專利名稱：豬基因組中外源基因整合位點的檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及外源基因整合位點的檢測方法。
背景技術：
人們將所需要的外源目的基因通過質?；蚰孓D錄病毒等載體導入宿主細胞中，使 得外源基因與宿主基因組穩(wěn)定的整合在一起，其即可隨宿主基因組的復制而擴增，又能在 體內得到表達，并能穩(wěn)定地遺傳給后代，這種攜帶外源基因的動物被稱為轉基因動物。轉基 因動物所有的細胞都應整合有外源基因，且能將外源基因遺傳給子代，如果外源基因只整 合入動物的部分細胞或組織器官的基因組，則稱為嵌合體。整合入宿主基因組的目的基因 稱為外源基因或轉(植)基因(安曉榮，2001)。經過近四十年的發(fā)展，人們相繼成功培育了攜 帶有不同外源基因的轉基因兔、羊、豬、牛、魚、雞、小鼠、大鼠等轉基因動物。目前，轉基因技 術已成為當今生命科學的一個發(fā)展最快、最熱門的學科，其在功能基因組研究、定向育種、 轉基因生物反應器、建立人類疾病模型等方面都發(fā)揮了巨大作用。外源基因整合入受體基因組后，整合一般具有穩(wěn)定性，大部分以孟德爾方式遺傳 給后代，但有時外源基因未整合到染色體上，而是以附加體形式存在，不穩(wěn)定；目前認為基 因表達的強弱與整合的拷貝數(shù)無關，而與整合位置有關；整合也可能會引起外源基因位點 的側翼序列發(fā)生重排、缺失、重復或異位現(xiàn)象；外源基因的整合可能會造成宿主細胞基因突 變出現(xiàn)新表現(xiàn)型，也可能會中斷宿主細胞一些必須基因的轉錄過程，或激活有害基因，導致 胚胎畸形或死亡。一般認為，外源基因的整合位點對其表達水平有著至關重要的影響，有 時同樣一個外源基因可在一定的整合位點正常表達，而在另一些位點不表達或低水平表達 (王繼英，2002)。因此，外源基因整合位點的檢測是對后續(xù)研究和探討外源基因表型和功能 以及選擇適當?shù)膫€體擴群十分重要的。實驗證明，外源基因整合到宿主基因組大多發(fā)生在DNA復制的S期，可能以單位點 或多位點的形式隨機地插入受體基因組中的任意位置，因而存在“有效整合”、“沉默整合” 和“毒性整合”三種整合狀態(tài)，其表達水平也非均一(吳波，2003)。目前，外源基因整合位點 具有位置效應已被公認。用人球蛋白基因進行轉基因小鼠的研究結果表明，不同轉基 因小鼠中外源基因所整合的染色體位點不同，在這些不同的轉基因小鼠中，所整合的外源 基因有的表達活性很低，有的則根本無表達，其中只有當球蛋白基因整合在小鼠第3號 染色體上時，才可在轉基因小鼠的骨骼肌中表達。其它轉基因動物如轉基因魚、轉基因羊和 轉基因牛中外源基因的整合與表達也有類似現(xiàn)象。這種位置效應不僅影響外源基因的表達 水平，而且也影響外源基因的發(fā)育模式，以致在具有同一外源基因但不同整合位點的轉基 因小鼠中，外源基因的轉錄在不同時期和不同組織中被激活。還有研究表明，如果外源基因 整合位點位于異染色質區(qū)(如LINE序列)，其表達會被抑制或完全沉默；但如果外源基因整 合位點位于轉錄活躍的染色質區(qū)(如小鼠中的Rosa26區(qū))，其也會廣泛且高水平的表達。目前，豬基因組測序已經完成，豬基因組中共有19對染色體，大約2. 7億個堿基， 里面包含大約3萬多個基因，如何在基因組中找到能夠適合外源基因穩(wěn)定整合的位點是目前研究的重點。轉基因克隆技術就是將核移植技術與轉基因技術相結合來生產轉基因動物，首先 將外源基因導入到供體細胞中，然后篩選擇陽性的細胞作為核供體做核移植，如此獲得動 物即為轉基因克隆動物。1997年2月，Wilmut等利用核移植技術獲得世界上首例成年體細 胞克隆綿羊——“Dolly”，同年又利用轉基因克隆技術獲得世界首例體細胞核移植轉基因 克隆綿羊——“Polly”。目前，國外通過體細胞核移植技術路線已經獲得了表達多種基因 的轉基因牛(Cibelli, 1998; WallRJ, 2005)、羊(SchniekeAE, 1997 ；McCreathKJ, 2000)和豬 (Lai, 2002; DaiY, 2002 ； PhelpsCJ, 2003; Hao, Y. H, 2006)等。國內也通過該技術路線獲得了 轉基因山羊(王海等，2004)和轉基因牛(龔國春等，2003)。2006年10月，劉忠華等獲得國 內首例成體體細胞克隆豬，同年12月劉忠華等又獲得國內第一例綠色熒光蛋白轉基因克 隆豬，這標著我國轉基因克隆技術也已達到國際水平。外源基因整合入基因組后，需要對外源基因的整合位點進行鑒定，檢測外源基因 的基本方法是通過分子生物學和細胞生物學的方法對外源基因序列進行檢測，分析外源基 因的整合狀況(湯家銘，2002)。該方法操作復雜，人為誤差大，檢測結果不夠準確。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有外源基因整合位點的檢測方法操作復雜，誤差較大 的問題，而提供了豬基因組中外源基因整合位點的檢測方法。本發(fā)明豬基因組中外源基因整合位點的檢測方法按照以下步驟進行一、 提取轉基因豬子代基因組DNA，分別針對TgInSl、TgInS2和TgInS3外源基因插入 基因組中的位點進行PCR擴增，其中，針對TgInSl的引物為P-TgInSlU上游引物 5，-CTATTGCCTTGGCAGACTGACCTCT-3，，P-TgInSlD 下游引物5，-ACAGATCAATGGAATAGAACAGA GGG-3'，PCR擴增條件為94°C預變性3min、94°C變性30s、55 °C退火30s、72°C延伸lmin、共 30 個循環(huán)、72°C延伸 5min、4°C保溫 Ih ；PCR 反應體系 25 μ 1 由 0. 2 mM dNTP、0. 5 U Taq DNA 聚合酶、100 ng豬基因組DNA、1. 25 μ M 的P-TgInSlU上游引物、1. 25 μ M 的 P-TgInSlD 下游引物、IX PCR緩沖液和余量的純凈水組成；針對TgInS2的引物為P-TgInS2U上游引 物5，-CTGTTCTGCCTAAACCGCATCACCATG-3，，P_TgInS2D 下游引物5，-GCCTGGAGACGCCATCC ACGCTGTTT-3，，PCR 擴增條件為94°C預變性 3min、94°C 變性 30s、55 °C退火 30s、72°C延 伸lmin、共30個循環(huán)、72°C延伸5min、4°C保溫Ih ；PCR反應體系25 μ 1由0. 2 mM dNTP、 0.5 U Taq DNA 聚合酶、100 ng 豬基因組 DNA、1. 25 μ M 的 P_TgInS2U 上游引物、1. 25 μ M的P-TgInS2D下游引物、IX PCR緩沖液和余量的純凈水組成；針對TgInS3的引物為 P-TgInS3U 上游引物5，-CCCCGTGAGTCAAACCGCTATCCA-3，，P_TgInS3D 下游引物5，-TGCATT CTGTCGATACGCCACGAGGAC-3，，PCR 擴增條件為94°C預變性 3min、94°C 變性 30s、55 °C退火 30s、72°C延伸lmin、共30個循環(huán)、72°C延伸5min、4°C保溫Ih ；PCR反應體系25 μ 1由0. 2 mM dNTP、0.5 U Taq DNA 聚合酶、100 ng豬基因組DNA、1. 25 μ M 的 P_TgInS2U上游引物、 1.25 μ M的P-TgInS3D下游引物、1 X PCR緩沖液和余量的純凈水組成；二、步驟一的PCR 反應結果進行電泳檢測，即實現(xiàn)了豬基因組中外源基因整合位點的檢測。本發(fā)明中轉基因豬子代中外源基因為綠色熒光蛋白基因，本發(fā)明方法采用PCR法 是在體外擴增外源基因特異DNA片段，從而對外源基因進行檢測，其原理是經過變性、退火及延伸三個過程，在短時內可將兩引物間模板擴增至百萬倍。在PCR反應中這個過程是靠 溫度的調整和聚合酶的共同作用完成的。由于PCR所需樣品少，靈敏度高而且操作簡便因 而是最長用的轉基因動物外源基因整合、表達的檢測方法。本發(fā)明的方法操作簡單，且與現(xiàn) 有的外源基因整合位點的檢測方法相比較，人為誤差小，檢測結果準確。


圖1為具體實施方式
一 Junction PCR凝膠電泳結果中K25-2及其子代整合位點 下游側翼序列擴增結果的電泳圖，Γ7泳道為子代整合位點下游側翼序列擴增結果，M為 DL2000 ；圖2為具體實施方式
一 Junction PCR凝膠電泳結果中K25-2及其子代整合位點 上游側翼序列擴增結果的電泳圖，M為DL2000廣7泳道為子代整合位點下游側翼序列擴 增結果；圖3為具體實施方式
一中1st PCR反應產物的電泳圖，1-6泳道為6種簡并引物 (AD1-AD6)的擴增結果，M為DL15000 ；圖4為具體實施方式
一中2nd PCR反應產物的電泳 圖，1-6泳道為6種簡并引物(AD1-AD6)的擴增結果，M為DL15000 ；圖5為具體實施方式
一中 3rdPCR反應產物的電泳圖，1-6泳道為6種簡并引物(AD1-AD6)的擴增結果，M為DL15000。
具體實施例方式本發(fā)明技術方案不局限于以下所列舉具體實施方式
，還包括各具體實施方式
間的 任意組合。
具體實施方式
一本實施方式豬基因組中外源基因整合位點的檢測方法按照以下 步驟進行一、提取轉基因豬子代基因組DNA，分別針對TglnSl、TgInS2和TgInS3外源基 因插入基因組中的位點進行PCR擴增，其中，針對TgInSl的引物為P-TgInSlU上游引物 5，-CTATTGCCTTGGCAGACTGACCTCT-3，，P-TgInSlD 下游引物5，-ACAGATCAATGGAATAGAACAGA GGG-3'，PCR擴增條件為94°C預變性3min、94°C變性30s、55 °C退火30s、72°C延伸lmin、共 30 個循環(huán)、72°C延伸 5min、4°C保溫 Ih ；PCR 反應體系 25 μ 1 由 0. 2 mM dNTP、0. 5 U Taq DNA 聚合酶、100 ng豬基因組DNA、1. 25 μ M 的P-TgInSlU上游引物、1. 25 μ M 的 P-TgInSlD 下游引物、IX PCR緩沖液和余量的純凈水組成；針對TgInS2的引物為P-TgInS2U上游引 物5，-CTGTTCTGCCTAAACCGCATCACCATG-3，，P_TgInS2D 下游引物5，-GCCTGGAGACGCCATCC ACGCTGTTT-3，，PCR 擴增條件為94°C預變性 3min、94°C 變性 30s、55 °C退火 30s、72°C延 伸lmin、共30個循環(huán)、72°C延伸5min、4°C保溫Ih ；PCR反應體系25 μ 1由0. 2 mM dNTP、 0.5 U Taq DNA 聚合酶、100 ng 豬基因組 DNA、1. 25 μ M 的 P_TgInS2U 上游引物、1. 25 μ M的P-TgInS2D下游引物、IX PCR緩沖液和余量的純凈水組成；針對TgInS3的引物為 P-TgInS3U 上游引物5，-CCCCGTGAGTCAAACCGCTATCCA-3，，P_TgInS3D 下游引物5，-TGCATT CTGTCGATACGCCACGAGGAC-3，，PCR 擴增條件為94°C預變性 3min、94°C 變性 30s、55 °C退火 30s、72°C延伸lmin、共30個循環(huán)、72°C延伸5min、4°C保溫Ih ；PCR反應體系25 μ 1由0. 2 mM dNTP、0.5 U Taq DNA 聚合酶、100 ng豬基因組DNA、1. 25 μ M 的 P_TgInS2U 上游引物、 1.25 μ M的P-TgInS3D下游引物、1 X PCR緩沖液和余量的純凈水組成；二、步驟一的PCR 反應結果進行電泳檢測，即實現(xiàn)了豬基因組中外源基因整合位點的檢測。本實施方式步驟一中的轉基因豬子代為綠色熒光蛋白轉基因豬，本實施方式通過 pEGFP-Cl質粒轉染豬成纖維細胞，獲得穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白基因的陽性細胞，并以此陽性細胞作為體細胞核移植的核供體，利用體細胞核移植技術獲得綠色熒光蛋白轉基因豬。 轉基因豬通過自然交配獲得具有陽性表型的后代豬7只，提取原代及Fl代轉基因豬基因組 DNA,分離鑒定得到豬基因組中綠色熒光蛋白基因整合位點TglnSl、TgInS2和TgInS3。獲得綠色熒光蛋白轉基因豬的具體方法如下 一、轉染綠色熒光蛋白基因的豬成纖維細胞的制備 a、豬胎兒成纖維細胞(PFF)的分離培養(yǎng)
1、取材及處理
首先剖腹取出整個豬子宮，放入預先用70%酒精消過毒的塑料袋內，用泡沫保溫盒帶 回實驗室。然后放入有孔的塑料盆里，用70%酒精噴灑，取出子宮內的胎兒(不要破壞羊膜) 放入含有200IU/ml青霉素和200 μ g /ml鏈霉素的PBS液中，在超凈臺上漂洗2 3遍，用鑷 子夾起胎兒，用滅菌眼科剪剪破羊膜使胎兒流出，放入含100IU/ml青霉素和100μ g/ml鏈 霉素的PBS液中，剪去頭、尾、四肢并去除內臟，剩余組織備用。在超凈臺上，用含100IU/ml青霉素和100 μ g/ml鏈霉素的無菌PBS中將上述預處 理的部分組織漂洗3飛遍，在PBS中將其在無菌的培養(yǎng)皿中用眼科剪剪切成lmm3左右的小 塊。采用胰蛋白酶法消化法培養(yǎng)哈白豬胎兒成纖維細胞。2、消化法培養(yǎng)豬胎兒成纖維細胞(PFF)
待組織塊下沉后，吸去上清，向培養(yǎng)皿中加入含0. 25%胰蛋白酶-0. 04% EDTA的消化 液，置于39°C下消化30min，中間搖勻數(shù)次，消化結束后，收集含有解離細胞的消化液，置于 4°C冰箱內冷卻，在所余組織上再一次加入消化液，重復上述消化步驟五次，并將每次收集 到的含有細胞的消化液混合到一起，離心去上清，重懸于Iml 39°C預溫的D-MEM/F-12培養(yǎng) 液(含20%胎牛血清，2mmol/L谷氨酰胺，100IU/ml青霉素和100 μ g /ml鏈霉素)，吹打均勻 后，用培養(yǎng)液調整細胞密度至5X 105 1X 106個細胞/ml。將培養(yǎng)瓶置于39°C，飽和濕度， 5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 72h后觀察，發(fā)現(xiàn)貼壁后更換一半或全部培養(yǎng)液，此后每兩天更 換一次培養(yǎng)液。3、豬胎兒成纖維細胞傳代
當原代細胞生長至90%匯合時，吸出培養(yǎng)液，用無鈣鎂離子的PBS沖洗廣2遍，加入適 量的0. 25%胰蛋白酶消化液于39°C消化約2 3min，最好不超過5min。在顯微鏡下觀察，待 大部分細胞變圓時，立即加入適量D-MEM/F-12+10%胎牛血清培養(yǎng)液終止消化，輕輕吸打， 制成細胞懸液，IOOOrpm離心5min后棄上清，接種于其他培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。原皿中貼壁較 緊的上皮細胞和未消化的成纖維細胞可繼續(xù)培養(yǎng)。b、脂質體法轉染豬胎兒成纖維細胞(PFF)方法的建立 1、熒光質粒用脂質體法轉染豬成纖維細胞
(1)細胞轉染轉染前24h，將培養(yǎng)的細胞消化稀釋到一定濃度(2X105)，平均分配到 24孔板中的5個孔中，于38. 5°C、飽和濕度、5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)2(T24h，轉染前細胞長到 80^90%匯合。具體操作過程如下將0. 8 μ g pEGFP-Cl質粒DNA溶于50 μ 1無血清的DMEM 中，輕輕混勻；分別將2 μ 1脂質體(用前輕輕搖勻)溶于50 μ 1無血清的DMEM中，輕輕混勻， 然后在5min之內將兩者混合，用移液器輕輕混勻，室溫靜置孵育20min，使DNA-脂質體復 合物形成。之后補加400 μ 1無血清的DMEM，輕輕混勻。用PBS洗欲轉染的細胞兩次，再用 無血清的DMEM洗欲轉染的細胞一次，然后將上述混合液加入細胞中，6h后，倒出轉染液，用
8含20%血清的DMEM取代轉染液，38. 5°C、飽和濕度、5%C 02繼續(xù)培養(yǎng)。24h后，用熒光顯微 鏡觀察。(2)觀察計數(shù)培養(yǎng)24h后，將轉染細胞放在激發(fā)波長為488nm的熒光顯微鏡下觀 察GFP蛋白表達，以放大200倍的顯微鏡視野為標準，計5個顯微鏡視野表達綠色熒光的細 胞數(shù)，算出陽性率，以此評價轉染效率。2、G418對轉染后細胞的篩選
細胞轉染24h后用熒光顯微鏡觀察轉染情況，記錄抗性細胞數(shù)。然后按常規(guī)方法換液 后加入500 μ g/ml的G418，篩選7天，7天后加200 μ g/ml的G418維持篩選。待熒光顯微 鏡下細胞都發(fā)出綠色熒光時，進行消化傳代或凍存。本實驗獲穩(wěn)定整合pEGFP-Cl質粒并有綠色熒光蛋白表達的豬成纖維細胞。二、體細胞核移植和克隆豬的出生 1、體細胞準備
將傳代5 10次的細胞待其長滿，接觸抑制2cT5d后，常規(guī)消化，離心洗滌，最后的細胞 沉淀顯微操作液重懸用作核供體。2、受體卵母細胞去核
利用盲吸法進行成熟卵母細胞去核，即在直徑60mm培養(yǎng)皿蓋中央做一個“8”字型，長 1. 5cm,寬2(T30mm的100 μ 1顯微操作液滴，再用礦物油覆蓋。把供體細胞以及成熟卵母細 胞同時轉入其中于38. 5°C，5% C 02、95%空氣的氣體環(huán)境，飽和濕度平衡15min，然后在裝 配有顯微操作儀及恒溫臺的倒置顯微鏡上用固定吸管(內徑25 35 μ m,外徑10(Γ120 μ m) 吸持卵母細胞，用內徑15 25 μ m的去核/注射針使第一極體處于鐘表1點鐘位置，接著 從3點鐘處進針，吸取第一極體及其臨近1(Γ20%可能含有卵母細胞核的胞質。挑選直徑 15 20 μ m，折光性強，圓形，光滑的體細胞，從去核切口放入卵周隙，用注射針點壓透明帶， 使供體細胞與受體卵的胞膜接觸緊密。每批操作30個卵母細胞，結束后將供體細胞-卵胞 質構成的細胞對(重構卵)轉移到PZM-3中，在38. 5°C, 5% C 02、95%空氣的氣體環(huán)境，飽和 濕度中恢復1. 5 h。3、融合與激活
將恢復好的重構卵分批轉移到融合液中平衡3 min，用融合/激活液洗滌3遍后，每批 5個放入已經鋪滿融合液的融合槽內，用拉制的且尖端很細的實心玻璃針撥動重組卵，使供 體細胞_受體卵細胞膜接觸面與電極平行，用ECM2001融合儀施加一個30 μ s，2. Okv/cm的 直流電脈沖誘導融合同時激活，用PZM-3洗滌5遍，立即轉入礦物油覆蓋的胚胎培養(yǎng)液中， 38. 50C，5% CO2、95%空氣的氣體環(huán)境，飽和濕度培養(yǎng)0. 5 tTl h后取出，在體視顯微鏡下判 定融合。4、胚胎體外培養(yǎng)和綠色熒光蛋白表達檢測
融合的重構胚培養(yǎng)于PZM-3培養(yǎng)液中，培養(yǎng)條件為38. 50C，5% C 02,95%空氣的氣體環(huán) 境，飽和濕度；胚胎構建當天為第零天，培養(yǎng)至第六天統(tǒng)計卵裂胚胎數(shù)(含兩個及兩個以上 卵裂球的胚胎)和囊胚數(shù)目，熒光鏡下計數(shù)具有綠色熒光的囊胚數(shù)。5、胚胎移植
用于觀察全程發(fā)育的重構胚的胚胎移植在電融合后24h之內進行，自然發(fā)情第O天或 第1天的育成母豬用作受體(以出現(xiàn)壓背靜立反射為發(fā)情的第O天)，受體品種為長白、大白或者杜洛克，移植方法為手術法輸卵管深部移植，每頭豬移植至少120枚胚胎。6、妊娠診斷及飼養(yǎng)管理
胚胎移植后，對未返情的受體于28— 30天，進行首次超聲波妊娠檢測。之后每周定時 檢測一次，跟蹤胎兒發(fā)育情況，調整飼養(yǎng)管理，直至轉基因克隆豬出生。7、轉基因克隆豬表型和DNA鑒定
母豬正常妊娠114天后自然分娩，對出生后的個體以手提式紫外觀測燈(UV-5型，波 長365nm，北京智源通生物技術研究所)激發(fā)，觀察體表的綠色熒光蛋白表達情況，對于出 生后死亡的個體，分別取耳部組織、心臟、肺臟、腎臟、脾臟、肌肉的組織，在熒光顯微鏡下檢 測綠色熒光蛋白表達情況，常規(guī)方法提取各組織DNA，以GFP基因序列特異引物進行PCR測 定；上游引物堿基序列為5'-TGA ACC GCA TCG AGC TGA AGG G_3'，下游引物堿基序列為 5，-TCC AGC AGG ACC ATG TGA TCG C_3' ；PCR 反應條件為94°C 3 min ；94°C 30 sec, 68 "C 30 sec,72°C 60 sec (25cycles) ；72 "C 5 min ；4 "C 30min。本實驗獲得能表達綠色熒光蛋白基因的轉基因豬，其中綠色熒光蛋白轉基因豬出 生后2天在365nm波長紫外光激發(fā)下蹄部呈綠色；綠色熒光蛋白轉基因豬出生后2天在 365nm波長紫外光激發(fā)下蹄部及鼻頭呈綠色。對獲得的綠色熒光蛋白基因的轉基因豬進行傳代和鑒定的方法如下 1、轉基因豬后代獲得
K25-2原代轉基因豬與野生型長白豬自然交配，獲得11頭和10頭兩窩Fl子代。2、基因組DNA的提取
使用大連寶生物工程有限公司生產的Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver. 3. 0進行基因組DNA的抽提純化。具體步驟見試劑盒說明書。3、PCR法對Fl子代的鑒定
K25-2原代轉基因豬與野生型長白豬雜交分別獲得11頭和10頭兩窩Fl子 代，以eGFP基因序列特異引物對子代進行PCR測定。上游引物堿基序列為 5，-TGAACCGCATCGAGCTGAAGGG-3，，下游引物堿基序列為5，-TCCAGCAGGACCATGTGATCGC-3，， 產物 308bp。PCR 反應條件為94 °C 3min ； 94 °C 30sec, 68 °C 30sec，72°C Imin (30 cycles) ；72°C 5min ；4°C lh。其中，Junction PCR凝膠電泳結果中K25_2及其子代整合位點下游側翼序列擴增 結果的電泳圖如圖1所示，Κ25-2及其子代整合位點上游側翼序列擴增結果的電泳圖如圖 2 所示。M :DL2000o對轉基因豬整合位點的克隆與分析的方法如下 a、TAIL-PCR對整合位點的檢測
1、引物序列 (1)特異性引物
上游引物堿基序列為SPS1 5' -GCT ACC CGT GAT ATT GCT GAA GAG CTT GGC G_3'； SPS2 5' - GGA GGC TAA CTG AM CAC GGA AGG AGA CM TAC C_3' ；SPS3 5' - CAG CTT GGA GCG AAC GAC CTA CAC CGA ACT-3，。下游引物堿基序列為SPA1 5' - GTT CAC CTT GAT GCC GTT CTT CTG CTT GTC-3' ；SPA2 5'- GCT AGC GGA TCT GAC GGT TCA CTA AAC CAG-3'； SPA3 5' - CGG ATC TGA CGG TTC ACT AAA CCAG CTC TGC-3'。
(2)簡并引物:
ADl 5' -NGT CGA SffG ANA WGA A-3，；AD2 5' -TGff GNA GSA NCA SAG A-3，；AD3 5' -AGff GNA GffA NCA WAG G_3' ；AD4 5'-STT GNT AST NCT NTG C_3' ；AD5 5'-NTC GAS TffT SGff GTT-3' ；AD6 5' -WGT GNA GffA NCA NAG A-3'；其中，N= A, C, G, T ； S= C, G ；W= A, T02、TAIL-PCR反應體系和程序 (1) 1st PCR 反應
反應體系(20μ 1)模板 DNA 1μ 1 (<100ng)，10x PCR 反應緩沖液 2. 0μ 1，2. 5 匪 ol dNTP 為 1· 6μ 1 ,IOymol 引物 SPS1/SPA1 各 2. 5 μ l,30ymol 引物 AD primer 為 2· Ομ 1， 5U/ μ 1 的 LA-Taq DNA 聚合酶 0. 2 μ 1，去離子水 10. 7 μ L·PCR 程序94°C 5min ；94°C 10sec，64°C 30sec，72°C 3min (10 cycles) ;94°C 10 sec, 25 °C 3min，72°C 2. 5min ；94 °C 10sec，64°C 3min，72°C 2. 5min,94°C 10sec，64°C 3min,72°C 2. 5min,94°C 10sec,44°C lmin,72°C 2. 5min (15 cycles) ；72°C 10min,4°C lh。(2)2ndPCR 反應
反應體系(20 μ 1)模板DNA 1 μ 1 200倍稀釋的1st PCR產物，IOx PCR反應緩沖液 2. O μ 1,2. 5mmol dNTP 為 1·6μ1，10 μ mol 引物 SPS2/SPA2 各 2. 5 μ 1，30 μ mol 引物 AD primer 為 2· 0 μ 1，5U/ μ 1 的 LA-Taq DNA 聚合酶 0· 2 μ 1，去離子水 10. 7 μ 1。PCR 程序94°C 5min ；94°C 10sec，64°C 3min，72°C 2. 5min,94°C 10sec，64°C 3min，72°C 2.5min，94°C 10sec，44°C lmin，72°C 2. 5min (12 cycles) ；72 °C IOmin, 4°C lh。(3)3rdPCR 反應
反應體系(20 μ 1):模板DNA 1 μ 1 200倍稀釋的2nd PCR產物，IOx PCR反應緩沖液 2. O μ 1,2. 5mmol dNTP 為 1·6μ1，10 μ mol 引物 SPS3/SPA3 各 2. 5 μ 1，30 μ mol 引物 AD primer 為 2· Ομ 1，5υ/μ 1 的 LA-Taq DNA 聚合酶 0· 2 μ 1，去離子水 12. 7 μ 1。PCR 程序94°C 5min ；94°C 10sec，44°C lmin，72°C 2. 5min (20 cycles) ；72°C 10min,4°C lh。3、擴增產物的回收
將15μ 1 PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將獲得的DNA片段切割下來，用北京天根 生化科技有限公司生產的凝膠回收試劑盒回收。具體步驟見試劑盒說明書。其中，1st PCR 反應產物的電泳圖如圖3所示，2nd PCR反應產物的電泳圖如圖4所示，3rdPCR反應產物的 電泳圖如圖5所示。4、測序與序列分析
測序由Invitrogen公司完成。利用NCBI網站的BLAST軟件與GenBank中的已知豬的核 酸序列和ESTs進行比對做功能和結構上的同源性分析，即確定了整合位點TgInSl、TgInS2 和 TgInS3。本實施方式步驟二中電泳檢測結果顯示任意一組為陽性，即可確定外源基因整合 到位點上了。
具體實施方式
二 本實施方式與具體實施方式
一不同的是TgInSl外源基因插入 基因組中的位點的序列為5，-TTACTATGGGAACATACGTCATTATTGACGTCAATGGGCGGGGGTCGTTGGGCGGTCAGCCAGGCGGGCCATTTACCGTAAGTTATGTAACGCGGAACTCCATATATGGGCTATGAACTAATGACCCC GTAATTGATTACTATTAATAACTAATGCATGAAGCTGGGTACGCGTAAGCTTGGGCCCCTCGAGAGCCTGCTGAAGC TGGGTACGCGTAAGCTTGGGCCCCTCGAGAGCCTGCTTTTTTGTACAAACTTGTTCTATAGTGTCACCTAAATAGGC CTATCCCGCGGCCTATGCTAGAGTCCGGAGGCTGGATCGGTCCCGGTGTCTTCTATGGAGGTCAAAACAGCGTGGAT GGCGTCTCCAGGCGATCTGACGGTTCACTAAACGAGCTCTGATTATAGGGACCTCCCCACCGTACACGCGTTCTTAA AATGTTTTATTTGTAAACGGGCAATCATTGCTTTACATGGGAAAAAAAAAAAAATCCCGTTAAAGTTACTGTGAAAA ATACTCAAAGAGAGGGAGGAGGAAAAAGAAAACAACGAAAACAAACACTACAAAAAAAAAAAAAAAAAGGGCGGCCG CCCGCGATCTAAAACTAGTCCGGACGCGTGGGTCGACGATATAGCCTGCTTTTTTGTACAAACTTGTTCTATAGTGT CACCTAAATAGGCCTATCCCGCGGCCTAGGCTAAAGTCCGGAGGCTGGATCGGTCCCGGTGTCTTCTATGGAGGTCA AAACAGCGTGGATGGCGTCTCCAGGCGATCTGACGGTTCACTAAACGAGCTCTGCTTATATAGACCTCCCACCGTAC ACGCCTACCGCCCATTTGCGTCAATGGGGCGGAGTTGTTACGACATTTTGGAAAGTCCCGTTGATTTTGGTGCCAAA ACAAACTCCCATTGACGTCAATGGGGTGGAGACTTGGAAATCCCCGTGAGTCAAACCGCTATCCACGCCCATTGATG TACTGCCAAAACCGCAAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCG TAATAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTATTCCATAGGCTCCGCCTCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTC AGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCTTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTT CCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTTGCTACTCCACACA-3，。其他步驟及參數(shù)與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
三本實施方式與具體實施方式
一不同的是TgInS2外源基因插入 基因組中的位點的序列為5，-TACCTCCATACTGTTTTCCATAGTGGTTGTACCAATTTATATTCCCACCAA TAGTGCAAGAGGGTTGCCTTTTCCCCACAGCTTCTTTAGCATTTGTTATTTGTAGAATTATTAATGATGACCATTCT GAATGGTGTGAAGTGGTATTTCATTGTAGTTTTGTTTTGCATTTCTCAAATAGTTACTGATGTTGAACATTGTTTTA CTCATGTGCCTACTGGCCATCCATGTGTCTTCTTTGGGGAAATGTTTATTTAGGTCTTCTGCCCGAGATTAAGCCCT TGTCATTTGTATTGTTTGCAATGATTTTCTCCATTCCATTGGTTGTATTTTGTTTGTTTTATGGTGTCCTTTGCTGT GCAAAAGCTTGTAAGTTTGATTCGGTTCAATTGGTTTATTTTTGTTTTTATTTCTATTGCCTTGGCAGACTGACCTC TGAAAATATTTGTATGGTTTATGTCACCACACATTTTGCCTATGTTCTCTTCTATAGCTTTATGGTGTCTTGTCTTC TGTTCAACTTTGTTAAGCCATTTTGAGCTTGTTTATTGTGCATGGTGGGCGGATGTATTCTAGTTTCACTGATGGAC ATGCAGCTGTCCAGTTTTCTGAAAAAAATATCCAGAAGAGATTGTCTTTTCCCCATTTTATATTCCTTCATCTTTTA TTAAAGATTAATTGACCATAGGTATCTGGGTTTATTTCTGGGCCCTCTGTTCTATTCCATTGATCTGTATGTCTGTT TTTGTAACAGTGCCATATTGTCTTGATTACTATAGCTTTGTAAGAAACACCAAAATGTCTGAAGTCTGGAAGAGTTA TGCCTCCAGCTTGCTTATTTTCTTTCCTCCCTCAGGAATATTTGGCAATTCTGGGTCTTTCATAGTTCCATCAACAA TTTTGGATTATTTGTTCTAGTTCTGTAAAAAATGTGGGGTACTTTGTTGTGGTTTGTATTAAATCTGTAGATTGCTT TGGGTAATATGGCCATTTTAGCAATATTAGTTCCTCCAAGCCAGGAGCATGTGATATCTTTCCATTTCTTTGAATCC TCTTTATTTTCCTTGATTGATGTTTTATAGTTCTCTGAGTATAATTCTCTCACCCCCTTGGACAGATGTACTAGGTC TTTTATTTTTGGGGGTGAATCTTTAAAAGGTATTGCTTTAATTTTAATTCATTTTCTAATATTTTATTGTTAATATA AAGAAATGCAGTTGATTTCTGAATATTAATCTTGTATCCTGATACTTTGCTGAATTTTTTGACTCAGGAAGTAGTTT GTTTGTGCAGAGTCCTTAGGGTTTTCTATATATCATATCATGTTATTCAACTTGAGTGACAATTTTACCTCTTGGTT TCCAATTTAGATACCTGTTCTTTCTTTTATTTGTCTGATTTCTGTGGCTAGGACTTCCAATACTATATAAMGCAGTG AG-3’。其他步驟及參數(shù)與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
四本實施方式與具體實施方式
一不同的是TgInS3外源基因插入基因組中的位點的序列為5，-TCACCATGGTAATAGCTTACCGTAAATACTCCACCCATTGACGTCAATGGA AAGTCCCTATTGGCGTTACTATGGGAACATACGTCATTATTGACGTCAATGGGCGGGGGTGTACCGGGCCCATAAGG CCCTATAGTGAGTCGTATTAAGTCGACCATGGTTTTTTCCTCCTGTGTGAAATGTTATCCGCTCACAATTCCACACA ACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGC TCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGG TTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTAT CAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGC CAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCA CAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCT CCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGTTGGGCGTAGAT CCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAACCTGAGGCTATGGCAGGCCTGCCGC CCCGACGTTGGCTGCGAGCCCTGGGCCTTCACCCGAACTTGGGGGGTGGGGTGGGGAAAAGGAGAAACGCGGTGTAT TGGCCCCAAGGGGTCCTCGTGGCGTATCGACAGAATGCAGCCCTGGAACCGACCCACGCGTTTATGAACAACGATCC AACACCGGCGTTTTTATTCTATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAA AGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGG TGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGAC CCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGT ATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGGGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCC TTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAG GATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAA CAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAA ACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCC TTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGCCTTTTATTGGCGTGTCAGCCAGGCGGGCCATTTACCGT AAGTTATGTAACGCGGAACTCCATATATGGGCTATGAACTAATGACCCCGTAATTGATTACTATTAATAACTAATGC ATGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGGAAA-3'。其他步驟及參數(shù)與具體實施方式
一相同。
1權利要求
豬基因組中外源基因整合位點的檢測方法，其特征在于豬基因組中外源基因整合位點的檢測方法按照以下步驟進行一、提取轉基因豬子代基因組DNA，分別針對TgInS1、TgInS2和TgInS3外源基因插入基因組中的位點進行PCR擴增，其中，針對TgInS1的引物為P TgInS1U上游引物5' CTATTGCCTTGGCAGACTGACCTCT 3'，P TgInS1D下游引物5' ACAGATCAATGGAATAGAACAGAGGG 3'，PCR擴增條件為94℃預變性3min、94℃變性30s、55 ℃退火30s、72℃延伸1min、共30個循環(huán)、72℃延伸5min、4℃保溫1h；PCR反應體系25 μl由 0.2 mM dNTP、 0.5 U Taq DNA 聚合酶、100 ng豬基因組DNA、1.25 μM的P TgInS1U上游引物、1.25 μM的P TgInS1D下游引物、1× PCR 緩沖液和余量的純凈水組成；針對TgInS2的引物為P TgInS2U上游引物5' CTGTTCTGCCTAAACCGCATCACCATG 3'，P TgInS2D下游引物5' GCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTT 3'，PCR擴增條件為94℃預變性3min、94℃ 變性30s、55 ℃退火 30s、72℃延伸1min、共30個循環(huán)、72℃延伸 5min、4℃保溫1h；PCR反應體系25 μl由0.2 mM dNTP、 0.5 U Taq DNA 聚合酶、100 ng豬基因組DNA、1.25 μM的P TgInS2U上游引物、1.25 μM的P TgInS2D下游引物、1× PCR 緩沖液和余量的純凈水組成；針對TgInS3的引物為P TgInS3U上游引物5' CCCCGTGAGTCAAACCGCTATCCA 3'，P TgInS3D下游引物5' TGCATTCTGTCGATACGCCACGAGGAC 3'，PCR擴增條件為94℃預變性3min、94℃ 變性30s、55 ℃退火 30s、72℃延伸1min、共30個循環(huán)、72℃延伸 5min、4℃保溫1h；PCR反應體系25 μl由0.2 mM dNTP、 0.5 U Taq DNA 聚合酶、100 ng豬基因組DNA、1.25 μM的P TgInS2U上游引物、1.25 μM的P TgInS3D下游引物、1× PCR 緩沖液和余量的純凈水組成；二、步驟一的PCR反應結果進行電泳檢測，即實現(xiàn)了豬基因組中外源基因整合位點的檢測。
2.根據權利要求1所述的豬基因組中外源基因整合位點的檢測方法，其特征在于 TglnSl外源基因插入基因組中的位點的序列為5’ -TTACTATGGGAACATACGTCATTATTGACGTC AATGGGCGGGGGTCGTTGGGCGGTCAGCCAGGCGGGCCATTTACCGTAAGTTATGTAACGCGGAACTCCATATATGG GCTATGAACTAATGACCCCGTAATTGATTACTATTAATAACTAATGCATGAAGCTGGGTACGCGTAAGCTTGGGCCC CTCGAGAGCCTGCTGAAGCTGGGTACGCGTAAGCTTGGGCCCCTCGAGAGCCTGCTTTTTTGTACAAACTTGTTCTA TAGTGTCACCTAAATAGGCCTATCCCGCGGCCTATGCTAGAGTCCGGAGGCTGGATCGGTCCCGGTGTCTTCTATGG AGGTCAAAACAGCGTGGATGGCGTCTCCAGGCGATCTGACGGTTCACTAAACGAGCTCTGATTATAGGGACCTCCCC ACCGTACACGCGTTCTTAAAATGTTTTATTTGTAAACGGGCAATCATTGCTTTACATGGGAAAAAAAAAAAAATCCC GTTAAAGTTACTGTGAAAAATACTCAAAGAGAGGGAGGAGGAAAAAGAAAACAACGAAAACAAACACTACAAAAAAA AAAAAAAAAAGGGCGGCCGCCCGCGATCTAAAACTAGTCCGGACGCGTGGGTCGACGATATAGCCTGCTTTTTTGTA CAAACTTGTTCTATAGTGTCACCTAAATAGGCCTATCCCGCGGCCTAGGCTAAAGTCCGGAGGCTGGATCGGTCCCG GTGTCTTCTATGGAGGTCAAAACAGCGTGGATGGCGTCTCCAGGCGATCTGACGGTTCACTAAACGAGCTCTGCTTA TATAGACCTCCCACCGTACACGCCTACCGCCCATTTGCGTCAATGGGGCGGAGTTGTTACGACATTTTGGAAAGTCC CGTTGATTTTGGTGCCAAAACAAACTCCCATTGACGTCAATGGGGTGGAGACTTGGAAATCCCCGTGAGTCAAACCG CTATCCACGCCCATTGATGTACTGCCAAAACCGCAAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCC AGCAAAAGGCCAGGAACCGTAATAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTATTCCATAGGCTCCGCCTCCCTGACGAGCATCAC AAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCTTGGAAGCT CCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTTGCTACTCCACAC A-3，。
3.根據權利要求1所述的豬基因組中外源基因整合位點的檢測方法，其特征在于 TgInS2外源基因插入基因組中的位點的序列為5，-TACCTCCATACTGTTTTCCATAGTGGTTGTAC CAATTTATATTCCCACCAATAGTGCAAGAGGGTTGCCTTTTCCCCACAGCTTCTTTAGCATTTGTTATTTGTAGAAT TATTAATGATGACCATTCTGAATGGTGTGAAGTGGTATTTCATTGTAGTTTTGTTTTGCATTTCTCAAATAGTTACT GATGTTGAACATTGTTTTACTCATGTGCCTACTGGCCATCCATGTGTCTTCTTTGGGGAAATGTTTATTTAGGTCTT CTGCCCGAGATTAAGCCCTTGTCATTTGTATTGTTTGCAATGATTTTCTCCATTCCATTGGTTGTATTTTGTTTGTT TTATGGTGTCCTTTGCTGTGCAAAAGCTTGTAAGTTTGATTCGGTTCAATTGGTTTATTTTTGTTTTTATTTCTATT GCCTTGGCAGACTGACCTCTGAAAATATTTGTATGGTTTATGTCACCACACATTTTGCCTATGTTCTCTTCTATAGC TTTATGGTGTCTTGTCTTCTGTTCAACTTTGTTAAGCCATTTTGAGCTTGTTTATTGTGCATGGTGGGCGGATGTAT TCTAGTTTCACTGATGGACATGCAGCTGTCCAGTTTTCTGAAAAAAATATCCAGAAGAGATTGTCTTTTCCCCATTT TATATTCCTTCATCTTTTATTAAAGATTAATTGACCATAGGTATCTGGGTTTATTTCTGGGCCCTCTGTTCTATTCC ATTGATCTGTATGTCTGTTTTTGTAACAGTGCCATATTGTCTTGATTACTATAGCTTTGTAAGAAACACCAAAATGT CTGAAGTCTGGAAGAGTTATGCCTCCAGCTTGCTTATTTTCTTTCCTCCCTCAGGAATATTTGGCAATTCTGGGTCT TTCATAGTTCCATCAACAATTTTGGATTATTTGTTCTAGTTCTGTAAAAAATGTGGGGTACTTTGTTGTGGTTTGTA TTAAATCTGTAGATTGCTTTGGGTAATATGGCCATTTTAGCAATATTAGTTCCTCCAAGCCAGGAGCATGTGATATC TTTCCATTTCTTTGAATCCTCTTTATTTTCCTTGATTGATGTTTTATAGTTCTCTGAGTATAATTCTCTCACCCCCT TGGACAGATGTACTAGGTCTTTTATTTTTGGGGGTGAATCTTTAAAAGGTATTGCTTTAATTTTAATTCATTTTCTA ATATTTTATTGTTAATATAAAGAAATGCAGTTGATTTCTGAATATTAATCTTGTATCCTGATACTTTGCTGAATTTT TTGACTCAGGAAGTAGTTTGTTTGTGCAGAGTCCTTAGGGTTTTCTATATATCATATCATGTTATTCAACTTGAGTG ACAATTTTACCTCTTGGTTTCCAATTTAGATACCTGTTCTTTCTTTTATTTGTCTGATTTCTGTGGCTAGGACTTCC AATACTATATAAAAGCAGTGAG-3’ 。
4.根據權利要求1所述的豬基因組中外源基因整合位點的檢測方法，其特征在于 TgInS3外源基因插入基因組中的位點的序列為5’ -TCACCATGGTAATAGCTTACCGTAAATACTCC ACCCATTGACGTCAATGGAAAGTCCCTATTGGCGTTACTATGGGAACATACGTCATTATTGACGTCAATGGGCGGGG GTGTACCGGGCCCATAAGGCCCTATAGTGAGTCGTATTAAGTCGACCATGGTTTTTTCCTCCTGTGTGAAATGTTAT CCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACT CACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCC AACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTT CGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAA GAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCC GCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAG GCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCT CCCTTCGTTGGGCGTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAACCTGAG GCTATGGCAGGCCTGCCGCCCCGACGTTGGCTGCGAGCCCTGGGCCTTCACCCGAACTTGGGGGGTGGGGTGGGGAA AAGGAGAAACGCGGTGTATTGGCCCCAAGGGGTCCTCGTGGCGTATCGACAGAATGCAGCCCTGGAACCGACCCACG CGTTTATGAACAACGATCCAACACCGGCGTTTTTATTCTATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAA AAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAA TCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCG TGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGGGTGCACGAACCCCCCGT TCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGG CAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAAC TACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAG CTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAA AAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGCCTTTTATTGGCGTGTCAGC CAGGCGGGCCATTTACCGTAAGTTATGTAACGCGGAACTCCATATATGGGCTATGAACTAATGACCCCGTAATTGAT TACTATTAATAACTAATGCATGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGGAAA-3’ 。
全文摘要
豬基因組中外源基因整合位點的檢測方法，本發(fā)明涉及外源基因整合位點的檢測方法。本發(fā)明解決了現(xiàn)有外源基因整合位點的檢測方法操作復雜，誤差較大的問題。方法一、分別針對TgInS1、TgInS2和TgInS3外源基因插入基因組中的位點進行PCR擴增；二、電泳檢測，即實現(xiàn)了豬基因組中外源基因整合位點的檢測。本發(fā)明的方法操作簡單，且與現(xiàn)有的外源基因整合位點的檢測方法相比較，人為誤差小，檢測結果準確。
文檔編號C12Q1/68GK101956003SQ20101025175
公開日2011年1月26日 申請日期2010年8月12日 優(yōu)先權日2010年8月12日
發(fā)明者劉忠華, 孔慶然, 牟彥雙 申請人:東北農業(yè)大學