本發(fā)明屬于水稻功能基因組學應用技術領域，特別是一種水稻生長素響應蛋白基因arp克隆及應用。

背景技術：

水稻是三大糧食作物之一，超過世界人口總數(shù)三分之一的人將其作為食物的主要來源，它在國民經濟中占有舉足輕重的地位。隨著世界人口的不斷增加以及對糧食需求的加大，每年對水稻的需求量都在不斷的上升，在土地面積日趨縮小的今天，如何使水稻穩(wěn)產、高產以緩解因人口的增加給水稻生產帶來的壓力是世界范圍內所面臨的難題，也是擺在科研工作者面前的一個重大科研課題。盡管傳統(tǒng)的遺傳研究和常規(guī)育種已經為水稻的產量提高和品質改善作出了重要貢獻，但是由于稻屬種質資源及常規(guī)育種方法的局限性，給水稻進一步的遺傳改良帶來一定的困難。

隨著分子生物學、分子標記育種、基因組學、生物信息學的快速發(fā)展和水稻基因組計劃的實施，給水稻的生產和育種帶來了新機遇。但是嚴重缺乏擁有自主知識產權的重要功能基因是嚴重制約我國分子育種及分子設計育種高水平發(fā)展的一個“瓶頸”。目前水稻基因組序列的測定和水稻功能基因組研究的成果將對我國農業(yè)生產發(fā)揮重要影響，加快農作物品種的更新?lián)Q代。國際水稻基因組測序計劃啟動于1998年，由政府和其它公共資金支持，中國、日本、美國、法國等11個國家和地區(qū)共同發(fā)起并承擔了這項龐大的科研任務。這是繼人類基因組計劃后的又一重大國際合作的基因組研究項目[takujisasakietal.，2000]。水稻基因組相對于玉米、小麥等禾谷類作物小，約420-460m個堿基，基因數(shù)約3-5萬個，被國際上廣泛選為模式作物，進行基因組測序和功能基因組研究。隨著2002年水稻全基因組測序草圖的完成和精確測序的完成[junyuetal.，2002；stephena.goffetal.，2002；qifeng，etal.，2003；sasakitetal.，2003]，水稻的研究重點由結構基因組學開始向功能基因組學轉移，功能基因組學的研究現(xiàn)已經成為全球研究的重點，由于基因組序列研究成果的國際共享性，為人們利用該研究成果進入水稻基因資源的竟爭提供了新的機遇。特別是，這樣的局面為中國開展功能基因組研究，發(fā)現(xiàn)重要功能基因，實現(xiàn)基因組研究的跨越式發(fā)展提供了千載難逢的機會。誰先克隆了基因，誰就享有該基因的知識產權。反之，就喪失主動權，就會受治于人。為了在這場“基因大戰(zhàn)”中取得勝利，世界上一些發(fā)達國家及大的跨國公司紛紛投巨資于這一領域的研究[hieterpetal.，1997]。在美洲，美國、加拿大投巨資于玉米、小麥基因的研究；在歐洲，英國johninnes研究中心從杜邦公司每年得到1-2千萬英鎊從事小麥基因的研究；在亞洲，日本、韓國等投巨資從事水稻基因研究；在澳洲，澳大利亞政府投巨資成立了小麥分子育種合作研究中心，每年投入上千萬澳元從事小麥分子育種研究。人們預計，在未來的10-20年時間內，國際上的“基因大戰(zhàn)”將會愈演愈烈。在功能基因及其編碼蛋白質的結構與功能的研究領域，并在此基礎上發(fā)現(xiàn)一批具有重要生理活性和開發(fā)應用前景的功能基因是未來工作和研究的重點，從而為我國以基因和基因表達產物為基礎的動植物遺傳改良奠定基礎，更有力地推動我國農業(yè)生物技術產業(yè)的快速發(fā)展。隨著2002年全球水稻基因組測序計劃的完成和水稻全基因組序列的公布，水稻功能基因組學的研究現(xiàn)已成為世界范圍內研究的重點，了解這些基因在生長和發(fā)育中的作用越來越受到人們的關注。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于為水稻分子育種，提供一種水稻生長素響應蛋白基因arp克隆及應用。

本發(fā)明解決其技術問題是采取以下技術方案實現(xiàn)的：

一種水稻生長素響應蛋白基因arp克隆，該基因位于水稻基因組的4號染色體，距離4，5，7－三羥黃烷酮加雙氧酶基因3.8kb位置，該基因沒有內含子，其基因序列為sq1。

一種水稻生長素響應蛋白基因arp克隆的應用，該應用是將所述水稻生長素響應蛋白基因arp應用于水稻轉基因育種、分子設計育種及水稻矮化育種領域。

本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果是：

1、本發(fā)明的生長素響應蛋白基因arp可廣泛應用于作物分子育種領域，將會給水稻等作物分子育種及矮化育種帶來株高降低起推動作用，對水稻等作物育種產生巨大影響。

2、本發(fā)明的生長素響應蛋白基因arp，在實施推廣過程中對實驗室及田間施肥管理要求條件寬松，株高矮化效果顯著，為基因克隆和分子育種提供一套行之有效的方法。

具體實施方式

以下對本發(fā)明實施做進一步詳述，以下實施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本發(fā)明的保護范圍。

一種水稻生長素響應蛋白基因arp，該基因位于水稻基因組的4號染色體，距離4，5，7－三羥黃烷酮加雙氧酶基因3.8kb位置，該基因沒有內含子，大小為462個堿基序列，其基因序列為sq1。

一種水稻生長素響應蛋白基因arp的應用，該應用是將所述水稻生長素響應蛋白基因arp應用于水稻轉基因育種、分子設計育種及水稻矮化育種領域。

上述水稻生長素響應蛋白基因arp的發(fā)現(xiàn)及驗證過程，該過程包括步驟如下：

(1)水稻轉化受體的制備

水稻品種日本晴成熟后的種子脫殼，先用70％酒精浸泡1分鐘，然后用0.1％升汞溶液滅菌20分鐘，再用無菌水沖洗3次，吸干后接種到nbd培養(yǎng)基上進行愈傷誘導，培養(yǎng)溫度25±1℃，1周后，挑取愈傷進行繼代培養(yǎng)，繼代2周后，取出愈傷進行轉化。

(2)水稻遺傳轉化

挑取農桿菌單菌落到含有50mg/l卡那霉素和20mg/l利福平的yep液體培養(yǎng)基中，28℃振蕩培養(yǎng)14小時，使菌液濃度達到od值0.5，再取1ml菌液加到含有同樣抗生素濃度的ab和0.5％蔗糖的100ml溶液中繼續(xù)培養(yǎng)17小時左右，使od值達到0.8。將上述菌液置于50ml離心管中，4000rpm離心20分鐘，去除上清，加入同原菌液等量的aam培養(yǎng)基，重新懸?。恢貜蜕鲜鲎龇?，再離心，去掉上清，再用aam懸浮，使od值約0.4；將愈傷組織在農桿菌液中浸泡30分鐘；然后將愈傷組織移至干燥的滅菌濾紙上，吸去多余的菌液，最后將愈傷組織置于其培養(yǎng)基na上，共培養(yǎng)一般2-3天。待愈傷組織周圍出現(xiàn)農桿菌菌落后，用500mg/l的頭孢霉素和200mg/l氨芐青霉素溶液充分漂洗，以后再置于選擇培養(yǎng)基nbdh。

(3)抗性愈傷的篩選和植株再生

愈傷組織在選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)大約10-15天后，大部分愈傷變褐死亡，一些新鮮的抗性愈傷就陸續(xù)死亡的愈傷表面出現(xiàn)，挑取抗性愈傷于選擇培養(yǎng)基上繼代20天左右，選擇黃色質地堅硬的愈傷抗性愈傷再轉移到預分化培養(yǎng)基nbp上，25天后待愈傷變白后就可以轉移到分化培養(yǎng)基nbr上，3天就開始有綠點產生，10天左右苗就陸續(xù)出來，30天左右就可以移苗于1/2ms培養(yǎng)基上生根，當幼苗長至8cm以上時，練苗7天時間就可以移入溫室中的土里種植。

(4)t-dna(轉移dna)插入后代的突變體篩選

通過農桿菌介導轉化日本晴，獲得t-dna插入群體。通過對t0代各個時期的表型的觀察和接種實驗來進行突變體篩選。共發(fā)現(xiàn)突變體208個，突變率為11.3％，表型涉及株高、葉片、穗型、生育期、穎花、穎殼著色、抗病等，其中出現(xiàn)株高矮化突變體，后代分離接近3：1，株高37cm，莖桿細，多分蘗，株高層次分明。

(5)tail-pcr(熱不對稱交錯pcr)

根據(jù)pcambia1301t-dna右邊界設計的三個嵌套式的特異性引物sp1，sp2和sp3分別距t-dna右邊界重復序列297bp，234bp和48bp。通過切膠回收第三次擴增所得到的比第二次小的片斷，連接到pgm-teasy載體(一種高效克隆pcr產物的專用載體)上，然后采用電擊法轉入到大腸桿菌dh5α，然后通過測序獲得基因序列。

(6)水稻側翼序列網上序列比對分析由上面分析可知：p1424突變體t－dna插入水稻基因組的位置處在水稻4號染色體上，與已知水稻bac克隆(bacclone:osjnba0084k01)序列同源性達到97％；通過分析發(fā)現(xiàn)該克隆含有兩個基因，t-dna插在距上游基因1.3kb與下游基因2.7kb之間的位置上；通過分析插入位點上游基因氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)，與未知功能基因的氨基酸序列同源性達到75％，通過網上比對認為該基因與擬南芥生長素誘導蛋白基因同源性達到71％，因此預測該基因的功能為生長素響應蛋白基因；同時對下游距離插入位點較遠的基因通過網上氨基酸序列比對，下游基因與水稻未知功能基因同源性達到96％，與玉米4,5,7-三羥黃烷酮加雙氧酶基因同源性達到85％；為了更進一步證明所預測的基因到底是否存在，通過網上搜索水稻cdna克隆，找到了t-dna插入位點上游基因-生長素響應蛋白基因的cdna克隆，證明該基因是存在的，該cdna序列與基因序列完全一致，說明該基因沒有內含子，該基因我們命名為arp(auxinresponsiveprotein)，大小為462個堿基序列，其堿基序列sq1如下：

tcaccagacgaggctgtccatcccttgaagcagcggcgcccgcgacgacgacgacgaagacgactcggcgcggcgcttcgtgacgccgcaggtggcggcgggccggcagaaggccaggtcgtggcgctcgtcggaggacacgcggcggaggacgtcgcggaagtggtcctcgtcgcaggggagcgcgacggggccggaggcgccggacgggaagccgtactcctcctccgcctggcggagcagctcccggaacgccgggtggttcaagtgcgccacccgcaccacgaaccgcctcgcgtcctccccgccgcctcccacccgcacggccacgtgacccgccggaaccgcgtcgccgtcccgctccatcttgctgccggccgggcgcgccgcggcgcgggagcgccaccgccgcaccgtgcggcgcagccagacgagcgactggatcgtgatgaccttgcacat

(7)表達載體構建及轉基因功能驗證

通過構建超表達載體pcambia1300-arp的水稻轉基因植株65株，其中63株通過pcr擴增出目的基因片段和潮霉素基因片段；通過半定量rt-pcr證明arp基因在水稻2號、8號、50號株系中表達量明顯高于野生型，且轉基因植株的株高明顯低于野生型，發(fā)育遲緩；通過轉化擬南芥后也發(fā)現(xiàn)與水稻相似的結果，但葉片變小且多，果莢變小，主根和下胚軸長度縮短，側根和須根增多；將arp基因敲除載體pcambia1300-amirna和對照pcambia1300載體轉化水稻基因組后，發(fā)現(xiàn)arp基因敲除載體所獲得的抗性愈傷與對照相比較小且軟，分化率也比較低，而且轉基因再生苗株型小，莖細，葉片顏色較淺為淺綠色，須根和側根變少。

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<110>天津農學院

<120>一種水稻生長素響應蛋白基因arp克隆及應用

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<213>水稻生長素響應蛋白基因arp的基因組堿基序列

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