本發(fā)明涉及一種檢測(cè)外源基因插入位點(diǎn)的方法。
背景技術(shù)：
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動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)目前主要應(yīng)用于生產(chǎn)珍貴蛋白，基因治療，器官移植，動(dòng)物品種改良和建立疾病模型等方面，已經(jīng)獲得了羊，牛，小鼠，豬等多種轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。成功構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型之后，確定外源基因的整合位點(diǎn)是對(duì)后續(xù)外源基因功能探討和表型研究的重要前提條件之一。目前對(duì)外源基因的檢測(cè)方法主要有PCR法、Southern Blot印跡法和DNA斑點(diǎn)雜交法。PCR法是通過在體外擴(kuò)增外源基因DNA片段，從而對(duì)外源基因的整合位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)。這種方法需要的樣本少，操作簡(jiǎn)單并且靈敏度高，所以是最常用的檢測(cè)手段。但這種方法容易出現(xiàn)假陽(yáng)性和重復(fù)性差。Southern Blot法是通過外源基因特異性探針與附著在固相支持物上的經(jīng)酶切、電泳分離的變性DNA鏈雜交，從而檢測(cè)出樣品中是否含有外源基因目的DNA片段。這種方法靈敏準(zhǔn)確但是操作十分復(fù)雜，而且費(fèi)用高昂。DNA斑點(diǎn)雜交法是將外源基因特異性探針與固相支持物上的待測(cè)DNA樣品雜交，從而在樣品中檢測(cè)外源基因的有無(wú)。為避免假陽(yáng)性，外源基因的探針應(yīng)與宿主基因組DNA無(wú)同源性。該方法簡(jiǎn)便快捷，對(duì)樣品的要求純度低，尤其對(duì)大批子代動(dòng)物的粗篩頗具優(yōu)越性。但該種方法無(wú)法達(dá)到對(duì)外源基因的準(zhǔn)確定位。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
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本發(fā)明的目的是提供一種檢測(cè)外源基因插入位點(diǎn)的方法。
上述的目的通過以下的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
一種檢測(cè)外源基因插入位點(diǎn)的方法，該方法包括如下步驟：
（一）轉(zhuǎn)MC4R基因細(xì)胞系的獲得；
將豬的黑素皮質(zhì)素受體4基因作為外源基因，豬的腎源PK15細(xì)胞系作為宿主細(xì)胞，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法，將連入到pcDNA3.1（+）真核表達(dá)載體上的pcDNA（+）-MC4R真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到PK15細(xì)胞系中，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后，進(jìn)行單克隆細(xì)胞株的篩選，最后富集單克隆細(xì)胞，提取RNA后，將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA；
（二）接頭引物及特異性引物序列設(shè)計(jì)；
①設(shè)計(jì)并合成接頭JTf和JTr，接頭序列為：
JTf：5'- GTAATACGACTCACTATAGGGCACGCGTGGTCGACGGCC
CGGGCTGGT- 3'，
JTr：5'-PO4 –ACCAGCCC –NH2-3'；
②根據(jù)接頭序列設(shè)計(jì)并合成接頭引物AP1和AP2，引物序列為：
AP1：5'-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3'，
AP2：5'- ACTATAGGGCACGCGTGGT -3'；
③根據(jù)插入基因片段啟動(dòng)子區(qū)序列pcDNA3.1（+）PCMV區(qū)，設(shè)計(jì)并合成特異性引物GSP1和GSP2，引物序列為：
GSP1:5'-TAATAGGGTGGTGACAATGGTTTCTG-3，
GSP2: 5'- GTCGGTCAAGCCTTGCCTTGTTGTAG -3；
被檢測(cè)的轉(zhuǎn)基因樣品，不是通過pcDNA3.1（+）表達(dá)載體實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)入的，GSP1和GSP2根據(jù)載體的啟動(dòng)子區(qū)序列設(shè)計(jì)；
（三）基因組的酶切與純化；
隨機(jī)選取1個(gè)陽(yáng)性轉(zhuǎn)MC4R基因細(xì)胞，采用苯酚-氯仿方法提取基因組DNA，將基因組DNA濃度校正到100ng/μL，取100μL基因組DNA，加入限制性內(nèi)切酶Dra I，在37 ℃的條件下進(jìn)行過夜酶切；
（四）純化后的基因組DNA連接接頭；
將酶切后的基因組DNA進(jìn)行純化后取4μL，加入25μM接頭JTf和JTr1.9μL，在16 ℃的條件下進(jìn)行過夜連接；
（五）兩輪PCR擴(kuò)增檢測(cè)；
將上一步所得的連接產(chǎn)物內(nèi)加入72 μLTE進(jìn)行稀釋，并在70 ℃的條件下反應(yīng)5min，以此作為PCR模板，以AP1和SP1為引物進(jìn)行第1輪PCR擴(kuò)增；對(duì)擴(kuò)增出條帶的產(chǎn)物，用去離子水50倍稀釋作為第2輪PCR擴(kuò)增模板，以AP2和SP2為引物做第2輪PCR擴(kuò)增；
（六）克隆測(cè)序與序列比對(duì)；
將第2輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的目的條帶回收并純化，連入pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌后，搖菌，測(cè)序，將測(cè)得的結(jié)果采用BLAST方法與已提交的豬基因組序列進(jìn)行比對(duì)，經(jīng)DraI處理過的DNA片段與pcDNA3.1（+）-MC4R序列完全一致。
本發(fā)明的有益效果：
本發(fā)明提供一種轉(zhuǎn)基因動(dòng)物外源基因整合位點(diǎn)的檢測(cè)方法，該方法通過特異性的設(shè)置6條特異性引物進(jìn)行連接介導(dǎo)PCR，通過對(duì)PCR產(chǎn)物序列的測(cè)定，以判斷外源基因在宿主基因組上的整合位點(diǎn)。
具體實(shí)施方式：
實(shí)施例1：
一種檢測(cè)外源基因插入位點(diǎn)的方法，該方法包括如下步驟：
（一）轉(zhuǎn)MC4R基因細(xì)胞系的獲得；
將豬的黑素皮質(zhì)素受體4基因作為外源基因，豬的腎源PK15細(xì)胞系作為宿主細(xì)胞，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法，將連入到pcDNA3.1（+）真核表達(dá)載體上的pcDNA（+）-MC4R真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到PK15細(xì)胞系中，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后，進(jìn)行單克隆細(xì)胞株的篩選，最后富集單克隆細(xì)胞，提取RNA后，將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA；
（二）接頭引物及特異性引物序列設(shè)計(jì)；
①設(shè)計(jì)并合成接頭JTf和JTr，接頭序列為：
JTf：5'- GTAATACGACTCACTATAGGGCACGCGTGGTCGACGGCC
CGGGCTGGT- 3'，
JTr：5'-PO4 –ACCAGCCC –NH2-3'；
②根據(jù)接頭序列設(shè)計(jì)并合成接頭引物AP1和AP2，引物序列為：
AP1：5'-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3'，
AP2：5'- ACTATAGGGCACGCGTGGT -3'；
③根據(jù)插入基因片段啟動(dòng)子區(qū)序列pcDNA3.1（+）PCMV區(qū)，設(shè)計(jì)并合成特異性引物GSP1和GSP2，引物序列為：
GSP1:5'-TAATAGGGTGGTGACAATGGTTTCTG-3，
GSP2: 5'- GTCGGTCAAGCCTTGCCTTGTTGTAG -3；
被檢測(cè)的轉(zhuǎn)基因樣品，不是通過pcDNA3.1（+）表達(dá)載體實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)入的，GSP1和GSP2根據(jù)載體的啟動(dòng)子區(qū)序列設(shè)計(jì)；
（三）基因組的酶切與純化；
隨機(jī)選取1個(gè)陽(yáng)性轉(zhuǎn)MC4R基因細(xì)胞，采用苯酚-氯仿方法提取基因組DNA，將基因組DNA濃度校正到100ng/μL，取100μL基因組DNA，加入限制性內(nèi)切酶Dra I，在37 ℃的條件下進(jìn)行過夜酶切；
（四）純化后的基因組DNA連接接頭；
將酶切后的基因組DNA進(jìn)行純化后取4μL，加入25μM接頭JTf和JTr1.9μL，在16 ℃的條件下進(jìn)行過夜連接；
（五）兩輪PCR擴(kuò)增檢測(cè)；
將上一步所得的連接產(chǎn)物內(nèi)加入72 μLTE（Tris:EDTA=10:1, pH7.5）進(jìn)行稀釋，并在70 ℃的條件下反應(yīng)5min，以此作為PCR模板，以AP1和SP1為引物進(jìn)行第1輪PCR擴(kuò)增；
第一輪PCR反應(yīng)體系為：連接產(chǎn)物取1μL，AP1取1μL，SP1取1μL，LA Taq酶取1μL，Buffer取5μL，dNTP取1μL；
反應(yīng)條件為：7個(gè)循環(huán)：94 ℃，25秒；72 ℃，3 分鐘；32 個(gè)循環(huán)：94 ℃，25秒；67℃，10 分鐘；
對(duì)擴(kuò)增出條帶的產(chǎn)物，用去離子水50倍稀釋作為第2輪PCR擴(kuò)增模板，以AP2和SP2為引物做第2輪PCR擴(kuò)增；
第二輪PCR反應(yīng)體系為：稀釋后的1次PCR產(chǎn)物1μL，AP2取1μL，SP2取1μL，LA Taq酶取1μL，Buffer取5μL，dNTP取1μL；
反應(yīng)條件為：5個(gè)循環(huán)：94 ℃， 25秒；72 ℃，3分鐘；20個(gè)循環(huán)：94 ℃，25秒；67 ℃，10 分鐘；
（六）克隆測(cè)序與序列比對(duì)；
將第2輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的目的條帶回收并純化，連入pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌后，搖菌，測(cè)序，將測(cè)得的結(jié)果采用BLAST方法與已提交的豬基因組序列進(jìn)行比對(duì)，經(jīng)DraI處理過的DNA片段與pcDNA3.1（+）-MC4R序列完全一致。