專利名稱：：用mmp23基因預(yù)示和鑒定豬產(chǎn)仔數(shù)的分子標(biāo)記方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及動(dòng)物分子遺傳學(xué)，具體說就是一種用MMP23基因預(yù)示和鑒定豬產(chǎn)仔數(shù)的分子標(biāo)記方法。(二)
背景技術(shù)：
：一直以來，提高生長(zhǎng)速度與瘦肉率，改善肉質(zhì)，提高產(chǎn)仔數(shù)，增強(qiáng)抗病力是豬育種的主要目標(biāo)。在過去幾十年，隨著育種方法的改進(jìn)及BLUP方法的應(yīng)用，豬的生長(zhǎng)速度、飼料報(bào)酬和瘦肉率等中高等遺傳力性狀的遺傳進(jìn)展很快，人們從中獲取了很大的經(jīng)濟(jì)效益；但西方豬種在繁殖性狀上的改進(jìn)效果微乎其微。據(jù)報(bào)道，法國(guó)用30多年的時(shí)間來改良豬產(chǎn)仔數(shù)性狀，但進(jìn)展甚微；丹麥將產(chǎn)仔數(shù)提高1頭用了50多年；美國(guó)育種專家估計(jì)，要經(jīng)過25個(gè)世代的常規(guī)選擇，才能使美國(guó)豬種的產(chǎn)仔水平趕上中國(guó)豬的水平。性狀的遺傳組分大小決定了用來改良該性狀的適宜方法。繁殖性狀的低遺傳力以及限性表達(dá)，使得采用常規(guī)技術(shù)對(duì)該性狀的遺傳改良幾乎不可能。分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，使科學(xué)家可以從DNA水平上對(duì)影響繁殖性狀的單個(gè)基因或染色體片段進(jìn)行分析，從而為該性狀的遺傳改良提供了新的契機(jī)。借助分子標(biāo)記對(duì)繁殖性狀進(jìn)行標(biāo)記輔助選擇，可以改變繁殖性狀通過傳統(tǒng)選擇改良進(jìn)展小的現(xiàn)狀，從而加速該性狀的遺傳改良。目前，豬產(chǎn)仔數(shù)候選基因研究的重點(diǎn)集中在與下丘腦-垂體-性腺軸有關(guān)的激素及其受體基因、激活素和抑制素等基因，如雌激素受體(Estrogenreceptor,ESR)基因、促卵泡素(Follicle-stimulatingHormone,FSH)-|3亞基基因，以及與胚胎早期發(fā)育有關(guān)的視黃酸受體Y(Retinoicacidreceptorgamma，RARG)基因、視黃醇結(jié)合蛋白4(retinolbindingprotein4,RBP4)基因、骨橋蛋白(OPN)基因以及骨形成蛋白15(bonemorphogeneticprotein-15，BMP15)基因等。其中，對(duì)產(chǎn)仔數(shù)具有較大遺傳效應(yīng)的是ESR基因和FSH-P基因。ESR是具有轉(zhuǎn)錄激活作用的核受體超家族的一員，它可以與下游耙基因的雌激素應(yīng)答元件相結(jié)合，從而促使下游基因的轉(zhuǎn)錄。Rothschild等利用候選基因法在含有梅山豬血統(tǒng)的群體中，發(fā)現(xiàn)該基因與高產(chǎn)仔數(shù)主效基因相連鎖。對(duì)該座位進(jìn)行RFLP分析，發(fā)現(xiàn)具有3.7kb條帶的純合子(BB基因型)母豬比具有4.3kb條帶的純合子(AA基因型)母豬初產(chǎn)時(shí)多2.3頭仔豬(P0.01)，各胎平均多產(chǎn)1.5頭(PO.Ol)。對(duì)含有大白豬血統(tǒng)的群體進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，純合子BB基因型母豬比其它等位基因的純合型母豬多產(chǎn)l頭仔豬。從而提出將B基因作為豬高產(chǎn)仔遺傳標(biāo)記。Short等采用新的PCR-PwII-RFLP方法擴(kuò)增并酶切^^基因，其中B等位基因?yàn)?5bp和55bp，A等位基因?yàn)?20bp，在對(duì)4262頭大白豬進(jìn)行分析后得出BB型個(gè)體具有較高的產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)(PO.l)，并對(duì)日增重背膘厚等性狀無顯著影響。FSH是由垂體前葉分泌的一種糖蛋白，其生物學(xué)作用在于促進(jìn)顆粒細(xì)胞的增生，刺激類固醇生成，調(diào)節(jié)配子細(xì)胞的發(fā)育和成熟，最終引發(fā)排卵。是下丘腦-垂體-性腺軸中的主要激素之一。研究發(fā)現(xiàn)FSH卩亞基基因序列在不同豬種中存在差異，這種差異是由一個(gè)長(zhǎng)度為292bp的逆轉(zhuǎn)座子的插入引起的，帶有插入片段的基因命名為A基因，不帶有插入片段的基因命名為B基因。進(jìn)一步將FSH(3亞基基因作為控制豬產(chǎn)仔數(shù)主效基因的侯選基因，與豬產(chǎn)仔數(shù)進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果表明，BB型母豬比AA型母豬頭胎產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)分別高出2.53和2.12頭，各胎次平均估計(jì)高出1.5頭，并首次提出FSH(3是另一個(gè)控制豬產(chǎn)仔數(shù)的主基因或候選基因。雖然在產(chǎn)仔數(shù)分子標(biāo)記研究方面取得一定的成果,但目前鑒定的基因或標(biāo)記遠(yuǎn)未達(dá)到分子育種應(yīng)用的要求，而且鑒定的標(biāo)記大都受到國(guó)外專利的保護(hù)，很難在生產(chǎn)中直接應(yīng)用。因此，我們需要加大對(duì)繁殖性狀優(yōu)良基因的挖掘和產(chǎn)仔數(shù)分子標(biāo)記的篩選工作，為產(chǎn)仔數(shù)遺傳改良以及分子育種實(shí)施提供依據(jù)?；|(zhì)金屬蛋白酶(Matrixmetalloproteinase,MMP)家族的大多數(shù)基因在生殖過程中高表達(dá)，包括卵泡發(fā)育、排卵、黃體形成與溶解以及子宮基質(zhì)重建。Velasco等從人卵巢cDNA文庫中分離鑒定了人的MMP23基因，Northernblot分析顯示其主要在卵巢、子宮和前列腺組織中表達(dá)。Ohnishi等從大鼠未成熟卵巢中分離鑒定了大鼠的MMP23基因，該蛋白主要分布在細(xì)胞核周圍的區(qū)域，在卵泡發(fā)育過程中MMP23mRNA的定位從顆粒細(xì)胞到鞘纖維細(xì)胞和卵巢表面的上皮細(xì)胞發(fā)生了顯著的轉(zhuǎn)換。MMP23在卵巢的時(shí)空特異性表達(dá)受cAMP信號(hào)途徑的調(diào)控。進(jìn)一步研究顯示，MMP23在卵巢間質(zhì)細(xì)胞和顆粒細(xì)胞中高度表達(dá)，而在FSH處理過的顆粒細(xì)胞中MMP23的表達(dá)量則顯著下降。MMP23的表達(dá)與卵泡發(fā)育相關(guān)，其蛋白酶水解活性與排卵有關(guān)。以上研究成果顯示，MMP23基因可能通過影響排卵，進(jìn)而在生殖過程中發(fā)揮作用，因此，該基因可作為影響繁殖性狀的功能候選基因。通過連鎖圖譜分析確定在染色體某一區(qū)域內(nèi)影響繁殖性狀的QTL，選擇定位在QTL區(qū)域的基因作為候選基因也是切實(shí)可行的。MMP23基因定位在豬8號(hào)染色體上，與微衛(wèi)星標(biāo)記SW2521緊密連鎖。研究顯示，在該標(biāo)記位點(diǎn)周圍的區(qū)域內(nèi)存在許多與繁殖性狀有關(guān)的QTL，如排卵率、乳頭數(shù)和血漿中的FSH濃度等。因此，MMP23可作為控制豬繁殖性狀的位置候選基因。(三)
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種尋找豬MMP23基因突變位點(diǎn)以及基因多態(tài)性的檢測(cè)方法，也就是用MMP23基因預(yù)示和鑒定豬產(chǎn)仔數(shù)的分子標(biāo)記方法。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明提供了大白豬、梅山和清平豬包括豬MMP23基因第2，3，4外顯子和第2，3內(nèi)含子的482bp的基因組核苷酸序列，通過3個(gè)豬種(大白豬、梅山豬和清平豬)的基因組核苷酸序列進(jìn)行ClusterW比對(duì)提供了位于該482bp擴(kuò)增片段內(nèi)部的兩處單核苷酸多態(tài)性(SNP)。制備該基因片段的步驟如下(1)選擇兩個(gè)中國(guó)地方品種(梅山豬和清平豬)和一個(gè)外來品種(大白豬)為試驗(yàn)材料，從豬血液中提取DNA;(2)根據(jù)豬MMP23基因的部分基因組序列(GeneBank登錄號(hào)EU360790)，設(shè)計(jì)引物(F:5'-ACGCCGCTACACGCTGAC-3'禾卩R:5'-CGCTGTCGTCAAAGTGGATG隱3');(3)PCR擴(kuò)增；(4)PCR產(chǎn)物純化、克隆、測(cè)序。(5)序列比對(duì)分析。本發(fā)明提供了鑒定上述序列269bp處C/T變異的限制性內(nèi)切酶酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)基因型分型方法。其步驟包括(l)在豬基因組DNA中進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(2)PCR擴(kuò)增片段Sau3AI酶切分型及檢測(cè)。本發(fā)明進(jìn)一步提供了利用Sau3AI-RFLP方法確定的不同基因型個(gè)體與產(chǎn)仔數(shù)性狀間的相關(guān)關(guān)系。根據(jù)本發(fā)明的方法可以用于開發(fā)成診斷方法或試劑盒，從而在育種計(jì)劃中利用這些方法來選擇攜帶有利等位基因的豬，進(jìn)而達(dá)到較好的選擇效果。(四)圖l為本發(fā)明三個(gè)豬種MMP23基因序列比對(duì)結(jié)果和SNP位點(diǎn)；圖2為本發(fā)明包括豬MMP23基因第2，3，4外顯子和第2，3內(nèi)含子的基因片段瓊脂糖凝膠電泳圖譜；圖3為MMP23基因Sau3AI-RFLP檢測(cè)結(jié)果。(五)具體實(shí)施方案下面舉例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明。實(shí)施例1:基因片段的獲得及多態(tài)性檢測(cè)方法的建立豬MMP23基因部分DNA序列擴(kuò)增(1)引物設(shè)計(jì)選擇一個(gè)外來豬種(大白豬)和兩個(gè)中國(guó)豬種(梅山豬、清平豬)為試驗(yàn)材料，根據(jù)豬MMP23基因基因組序列(GeneBank登錄號(hào)EU3607卯)，設(shè)計(jì)引物，引物序列如下正向引物F:5'-ACGCCGCTACACGCTGAC-3'反向引物R:5'-CGCTGTCGTCAAAGTGGATG匿3'用此引物在三個(gè)豬種(大白豬、梅山豬和清平豬)基因組DNA中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為25^1，其中模板DNA為50ng，dNTPs濃度為200(amol/L，每條引物濃度為0.4^imo1/L，2U的TaqDNA聚合酶(BiostarInternational,Canada),2.5|ilGCbuffer,加去離子水至總體積25^1;PCR反應(yīng)程序:94。C預(yù)變性4min;然后94。C變性50s、60。C退火45s、72。C延伸lmin，共35個(gè)循環(huán)；最后72'C延伸10min。不同豬種的PCR產(chǎn)物經(jīng)純化、克隆后，進(jìn)行序列測(cè)定。(2)PCR產(chǎn)物的純化、克隆和測(cè)序具體操作步驟如下PCR產(chǎn)物的純化在紫外燈下從低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠上切下含目的片段的凝膠，放入1.5mLEpendorf滑中，然后用PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化PCR產(chǎn)物，按照該試劑盒說明書操作，具體步驟是每100mg的凝膠中加300pL的S1液，于65。C溫育10min至凝膠完全融化，將S1/DNA混合物轉(zhuǎn)入回收柱，9200g離心30s，使?jié){液通過Minicolumn擠出。將下面管子中的廢液倒掉，再加入500pL的Wl液至管中，9200g離心15s，倒掉管中的廢液。再加入500(iL的Wl液，靜置lmin，9200g離心30s，取下Minicolumn裝入1.5mlEpendorf滑中，加入25^L的滅菌水或者TE液，靜置lmin之后，9200g離心1min，以洗脫DNA存于Ependorff管中。連接反應(yīng)將純化PCR產(chǎn)物與pMD18-TVector連接，連接反應(yīng)總體積是10pL，其中包括2xR叩idLigationBufer,2.5(iL;Vector(50ng)，0.5|_iL;回收DNA,7-8^L。稍微彈打混合均勻，于16。C連接lh以上或者4匸連接過夜。感受態(tài)細(xì)胞的制備從37。C培養(yǎng)了16-20h的新鮮平板上挑取一個(gè)DH5ct單菌落接種于2mLLB中，于37'C振蕩培養(yǎng)3h，轉(zhuǎn)接1mL菌液于含有30mLLB的鹽水瓶中，繼續(xù)在37。C振蕩培養(yǎng)約4h，待OD600達(dá)到0.3-0.4時(shí)將鹽水瓶從搖床取出置冰浴冷卻10-15min，然后將菌液轉(zhuǎn)入離心管中于4。C4,000g離心10min以收集細(xì)胞，將離心管倒置以棄凈培養(yǎng)液，用10mL冰預(yù)冷的0.1mol/L的CaCl2重懸沉淀，冰浴30min，重復(fù)4。C4,000g離心10min—次，用4ml冰預(yù)冷的0.1mol/L的CaCl2重懸沉淀，置4'C保存?zhèn)溆谩＾D(zhuǎn)化在滅菌的1.5mL離心管中加入lOOiiL感受態(tài)細(xì)胞，于冰上加入連接產(chǎn)物5pL，用移液槍吸打均勻，冰浴30min;將離心管置于42'C的循環(huán)水浴中(勿震動(dòng))，熱激卯s后迅速冰浴2min;再往離心管中加入400)iLLB培養(yǎng)液，在37。C搖床(200rpm/min)溫浴復(fù)蘇45-60min;離心，去除部分上清液，取lOO)iL復(fù)蘇后的菌液布于含Amp的平板上，鋪平；待液體充分吸收后，倒置平皿，于37'C培養(yǎng)14-16小時(shí)，觀察有無菌落長(zhǎng)出；陽性克隆子的鑒定及測(cè)序從平板上挑取轉(zhuǎn)化好的菌斑接入含lmLLB的1.5mL離心管中并于37。C振搖培養(yǎng)約8h左右。以此菌液為模板，選用M13(上海生物工程有限公司提供)測(cè)序通用引物(退火溫度58-6(TC)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。電泳檢測(cè)，挑取陽性克隆子的菌液送去測(cè)序，序列測(cè)定由大連寶生物工程有限公司完成。(3)DNA序列比對(duì)不同豬種的PCR產(chǎn)物序列經(jīng)ClusterW軟件進(jìn)行序列比對(duì)，序列比對(duì)結(jié)果見圖l。上述擴(kuò)增片段大小為482bp，共存在兩個(gè)堿基變異，其中位于該片段的269bp處的C/T變異引起了Sau3AI酶切位點(diǎn)(IGATC)多態(tài)性。據(jù)此，采用Sau3AI—RFLP方法進(jìn)行SNP分型。PCR-RFLP診斷方法建立取8.5^ilPCR產(chǎn)物加入0.5^(10U/|al)限制性內(nèi)切酶和lpl10xbuffer(含10xBSA)，37°CSau3AI酶切4h，取5|al酶切產(chǎn)物用瓊脂糖電泳檢測(cè)，在紫外燈下觀察并記錄酶切結(jié)果。此擴(kuò)增片段大小為482bp，Sau3AI酶切多態(tài)性位點(diǎn)位于該片段的269bp處，當(dāng)269bp處變異位點(diǎn)為T堿基時(shí)，會(huì)產(chǎn)生限制性內(nèi)切酶Sau3AI的酶切位點(diǎn)(^GATC)，由于在擴(kuò)增片段139bp處存在另外一個(gè)Sau3AI酶切位點(diǎn)，所以Sau3AI消化PCR產(chǎn)物后會(huì)產(chǎn)生3個(gè)片段(139bp，127bp和216bp)，將其命名為BB基因型；當(dāng)269bp處變異位點(diǎn)為C堿基時(shí)(GACC)，則不存在Sau3AI，Sau3AI消化PCR產(chǎn)物后會(huì)產(chǎn)生2個(gè)片段(139bp和343bp)，將其命名為AA基因型；當(dāng)269bp處變異位點(diǎn)位點(diǎn)為T/C雜合時(shí)，Sau3AI消化PCR產(chǎn)物后會(huì)產(chǎn)生4個(gè)片段(139bp，127bp，216bp和343bp)，將其命名為AB基因型。實(shí)施例2:分子標(biāo)記在生產(chǎn)性狀中的應(yīng)用為了確定MMP23基因多態(tài)性與豬表型差異是否相關(guān)，選擇黑龍江省蘭西種豬場(chǎng)的40頭民豬(207窩)和47頭長(zhǎng)白豬(215窩)為試驗(yàn)材料，整理各胎次的產(chǎn)仔性狀記錄(2001-2006)。采用實(shí)施例1所建立的Sau3AI-RFLP方法進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)，并分析豬MMP23基因Sau3AI-PFLP不同基因型與豬產(chǎn)仔數(shù)的相關(guān)關(guān)系。采用SAS統(tǒng)計(jì)軟件(SASInstituteInc,Version8.0)GLM程序進(jìn)行單標(biāo)記方差分析，同時(shí)采用REG程序計(jì)算基因加性效應(yīng)和顯性效應(yīng)，并進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，所采用模型為^為性狀表型值，w為平均值，G,為基因型效應(yīng)(包括基因加性效應(yīng)和顯性效應(yīng)；加性效應(yīng)用-1，0和1分別代表AA、AB和BB基因型，顯性效應(yīng)用1，-1和1分別代表AA、AB和BB基因型)；A、R、5)為固定效應(yīng)，分別為胎次、年度、季節(jié)效應(yīng)；％為殘差效應(yīng)。統(tǒng)計(jì)時(shí)，頭胎和經(jīng)產(chǎn)分別統(tǒng)計(jì)。不同基因型與繁殖性狀間的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果總結(jié)于表1和2。可以看出，Sau3AI-RFLP基因型不同時(shí)，經(jīng)產(chǎn)產(chǎn)仔數(shù)、經(jīng)產(chǎn)產(chǎn)活仔數(shù)性狀存在顯著差異。從表1可看出，在經(jīng)產(chǎn)民豬群體中，BB型個(gè)體的經(jīng)產(chǎn)產(chǎn)仔數(shù)比AB型個(gè)體多1.43頭(PO.05);BB型個(gè)體的經(jīng)產(chǎn)產(chǎn)活仔數(shù)比AB型個(gè)體多1.46頭(PO.Ol)。從表2可看出，在長(zhǎng)白群體中，BB型個(gè)體的經(jīng)產(chǎn)產(chǎn)仔數(shù)比AA型個(gè)體多1.88頭，比AB型個(gè)體多1.91頭(P0.05)，基因加性效應(yīng)顯著(PO.05);BB型個(gè)體的經(jīng)產(chǎn)產(chǎn)活仔數(shù)比AB型個(gè)體多1.51頭(PO.01),加性效應(yīng)顯著(P<0.05)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，在民豬和長(zhǎng)白豬這兩個(gè)具有不同遺傳背景的群體中，BB型個(gè)體均具有較高的經(jīng)產(chǎn)產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)。因此在育種中選擇BB基因型的個(gè)體能改善繁殖性狀。關(guān)于圖2的說明瓊脂糖凝膠濃度為1.5%;M泳道DNAMarkerDL2,000;泳道l代表引物擴(kuò)增片段，片段大小為482bp。9關(guān)于圖3的說明瓊脂糖膠濃度為2.5%;泳道M為DL2000Markers;1泳道為AA基因型，139bp和343bp;2、3、4、6、8、9泳道為AB基因型，139bp，127bp，216bp和343bp;5、7泳道為BB基因型，139bp，127bp和216bp。表l基因&3AI-RFLP基因型與民豬經(jīng)產(chǎn)產(chǎn)仔數(shù)的統(tǒng)計(jì)分析表<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>注以上數(shù)值為最小二乘均值士標(biāo)準(zhǔn)誤，數(shù)值上標(biāo)的字母相同表示差異不顯著，字母不同時(shí)，大寫字母表示差異極顯著，小寫字母表示差異顯著；加性效應(yīng)負(fù)值表示B等位基因降低性狀表型值，其上標(biāo)*表示p<0.05，**表示p<0.01.(下表同)表2^filfi^J基因^"3AI-RFLP基因型與長(zhǎng)白豬經(jīng)產(chǎn)產(chǎn)仔數(shù)的統(tǒng)計(jì)分析表<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>序列表及說明序列表SEQIDNO.l:是外來豬種"大白豬"的核苷酸序列；序列表SEQIDN0.2:是中國(guó)豬種"梅山豬"的核苷酸序列；序列表SEQIDN0.3:是中國(guó)豬種"清平豬"的核苷酸序列；序列表SEQIDN0.4:是實(shí)施豬MMP23基因C/T變異Sau3AI—RFLP基因型分型方法的特異核苷酸序列；序列表SEQIDN0.5:是實(shí)施豬MMP23基因C/T變異Sau3AI—RFLP基因型分型方法的特異核苷酸序列；。SEQUENCELISTING<110>東北農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>用MMP23基因預(yù)示和鑒定豬產(chǎn)仔數(shù)的分子標(biāo)記方法<130>無<160>5<170>Patentlnversion3.3<210>1<211>482<212>DNA<213>Susscrofa<220><221>gene<222>(1)..(482)<400>1acgccgctacacgctgacccccgccaggctgcgttgggaccactttaacctcacgtacag60gtgcgaccctggccctggggagcagtgcggggccgcctggccgccagccctgaccttgac120cagccaccccgctccccaggatcctctccttcccgaggaacctgctgagccccagcgaaa180cccggcggggcctggccgccgcctttcgcatgtggagcgacgtgtcccccttcagcttcc240gcgaggtggcccccgagcagcccagcgacctccgcataggtgggcgacctccgcagagat300gggcactgcgcccctgccccgccccggggccgcctctcagccctgtgctcccctaggctt360ctaccccgtcaaccacaccgactgcctggtctccccgctgcaccactgcttcgacggccc420cacgggcgagctggcccacgccttcttccccccgcacggcggcatccactttgacgacag480eg482<210>2<211>482<212>DNA<213>Susscrofa<220><221>gene<222>(1)..(482)<400>2acgccgctacacgctgacccccgccaggctgcgttgggaccactttaacctcacgtacag60gtgcgaccctggccctggggagcagtgcggggccgcctggccgccagccctgaccttgac120cagccaccccgctccccaggatcctctccttcccgaggaacctgctgagccccagcgaaa180cccggcggggcctggccgccgcctttcgcatgtggagcgacgtgtcccccttcagcttcc240gcgaggtggcccccgagcagcccagcgatctccgcataggtgggcgacctccgcagagat300gggcactgcgcccctgccccgccccggggccgcctctcagccctgtgctcccctaggctt360ctaccccgtcaaccacaccgactgcctggtctccccgccgcaccactgcttcgacggccc420cacgggcgagctggcccacgccttcttccccccgcacggcggcatccactttgacgacag480eg482<210>3<211>482<212>DNA<213>Susscrofa<220><221〉gene<222>(1)..(482)<400>3acgccgctacacgctgacccccgccaggctgcgttgggaccactttaaccteaegtacag60gtgcgaccctggccctggggagcagtgcggggccgcctggccgccagccctgaccttgac120cagccaccccgctccccaggatcctctccttcccgaggaacctgctgagccccagcgaaa180cccggcggggcctggccgccgcctttcgcatgtggagcgacgtgtcccccttcagcttcc240gcgaggtggcccccgagcagcccagcgatctccgcataggtgggcgacctccgcagagat300gggcactgcgcccctgccccgccccggggccgcctctcagccctgtgctcccctaggctt360ctaccccgtcaaccacaccgactgcctggtctccccgctgcaccactgcttcgacggccc420cacgggcgagctggcccacgccttcttccccccgcacggcggcatccactttgacgacag480eg482<210>4<211>18<212>DNA<213>Susscrofa<220〉<221〉gene<222>(1)..(18)<400〉4acgccgctacaegctgae18<210>5<211>20<212>DNA<213>Susscrofa<220><221>gene<222>(1)..(20)<400>5cgctgtcgtcaaagtggatg20權(quán)利要求1.一種用MMP23基因預(yù)示和鑒定豬產(chǎn)仔數(shù)的分子標(biāo)記方法，其特征在于提供了大白豬、梅山和清平豬包括豬MMP23基因第2，3，4外顯子和第2，3內(nèi)含子的482bp的基因組核苷酸序列，SEQIDNO.1如下ACGCCGCTACACGCTGACCCCCGCCAGGCTGCGTTGGGACCACTTTAACCTCACGTACAGGTGCGACCCTGGCCCTGGGGAGCAGTGCGGGGCCGCCTGGCCGCCAGCCCTGACCTTGACCAGCCACCCCGCTCCCCAGGATCCTCTCCTTCCCGAGGAACCTGCTGAGCCCCAGCGAAACCCGGCGGGGCCTGGCCGCCGCCTTTCGCATGTGGAGCGACGTGTCCCCCTTCAGCTTCCGCGAGGTGGCCCCCGAGCAGCCCAGCGACCTCCGCATAGGTGGGCGACCTCCGCAGAGATGGGCACTGCGCCCCTGCCCCGCCCCGGGGCCGCCTCTCAGCCCTGTGCTCCCCTAGGCTTCTACCCCGTCAACCACACCGACTGCCTGGTCTCCCCGCTGCACCACTGCTTCGACGGCCCCACGGGCGAGCTGGCCCACGCCTTCTTCCCCCCGCACGGCGGCATCCACTTTGACGACAGCGSEQIDNO.2如下ACGCCGCTACACGCTGACCCCCGCCAGGCTGCGTTGGGACCACTTTAACCTCACGTACAGGTGCGACCCTGGCCCTGGGGAGCAGTGCGGGGCCGCCTGGCCGCCAGCCCTGACCTTGACCAGCCACCCCGCTCCCCAGGATCCTCTCCTTCCCGAGGAACCTGCTGAGCCCCAGCGAAACCCGGCGGGGCCTGGCCGCCGCCTTTCGCATGTGGAGCGACGTGTCCCCCTTCAGCTTCCGCGAGGTGGCCCCCGAGCAGCCCAGCGATCTCCGCATAGGTGGGCGACCTCCGCAGAGATGGGCACTGCGCCCCTGCCCCGCCCCGGGGCCGCCTCTCAGCCCTGTGCTCCCCTAGGCTTCTACCCCGTCAACCACACCGACTGCCTGGTCTCCCCGCCGCACCACTGCTTCGACGGCCCCACGGGCGAGCTGGCCCACGCCTTCTTCCCCCCGCACGGCGGCATCCACTTTGACGACAGCGSEQIDNO.3如下ACGCCGCTACACGCTGACCCCCGCCAGGCTGCGTTGGGACCACTTTAACCTCACGTACAGGTGCGACCCTGGCCCTGGGGAGCAGTGCGGGGCCGCCTGGCCGCCAGCCCTGACCTTGACCAGCCACCCCGCTCCCCAGGATCCTCTCCTTCCCGAGGAACCTGCTGAGCCCCAGCGAAACCCGGCGGGGCCTGGCCGCCGCCTTTCGCATGTGGAGCGACGTGTCCCCCTTCAGCTTCCGCGAGGTGGCCCCCGAGCAGCCCAGCGATCTCCGCATAGGTGGGCGACCTCCGCAGAGATGGGCACTGCGCCCCTGCCCCGCCCCGGGGCCGCCTCTCAGCCCTGTGCTCCCCTAGGCTTCTACCCCGTCAACCACACCGACTGCCTGGTCTCCCCGCTGCACCACTGCTTCGACGGCCCCACGGGCGAGCTGGCCCACGCCTTCTTCCCCCCGCACGGCGGCATCCACTTTGACGACAGCG。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用MMP23基因預(yù)示和鑒定豬產(chǎn)仔數(shù)的分子標(biāo)記方法，其特征在于所述的DNA序列，序列表SEQIDNO.l、SEQIDN0.2、SEQIDN0.3序列269bp處有一個(gè)堿基突變C269—T269，并導(dǎo)致Sau3AI—RFLP多態(tài)性。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述C269—T269堿基突變，用于檢測(cè)該突變的方法包括以下步驟從豬血液中提取基因組DNA，設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物Sau3AI—RFLP(RestrictionFragmentsLengthPolymorphism)基因型分型。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述，用于PCR擴(kuò)增的引物序列為SEQIDN0.4:ACGCCGCTACACGCTGAC;SEQIDN0.5:CGCTGTCGTCAAAGTGGATG。全文摘要本發(fā)明的目的在于提供一種尋找豬MMP23基因突變位點(diǎn)以及基因多態(tài)性的檢測(cè)方法，也就是用MMP23基因預(yù)示和鑒定豬產(chǎn)仔數(shù)的分子標(biāo)記方法。本發(fā)明提供了大白豬、梅山和清平豬包括豬MMP23基因第2，3，4外顯子和第2，3內(nèi)含子的482bp的基因組核苷酸序列，通過3個(gè)豬種(大白豬、梅山豬和清平豬)的基因組核苷酸序列進(jìn)行ClusterW比對(duì)提供了位于該482bp擴(kuò)增片段內(nèi)部的兩處單核苷酸多態(tài)性(SNP)。根據(jù)本發(fā)明的方法可以用于開發(fā)成診斷方法或試劑盒，從而在育種計(jì)劃中利用這些方法來選擇攜帶有利等位基因的豬，進(jìn)而達(dá)到較好的選擇效果。文檔編號(hào)C12N15/11GK101440399SQ200810137260公開日2009年5月27日申請(qǐng)日期2008年10月7日優(yōu)先權(quán)日2008年10月7日發(fā)明者崔世泉,熊遠(yuǎn)著,牛步月,王希彪申請(qǐng)人:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)