本發(fā)明涉及生物技術(shù)領域，尤其是一種基于實時熒光定量PCR的豬LYRM1基因組織表達譜的建立方法。

背景技術(shù)：

亮氨酸酪氨酸精氨酸基序1（LYR motif containing l, LYRM1）基因是應用抑制性差減雜交技術(shù)篩選肥胖者與健康人群腹膜脂肪組織的差異表達基因時所篩選出的一個基因。該基因高表達于肥胖者脂肪組織，可促進前體脂肪細胞的增殖、抑制前體脂肪細胞的凋亡；過表達LYRM1基因可引起成熟脂肪細胞線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)損傷和功能障礙，同時導致成熟脂肪細胞胰島素刺激下葡萄糖攝取率的降低；LYRM1基因的沉默可影響成熟脂肪細胞線粒體形態(tài)。在豬上，豬LYRM1基因完整CDS區(qū)序列為384 bp，編碼122個氨基酸，但LYRM1基因表達及其與生產(chǎn)性能關系的研究尚未見到相關報道。

研究還發(fā)現(xiàn)LYRM1基因會通過影響脂肪細胞中線粒體的代謝關鍵酶基因表達參與調(diào)解脂肪細胞的代謝，這提示LYRM1基因在豬的生長發(fā)育過程中，很可能通過影響脂肪細胞代謝進而影響豬肉IMF的沉積，但其生物學機理仍不清楚。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是：提供一種基于實時熒光定量PCR的豬LYRM1基因組織表達譜的建立方法，它具有操作簡便、快速高效、敏感性高、特異性強、有效解決了PCR污染的問題、自動化程度高等特點，比采用其它方法來建立組織表達譜適應性更強。

本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的：基于實時熒光定量PCR的豬LYRM1基因組織表達譜的建立方法，采用Trizol法分別提取已屠宰的豬的9種組織的總RNA，所述的9種組織包括心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、大腸、小腸、胃及背最長??；并對提取的總RNA進行cDNA的反轉(zhuǎn)錄合成；以上述cDNA為模板，分別對LYRM1和GAPDH進行常規(guī)PCR擴增；LYRM1基因上游引物的序列為5’- AGATGGAAGACACCGTGAAAGAG-3’， LYRM1基因下游引物的序列為5’-GCCTTGGATAGGGAATCTGGTAG- 3’； GAPDH基因上游引物的序列為5’ -ACTCACTCTTCTACCTTTGATGCT -3’， GAPDH基因下游引物的序列為5’ -TGTTGCTGTAGCCAAATTCA- 3’； 將cDNA進行2倍比稀釋后，將其作為模板，進行實時熒光定量PCR擴增，獲得標準曲線；熒光定量PCR每個樣品，并用ddH₂O做陰性對照；采用2^-△△Ct定量分析方法對豬LYRM1基因在不同組織進行差異表達量分析，構(gòu)建組織表達譜。

所述的對LYRM1基因和GAPDH基因進行實時熒光定量PCR擴增時，PCR反應條件為：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性10 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個循環(huán)，每個循環(huán)末讀板采集一次熒光信號；然后95 ℃變性30 s；最后60℃ 保持5 s，每上升0.5 ℃采集一次熒光信號，逐漸升溫至95 ℃后反應結(jié)束；反應體系為20 μL：2×UItraSYBR Mixture 10 μL, cDNA模板0.8 μL，上、下游引物各0.4 μL，加Nuclease Free Water 8.4 μL。

所述的構(gòu)建組織表達譜，具體是：首先計算各組織樣品的目的基因LYRM1基因與內(nèi)參基因GAPDH基因的Ct差值△Ct，△Ct=△Ct_目的基因-△Ct_{內(nèi)參基因}，然后計算每個組織樣品△Ct平均值，選取脾臟組織為對照，用其它組織樣△Ct減去脾臟組織的△Ct，即△△Ct=（△△Ct_目的基因-△△Ct_{內(nèi)參基因}）試驗組-（△△Ct_目的基因-△△Ct_{內(nèi)參基因}）對照組。

由于采用了以上技術(shù)方案，本發(fā)明應用實時熒光定量PCR技術(shù)構(gòu)建了一套適宜的LYRM1基因組織表達譜建立方法，通過該方法建立豬LYRM1基因在不同組織中的表達譜，具有操作簡便、快速高效、敏感性高、特異性強的特定、并且有效解決了PCR污染的問題，且自動化程度高，比采用其它方法來建立組織表達譜適應性更強，對于闡明LYRM1基因表達的作用機理具指導作用及參考意義。

附圖說明

圖1為豬LYRM1基因熒光定量PCR標準曲線；

圖2為豬GAPDH基因熒光定量PCR標準曲線；

圖3為豬LYRM1基因的擴增曲線與溶解曲線；

圖4為豬GAPDH基因的擴增曲線與溶解曲線；

圖5為豬LYRM1基因各組織的相對表達譜。

具體實施方式

本發(fā)明的實施例：基于實時熒光定量PCR的豬LYRM1基因組織表達譜的建立方法，

實時熒光定量PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；HiFiScript cDNA第一鏈合成試劑盒、、UItraSYBR Mixture(With ROX)熒光定量試劑盒購于北京康為試劑生物科技有限公司；采用美國Bio公司CFX96實時熒光定量PCR儀。

（1）豬各組織RNA提取

取6頭豬9種組織（心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、大腸、小腸、胃、背最長?。悠?0-100 mg，迅速置于液氮預冷的玻璃勻漿器中，迅速研磨成粉末狀。吸取1000 μl Trizol 于勻漿管中，吹打均勻后吸出于離心管中。多個樣品如此重復，然后加入200 μL氯仿。

震蕩混勻30s，室溫靜置5 min以上；12000 rpm 4℃離心15 min，吸取上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中，加入500 μl異丙醇，震蕩30 s，室溫靜置10 min，12000 rpm 4 ℃離心10 min。

棄除上清液，加入1ml預冷75％乙醇，震蕩混勻沉淀。12000rpm室溫離心2 min后，再吸棄上清液，加入1ml預冷75％乙醇；震蕩后12000rpm室溫離心2 min。

棄除上清液，倒置于濾紙后常溫10 min晾干；用30μL DEPC處理水溶解。

（2）cDNA的反轉(zhuǎn)錄合成

按照HiFiScript cDNA第一鏈合成試劑盒說明書合成cDNA第一鏈，體系為20 μL：dNTP Mix(2.5mM Each) 4 μL，Primer Mix 2 μL，5×RT Buffer 4 μL，DTT(0.1M) 2 μL，HiFiScript (200U/μL)1 μL，RNA Template 2 μL，RNase-Free Water 5 μL。42℃孵育45 min后，85孵育5 min，置于冰上冷卻，-20℃長期保存。

（3）引物設計

參照專利201510499172.2所獲得的豬LYRM1基因CDS區(qū)序列及NCBI數(shù)據(jù)庫中豬GAPDH基因序列，運用NCBI數(shù)據(jù)庫Primer-Blast設計熒光定量引物，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

LYRM1上游引物5’- AGATGGAAGACACCGTGAAAGAG-3’

LYRM1下游引物5’-GCCTTGGATAGGGAATCTGGTAG- 3’

GAPDH上游引物5’ -ACTCACTCTTCTACCTTTGATGCT -3’

GAPDH下游引物5’ -TGTTGCTGTAGCCAAATTCA- 3’

（4）標準曲線的建立

將cDNA混池后進行2倍比稀釋作為模板，進行實時熒光定量PCR擴增，獲得標準曲線。

（5）熒光定量PCR檢測方法的優(yōu)化和建立

由標準曲線可見，LYRM1基因的擴增效率E=102.8%，相關系數(shù)R²=0.999（圖1）；GAPDH基因擴增效率E=100.5%，相關系數(shù)R²=0.998（圖2）。說明LYRM1和GAPDH基因擴增效率基本相同，可用于△△Ct相對定量PCR分析。由溶解曲線表明，LYRM1和GAPDH基因片段溶解曲線均出現(xiàn)單峰（圖3），無非特異性擴增產(chǎn)物及引物二聚體峰出現(xiàn)，說明引物特異性好，可用于后續(xù)試驗。

（6）檢測豬LYRM1基因在不同組織中的表達差異

20 μL反應體系：2×UItraSYBR Mixture 10 μL， cDNA模板0.8 μL，上、下游引物各0.4 μL，加Nuclease Free Water 8.4 μL，使用熒光定量PCR儀進行定量分析。熒光定量PCR反應程序：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性10 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個循環(huán)，每個循環(huán)末讀板采集一次熒光信號；然后95 ℃變性30 s；最后60℃ 保持5 s，每上升0.5 ℃采集一次熒光信號，逐漸升溫至95 ℃后反應結(jié)束。熒光定量PCR每個樣品設3次重復，并用ddH₂O做陰性對照。

（7）豬LYRM1基因組織表達譜構(gòu)建

采用2^-△△Ct定量分析方法對豬LYRM1基因在9個組織中進行差異表達量分析，構(gòu)建組織表達譜。首先計算各組織樣品的目的基因與內(nèi)參基因的Ct差值（△Ct=△Ct_目的基因-△Ct_{內(nèi)參基因}），然后計算每個組織樣品△Ct平均值，選取脾臟組織為對照，用其它組織樣△Ct減去脾臟組織的△Ct，即△△Ct=（△△Ct_目的基因-△△Ct_{內(nèi)參基因}）試驗組-（△△Ct_目的基因-△△Ct_{內(nèi)參基因}）對照組，最后用2-△△Ct法計算各組織表達結(jié)果并構(gòu)建表達譜。

本發(fā)明所述并不限于具體實施方式中所述的實施例，本領域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案得出其他的實施方式，同樣屬于本發(fā)明的技術(shù)創(chuàng)新范圍。顯然本領域的技術(shù)人員可以對本發(fā)明進行各種改動和變型而不脫離本發(fā)明的精神和范圍。這樣，倘若本發(fā)明的這些修改和變型屬于本發(fā)明權(quán)利要求及其等同技術(shù)范圍內(nèi)，則本發(fā)明也意圖包含這些改動和變型在內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

序列表

<110> 貴州大學

<120> 基于實時熒光定量PCR的豬LYRM1基因組織表達譜的建立方法

<130> nm:

<160> 4

<170> PatentIn version

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 參照專利201510499172.2所獲得的豬LYRM1基因CDS區(qū)序列，運用NCBI數(shù)據(jù)庫Primer-Blast設計熒光定量引物，以用PCR擴增。

<400> 1

AGATG GAAGA CACCG TGAAA GAG 23

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>參照專利201510499172.2所獲得的豬LYRM1基因CDS區(qū)序列，運用NCBI數(shù)據(jù)庫Primer-Blast設計熒光定量引物，以用PCR擴增。

<400> 2

GCCTT GGATA GGGAA TCTGG TAG 23

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>參照豬GAPDH基因CDS區(qū)序列，運用NCBI數(shù)據(jù)庫Primer-Blast設計熒光定量引物，以用PCR擴增。

<400> 3

ACTCA CTCTT CTACC TTTGA TGCT 24

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>參照豬GAPDH基因CDS區(qū)序列，運用NCBI數(shù)據(jù)庫Primer-Blast設計熒光定量引物，以用PCR擴增。

<400> 4

TGTTG CTGTA GCCAA ATTCA 20