo)志物的液 相芯片聯(lián)合并行檢測方法；
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題之二是提供一種檢測心腦血管疾病相關(guān)標(biāo)志物的診 斷試劑盒；本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題之三是提供上述診斷試劑盒的應(yīng)用。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的一種心腦血管疾病相關(guān)標(biāo)志物的液相芯片聯(lián)合并 行檢測方法，包括以下步驟(1)將捕獲抗體與不同編號的微球(Beads)偶聯(lián)，形成“捕獲抗體-微球” 二聯(lián)復(fù) 合體，所述的每一種捕獲抗體分別抗一種心腦血管疾病相關(guān)標(biāo)志物，從而使待測樣品中的 心腦血管疾病相關(guān)標(biāo)志物與捕獲抗體形成“心腦血管疾病相關(guān)標(biāo)志物-捕獲抗體-微球”三 聯(lián)復(fù)合體；所述的心腦血管疾病相關(guān)標(biāo)志物包含以下標(biāo)志物的任意一種或任意多種或加上 其它標(biāo)志物的組合sP-Selectin、sVCAMl、IL8、IL18、ILlO、IL10。即所述的多種相關(guān)標(biāo)志 物可以是包含sP-Selectin、sVCAMl、IL8、IL18、ILlO、IL10中任意一種、任意兩種、任意三 種、任意四種、任意五種、任意六種或加上其它標(biāo)志物的組合。(2)將不同的檢測抗體進(jìn)行信號標(biāo)記，其中所述的每一種檢測抗體分別抗一種心 腦血管疾病相關(guān)標(biāo)志物且對應(yīng)于捕獲抗體，并與捕獲抗體分別結(jié)合于該相關(guān)標(biāo)志物的不同 抗原表位；(3)將步驟(1)形成的三聯(lián)復(fù)合體與步驟( 中的含有信號標(biāo)記的檢測抗體混合， 從而形成“信號標(biāo)記的檢測抗體-心腦血管疾病相關(guān)標(biāo)志物-捕獲抗體-微球”四聯(lián)復(fù)合 體；(4)用液相芯片法(xMAP)檢測出四聯(lián)復(fù)合體中不同微球的標(biāo)記信號，從而確定待 檢測樣品中各種心腦血管疾病相關(guān)標(biāo)志物的存在及含量。步驟中，所述確定待檢測樣品中各種心腦血管疾病相關(guān)標(biāo)志物的含量，其具 體方法為將步驟中測定的可檢測標(biāo)記信號與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較，從而確定待檢測樣 品中各種心腦血管疾病相關(guān)標(biāo)志物的含量。所述的微球的平均直徑可以為5.6 μ m，該微球是結(jié)合了不同熒光染料的聚苯烯微 球，即顏色編碼微球(Color-coded Beads)。所述信號標(biāo)記指可采用生物素(Biotin)-鏈霉親和素-藻紅蛋白 (Streptavidin-PE)的標(biāo)記或其它本領(lǐng)域常規(guī)的免疫標(biāo)記方法如熒光素、酶、化學(xué)發(fā)光劑寸。步驟(1)中所述的與捕獲抗體偶聯(lián)的微球，可以使用已經(jīng)活化的微球(Activated Beads)，能夠直接和捕獲抗體共價偶聯(lián)(如通過抗體表面的自由thoil基團(tuán))；如果使用 羧基(-C00H)微球，必須先對微球進(jìn)行活化，通常是采用EDC/S-NHS等化學(xué)物質(zhì)活化，這樣 微球就能夠被含有自由氨基團(tuán)(Amino Group)的分子(如抗體等)共價結(jié)合。微球活化 一般可采用如下方法微球在由1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽 (EDC)溶液、N-羥基硫代琥珀酰亞胺(S-MB)溶液和活化緩沖液組成的3者混合液中進(jìn)行 活化，其中，3者混合液的用量比是當(dāng)微球數(shù)量為2. 5X IO6個時，需要50mg/mlEDC溶液 10μ 1 50mg/mlS-NHS 溶液 10μ 1 IOOmM NaH2P04、pH6. 3 的活化緩沖液 80 μ 1，混合液的 用量可以根據(jù)微球的數(shù)量進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整。所述的捕獲抗體和檢測抗體是針對以下6種可以自由組合的心腦血管疾病相關(guān) 標(biāo)志物的捕獲抗體和檢測抗體
sP-Selectin、sVCAMU IL8、IL18、IL10、ILl β。檢測方法中所述的步驟⑷中用液相芯片法(χΜΑΡ)進(jìn)行檢測，所述的可檢測標(biāo)記
信號是熒光信號。在本發(fā)明的另一方面，提供一種檢測心腦血管疾病相關(guān)標(biāo)志物的診斷試劑盒，主 要包括以下組分(1)偶聯(lián)抗體的微球含有分別偶聯(lián)了不同捕獲抗體的微球，包含以下任意一種 或任意多種微球偶聯(lián)了可溶性P選擇素sP-klectin捕獲抗體的微球，偶聯(lián)了可溶性血 管細(xì)胞粘附分子1 sVCAMl捕獲抗體的微球，偶聯(lián)了白介素8IL8捕獲抗體的微球，偶聯(lián)了可 溶性白介素18 IL18捕獲抗體的微球，偶聯(lián)了白介素10 ILlO捕獲抗體的微球，偶聯(lián)了白介 素1 β ILl β捕獲抗體的微球；每種捕獲抗體分別抗一種冠心病相關(guān)的蛋白標(biāo)志物并且偶 聯(lián)于不同編號的微球，形成“抗體-微球”的二聯(lián)復(fù)合體；(2)信號標(biāo)記的檢測抗體包含以下任意一種或任意多種帶有信號標(biāo)記的檢測抗 體標(biāo)記的sP-Selectin檢測抗體，標(biāo)記的sVCAMl檢測抗體，標(biāo)記的IL8檢測抗體，標(biāo)記的 IL18檢測抗體，標(biāo)記的ILlO檢測抗體，標(biāo)記的ILl β檢測抗體；其中所述的每一種檢測抗 體分別抗一種相應(yīng)的心腦血管疾病相關(guān)標(biāo)志物且對應(yīng)于捕獲抗體，并與捕獲抗體分別結(jié)合 于該相關(guān)標(biāo)志物的不同抗原表位；(3)標(biāo)準(zhǔn)品包含各種心腦血管疾病相關(guān)標(biāo)志物(抗原)的標(biāo)準(zhǔn)品；(4)質(zhì)控品包含陽性對照和陰性對照。所述信號標(biāo)記的檢測抗體可以是采用生物素(Biotin)標(biāo)記的檢測抗體；如采用 生物素標(biāo)記檢測抗體，該診斷試劑盒還包括鏈霉親和素-藻紅蛋白(Mi^ptavidin-PE)，其 中鏈霉親和素可與生物素特異性結(jié)合，形成帶藻紅蛋白(PE)熒光素標(biāo)記的檢測抗體，通過 液相芯片儀的綠色激光激發(fā)藻紅蛋白進(jìn)行熒光檢測。其中所述的捕獲抗體和檢測抗體是針對以下6種可以自由組合的心腦血管疾病 相關(guān)標(biāo)志物的捕獲抗體和檢測抗體sP-Selectin、sVCAMl、IL8、IL18、IL10、ILl β。在本發(fā)明的另一方面，還提供上述診斷試劑盒的應(yīng)用。本發(fā)明的一種檢測心腦血 管疾病相關(guān)標(biāo)志物的診斷試劑盒可用于檢測體外樣品中心腦血管疾病相關(guān)標(biāo)志物的存在 和含量，及用于心腦血管疾病的危險因素篩查或預(yù)測、診斷檢測、療效監(jiān)測和預(yù)后判斷，還 可用于除心腦血管疾病以外的其它疾病的診斷檢測或預(yù)測。由于本發(fā)明利用了液相芯片技術(shù)，對心腦血管疾病相關(guān)的多種標(biāo)志物進(jìn)行聯(lián)合并 行檢測，聯(lián)合并行檢測方法的特征是能夠一次性檢測同一個樣品中的多種標(biāo)志物，使檢測 方法及試劑盒具有高靈敏度、高特異性、高通量、穩(wěn)定性好、檢測迅速、準(zhǔn)確等突出優(yōu)點，能 夠?qū)Χ喾N相關(guān)的蛋白標(biāo)志物同時進(jìn)行定性和定量檢測，能在臨床檢測上得到更好的應(yīng)用。


下面結(jié)合附圖與具體實施方式
對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明圖1是本發(fā)明實施例3中檢測心腦血管患者與正常對照組中IL8的濃度分布圖；圖2是本發(fā)明實施例3中檢測心腦血管患者與正常對照組中ILlO的濃度分布圖；圖3是本發(fā)明實施例3中檢測心腦血患者與正常對照組中的IL18濃度分布圖4是本發(fā)明實施例3中檢測心腦血管患者與正常對照組中ILl β的濃度分布 圖；圖5是本發(fā)明實施例3中檢測心腦血管患者與正常對照組中sVCAMl的濃度分布 圖；圖6是本發(fā)明實施例3中檢測心腦血管患者與正常對照組中sP-Selectin的濃度 分布圖。
具體實施例方式實驗材料本發(fā)明所用的6種心腦血管疾病相關(guān)標(biāo)志物sP-Selectin、sVCAMU IL8、IL18、 IL10.IL1 β (抗原)及相應(yīng)抗體來源于 Santa Cruz Biotechnology,Biodesign.EPITOMICS 禾口 Abcam公司。不同編號的微球(表面羧基修飾)、鏈霉親和素-藻紅蛋白均購置于QIAGEN公司；1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、N_羥基硫代琥珀 酰亞胺(S-NHS)和N-羥基硫代琥珀酰亞胺生物素(S-NHS-Biotin)購置于Pierce公司。緩沖液配制活化緩沖液(Activationbuffer) IOOmM NaH2PO4, ρΗ6· 3 ；偶聯(lián)緩沖液(Couplingbuffer) :50mM HEPES, pH7. 4 ；磷酸緩沖液(PBS)=IOmM NaH2PO4,150mM NaCl，pH7.4。實施例1 :3種心腦血管疾病相關(guān)標(biāo)志物的液相芯片聯(lián)合并行檢測方法具體的檢測方法包括如下步驟選擇編號為11、15、37號的3種微球1.所需微球的活化 1.1全速渦旋微球儲存液至少3min，形成均一的微球懸液；1. 2分別稱取IOmg的EDC和S-NHS到兩個離心管中；1. 3用去離子水溶解使其終濃度為50mg/ml ；1. 4取Iml的微球懸液IOOOOg離心3min，小心移除上清；1. 5加入80 μ 1的活化緩沖液將微球重懸；1. 6 分別加入 10 μ 1 的 EDC 溶液(50mg/ml)和 10 μ 1 的 S-NHS 溶液(50mg/ml)，混 合均勻，室溫(15-25°C )，避光，振蕩孵育20min。2.相應(yīng)的捕獲抗體與活化的微球偶聯(lián)2. 1用偶聯(lián)緩沖液將捕獲抗體稀釋成體積為500 μ 1，濃度為0. lmg/ml的溶液； (抗體溶液中不能含有外源蛋白，疊氮化物，氨基乙酸，Tris或其他任何含有氨基的試劑。 如果含有這些試劑，通過透析或凝膠過濾層析除去。)2. 2將微球在IOOOOg離心3min，小心移除上清；2. 3加入步驟2. 1中已經(jīng)稀釋好的抗體溶液(500 μ 1)；2. 4將活化的微球與抗體溶液，在室溫(15_25°C)下，避光，振蕩孵育池；(離心管 必須用錫紙包裹避光)2. 5將微球在IOOOOg離心3min，小心移除上清；
2. 6加入500 μ 1 PBS將微球重懸，IOOOOg離心3min,小心移除上清；2. 7加入Iml PBS/1% BSA(BSA 牛血清白蛋白)將微球重懸；2. 8通過血小板計數(shù)器對微球計數(shù)；3.生物素標(biāo)記檢測抗體3. 1將生物素試劑(S-NHS-Biotin)從冰箱的冷藏室中取出，在室溫下平衡，使其 恢復(fù)到室溫；3. 2依據(jù)檢測抗體的濃度，用PBS將抗體稀釋到lmg/ml ；如果抗體溶解在含有氨基的溶液中，應(yīng)先除去氨基，置換成沒有氨基的緩沖液； 3. 3用超純水配置IOmM的生物素溶液；3.4按摩爾比1 20(抗體生物素)，計算生物素所需要的量，加入到濃度為 lmg/ml的抗體溶液中；計算公式
, 1、 抗體體積(ml)χ抗體濃度(mg/ml) ., ^^, μ
Biotin (mmol) = -^ ., .. ^ ^3 t-^-χ生物素與蛋白的摩爾比
抗體分于星(mg/mmol)3. 5將反應(yīng)液在冰上孵育2h，或是在室溫孵育30min ；3. 6將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移到透析盒，除去其中未反應(yīng)的S-NHS-Biotin。4.抗原標(biāo)準(zhǔn)品的配置IL8 和 ILlO 按 312. 5，62. 5，12. 5,2. 5,0. 5,0. l，0pg/ml 的濃度進(jìn)行配制，sVCAMl 按31250,6250，1250，250，50，10,0ng/ml的濃度進(jìn)行配制，標(biāo)志物混合液分別標(biāo)記為STD6， STD5, STD4, STD3, STD2, STD1，STDO。5.偶聯(lián)捕獲抗體的微球混合液(I混合液)的配制分別取偶聯(lián)了 3種心腦血管疾病標(biāo)志物的捕獲抗體的微球，如下列IL8捕獲抗體 微球11，ILlO捕獲抗體微球15，sVCAMl捕獲抗體微球37，等比例混合，使每種微球的終濃 度分別為200個/μ 1，4°C避光保存。6.含生物素標(biāo)記的檢測抗體混合液(II混合液)的配制分別取進(jìn)行了生物素標(biāo)記的IL8檢測抗體，ILlO檢測抗體，sVCAMl檢測抗體，加入 PH7. 4的PBS，使每種檢測抗體的終濃度分別為10 μ g/ml。7.質(zhì)控品質(zhì)控品包括陽性對照和陰性對照。8.血清樣品中3種心腦血管疾病相關(guān)標(biāo)志物的含量檢測8. 1血清樣品包括正常人血清樣本12份(正常對照組1-12號樣本)，心腦血管疾 病患者血清樣本12份(心腦血管疾病組1-3號為冠心病患者、4-6號為高血壓患者、7-9號 為缺血性腦血管病患者、10-12號為出血性腦血管病患者的樣本)。8. 2分別加入偶聯(lián)捕獲抗體的微球混合液(I混合液)于96孔酶標(biāo)板，25 μ 1/孔；8. 3 加入標(biāo)準(zhǔn)品(STD0、STD1、STD2、STD3、STD4、STD5、STD6)、質(zhì)控品(陽性對照和 陰性對照)、病人血清樣本1-12號、正常人血清樣本1-12號，25 μ 1/孔；8. 4用排槍溫柔的上下混勻混合物，蓋上蓋子，在室溫下避光孵育30min ；8. 5加入含生物素標(biāo)記的檢測抗體混合液(II混合液)，25 μ 1/孔；用排槍溫柔的上下混勻混合物，蓋上蓋子，在室溫下避光孵育30min ；8. 6用PBS/1% BSA將鏈霉親和素-藻紅蛋白稀釋成濃度為200ug/ml的溶液，加稀 釋好的鏈霉親和素藻紅蛋白25 μ 1到每個孔中，用排槍溫柔的上下混勻混合物，蓋上蓋子， 在室溫下避光孵育15-30min ；8. 7在液相芯片儀(LiquiChip 200或Luminex 200)上，對反應(yīng)的混合物進(jìn)行分 析，可自動繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出檢測樣品中3種心腦血管疾病標(biāo)志物的含量。8. 8檢測結(jié)果及分析具體參見表1-3。表1心腦血管疾病組標(biāo)志物的濃度值
[
權(quán)利要求
1.一種心腦血管疾病相關(guān)標(biāo)志物的聯(lián)合并行檢測方法，其特征在于，包括以下主要步驟(1)將捕獲抗體與不同編號的微球Beads偶聯(lián)，形成“捕獲抗體_微球”二聯(lián)復(fù)合體， 所述的每一種捕獲抗體分別抗一種心腦血管疾病相關(guān)標(biāo)志物，從而使待測樣品中的心腦血 管疾病相關(guān)標(biāo)志物與捕獲抗體形成“心腦血管疾病相關(guān)標(biāo)志物-捕獲抗體-微球”三聯(lián)復(fù) 合體；所述的心腦血管疾病相關(guān)標(biāo)志物包含以下標(biāo)志物的任意一種或任意多種或加上其它 標(biāo)志物的組合可溶性P選擇素sP-Selectin、可溶性血管細(xì)胞粘附分子1 sVCAMl、白介素 8IL8、白介素18 IL18、白介素10IL10、白介素1β IL13 ；(2)將不同的檢測抗體進(jìn)行信號標(biāo)記，其中所述的每一種檢測抗體分別抗一種心腦血 管疾病相關(guān)標(biāo)志物且對應(yīng)于捕獲抗體，并與捕獲抗體分別結(jié)合于該相關(guān)標(biāo)志物的不同抗原 表位；(3)將步驟(1)形成的三聯(lián)復(fù)合體與步驟( 中的帶有信號標(biāo)記的檢測抗體混合，從而 形成“信號標(biāo)記的檢測抗體-心腦血管疾病相關(guān)標(biāo)志物-捕獲抗體-微球”四聯(lián)復(fù)合體；(4)用液相芯片法xMAP檢測出四聯(lián)復(fù)合體中不同微球的標(biāo)記信號，從而確定待檢測樣 品中各種心腦血管疾病相關(guān)標(biāo)志物的存在及含量。
2.如權(quán)利要求1所述的心腦血管疾病相關(guān)標(biāo)志物的聯(lián)合并行檢測方法，其特征在于， 步驟中，所述確定待檢測樣品中各種心腦血管疾病相關(guān)標(biāo)志物的含量，其具體方法為 將步驟中測定的標(biāo)記信號與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較，從而確定待檢測樣品中各種心腦血管 疾病相關(guān)標(biāo)志物的含量。
3.如權(quán)利要求1所述的心腦血管疾病相關(guān)標(biāo)志物的聯(lián)合并行檢測方法，其特征在于， 步驟(1)中，所述的微球是一種顏色編碼微球Color-coded Beads，且結(jié)合了不同熒光染料 的聚苯烯微球。
4.如權(quán)利要求1所述的心腦血管疾病相關(guān)標(biāo)志物的聯(lián)合并行檢測方法，其特征在于， 所述的捕獲抗體和檢測抗體是針對以下6種標(biāo)志物自由組合的心腦血管疾病相關(guān)標(biāo)志物 的捕獲抗體和檢測抗體可溶性P選擇素sP-Selectin、可溶性血管細(xì)胞粘附分子lsVCAMl、白介素8IL8、白介素 18IL18、白介素 10IL10、白介素 1 β ILl β。
5.如權(quán)利要求1所述的心腦血管疾病相關(guān)標(biāo)志物的聯(lián)合并行檢測方法，其特征在于， 所述步驟⑷中用液相芯片法xMAP進(jìn)行檢測，可檢測的標(biāo)記信號是熒光信號。
6.一種檢測心腦血管疾病相關(guān)標(biāo)志物的診斷試劑盒，其特征在于，包括以下主要組成 成分(1)偶聯(lián)抗體的微球含有分別偶聯(lián)了不同捕獲抗體的微球，包含以下任意一種或任 意多種微球偶聯(lián)了可溶性P選擇素sP-Selectin捕獲抗體的微球，偶聯(lián)了可溶性血管細(xì)胞 粘附分子1 sVCAMl捕獲抗體的微球，偶聯(lián)了白介素8IL8捕獲抗體的微球，偶聯(lián)了白介素18 IL18捕獲抗體的微球，偶聯(lián)了白介素10IL10捕獲抗體的微球，偶聯(lián)了白介素1 β ILl β捕獲 抗體的微球；每種捕獲抗體分別抗一種心腦血管疾病相關(guān)標(biāo)志物并且偶聯(lián)于不同編號的微 球，形成“抗體-微球”的二聯(lián)復(fù)合體；(2)信號標(biāo)記的檢測抗體包含以下任意一種或任意多種帶有信號標(biāo)記的檢測抗體 標(biāo)記的可溶性P選擇素sP-Selectin檢測抗體，標(biāo)記的可溶性血管細(xì)胞粘附分子lsVCAMl檢測抗體，標(biāo)記的白介素8 IL8檢測抗體，標(biāo)記的白介素18IL18檢測抗體，標(biāo)記的白介素 10IL10檢測抗體，標(biāo)記的白介素1 β ILl β檢測抗體；其中所述的每一種檢測抗體分別抗一 種相應(yīng)的心腦血管疾病相關(guān)標(biāo)志物且對應(yīng)于捕獲抗體，并與捕獲抗體分別結(jié)合于該相關(guān)標(biāo) 志物的不同抗原表位；(3)標(biāo)準(zhǔn)品包含各種心腦血管疾病相關(guān)標(biāo)志物的標(biāo)準(zhǔn)品；(4)質(zhì)控品包含陽性對照和陰性對照。
7.如權(quán)利要求6所述的檢測心腦血管疾病相關(guān)標(biāo)志物的診斷試劑盒，其特征在于，所 述的捕獲抗體和檢測抗體是包含針對以下6種自由組合的心腦血管疾病相關(guān)標(biāo)志物的捕 獲抗體和檢測抗體可溶性P選擇素sP-Selectin、可溶性血管細(xì)胞粘附分子lsVCAMl、白介素8IL8、白介素 18 IL18、白介素 10IL10、白介素 1 β ILl β。
8.—種如權(quán)利要求6或7所述的診斷試劑盒在檢測體外樣品中心腦血管疾病相關(guān)標(biāo)志 物的存在和含量中的應(yīng)用，以及在心腦血管疾病的危險因素篩查或預(yù)測、診斷檢測、療效監(jiān) 測和預(yù)后判斷中的應(yīng)用。
9.一種如權(quán)利要求6或7所述的診斷試劑盒在除心腦血管疾病以外的其他疾病的診斷 檢測或預(yù)測中應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種心腦血管疾病相關(guān)標(biāo)志物的聯(lián)合并行檢測方法及其診斷試劑盒，聯(lián)合并行檢測方法的特征是能夠一次性檢測同一個樣品中的多種相關(guān)標(biāo)志物，即通過液相芯片的制備，形成“信號標(biāo)記的檢測抗體-心腦血管疾病相關(guān)標(biāo)志物-捕獲抗體-微球”的四聯(lián)復(fù)合體，通過檢測四聯(lián)復(fù)合體中不同微球的標(biāo)記信號，從而確定待檢測樣品中各種不同的心腦血管疾病相關(guān)標(biāo)志物的存在及含量。本發(fā)明還公開了該診斷試劑盒的組成成分及該診斷試劑盒的應(yīng)用。本發(fā)明所述的方法及試劑盒具有高通量性、高靈敏度和特異性、檢測快速準(zhǔn)確等突出優(yōu)點，能夠?qū)π哪X血管疾病相關(guān)的多種標(biāo)志物同時進(jìn)行定性和定量檢測。
文檔編號G01N33/546GK102121936SQ201010598428
公開日2011年7月13日 申請日期2010年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月21日
發(fā)明者莫曉月, 邵棠 申請人:江蘇邁迪基因生物科技有限公司