專利名稱：豬免疫性狀相關(guān)基因psmc5的克隆及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于家畜基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說涉及豬的與免疫性狀相關(guān)基因PSMC5的突變位點檢測方法，建立適用于豬免疫性狀的分子標記的方法。
背景技術(shù)：
近10年以來，現(xiàn)代育種技術(shù)使豬的生產(chǎn)性能(生長，胴體與肉質(zhì)性狀)得到了顯著的改良，而對豬健康及抵抗疾病能力的遺傳改良卻重視不夠。隨著人民生活水平的提高，畜牧生產(chǎn)中在重視生產(chǎn)性狀的同時對畜禽的健康，抗病力的提高也越來越重視，因為健康并充滿活力的豬將大大降低生產(chǎn)成本、減少用藥量及產(chǎn)品的藥物殘留，提高市場競爭力。
個體免疫力是衡量動物健康的重要指標(Knapp等，Relationships between genetics changes andinfections disease in domestic livestock，(eds.Hill W G，Bishop S C，McGuirk B.，)brit.Soc AnimSci.，Edinburgh Occasional publication no.27，65-80.2000)，它屬于數(shù)量性狀，其中涉及相關(guān)基因較多，分子機制很復雜。免疫力與生產(chǎn)性能通常表現(xiàn)為表型負相關(guān)關(guān)系，這為育種工作者提出了一個大的難題，即如何在保持和提高生產(chǎn)性能的基礎(chǔ)上同時提高個體免疫能力是育種工作者研究的新課題。不過，最近國外少量研究表明豬免疫能力與生產(chǎn)性能的關(guān)系是雙向的，某種情況下即正常狀態(tài)免疫能力的增強能提高豬的生長速度，飼料效率等主要生產(chǎn)性能，而單純針對生產(chǎn)性能的選擇卻導致豬免疫能力下降即相關(guān)等位基因的丟失或頻率的降低。但是，目前二者的相互關(guān)系仍然不是很明了，從基因組水平揭示出生產(chǎn)性能和免疫力的控制基因體系間的具體關(guān)系，是解決上述難題的有效途徑。在抗病育種中，抗病基因的尋找是關(guān)鍵。
腸毒素型大腸桿菌(Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC)是引起仔豬瀉痢的主要病原體之一(施啟順，豬腸毒素大腸桿菌抗性基因及抗病育種。第11次全國動物遺傳育種學術(shù)會議論文集，中國農(nóng)業(yè)出版社，2001，229-333)，研究表明動物體內(nèi)如果缺乏大腸桿菌K88受體或F18受體，就會對相應(yīng)的血清型大腸桿菌引起的腹瀉產(chǎn)生抗性，目前編碼大腸桿菌K88受體(K88abR和K88acR)的基因已經(jīng)定位在豬13號染色體上靠近轉(zhuǎn)鐵蛋白基因的位置(Edfors-Lilja等，The porcine intestinal receptor forEscherichia coli K88ab，K88acregional localization on chromosome 13and influenve of IgGresponse to the K88 antigen.Anim Genet，1997，26237-242)，α-(1，2)-海藻糖轉(zhuǎn)移酶1(α(1，2)fucosyltransferase，F(xiàn)UT1)基因是F18受體(ECF18R)的候選基因，位于豬6號染色體上(Meijerink等，Two α(1，2)fucosyltransferase genes on porcine chromosome 6q11 are closely linked to theblood group inhibitor(s)and Escherichia coli F18 receptor(ECF18R)loci.MammGenome，1997，8736-741)。
此外，MHC已經(jīng)被證明與抗體對多種抗原的應(yīng)答、細菌的噬菌作用、對螺旋旋毛蟲和惡性黑素瘤的易感性等性狀有相關(guān)(Peelman等，A detail physical map of the porcine major histocompatibilitycomplex(MHC)class III regioncomparison with human and mouse MHC class III regions.Mamm Genome，1996，7363-367)，其它有研究的與抗病力有關(guān)的基因是MX1(Myxovirus(influenza)resistance 1，粘液病毒(流感)抗性因子1)、NRAMP1(Natural resistance-associated macrophage protein 1，與巨噬細胞有關(guān)的天然抗性蛋白1)，IL1(Interleukins 1，白細胞介素1)、PPARG(Peroxisome proliferatoractivated receptor gamma，過氧化物酶體增殖激活受體γ)等基因。
Rothschild實驗室長期從事豬第7號染色體著絲粒附近的主要組織相容性復合體(Majorhistocompatibility complex，MC)基因單倍型與豬初生重、斷奶重、生長速度、背膘厚等性狀有關(guān)等性狀的研究，他們認為MHC基因單倍型與上述生產(chǎn)性能存在相關(guān)關(guān)系(Rothschild MF，Identification ofquantitative trait loci and interesting candidate genes in the pigprogress and prospects.Proc6th WCGALP 1998，26403-409)。
PSMC5基因編碼PA700蛋白酶體激活因子PSMC5亞基。PSMC5亞基屬于26S蛋白酶體亞基家族，在泛素-蛋白酶體的蛋白水解途徑中，也在MHCI類分子介導的抗原提呈中起著非常重要的作用。
人的PSMC5基因，也就是甲狀腺激素受體互作蛋白基因(TRIP1，thryoid hormonereceptor-interacting protein)，它的組織結(jié)構(gòu)和表達已有研究報道(Lee等，Two classes of proteinsdependent on either the presence or absence of thyroid hormone for interaction with the thyroidhormone receptor.Molec Endocr.1995；9243-254.)。人和小鼠PSMC5基因的cDNA全長已被克隆和測序。在PSMC5基因有11個外顯子，12個內(nèi)含子組成。用熒光原位雜交的方法將人的PSMC5基因定位在HAS17q24-25(Hoyle J等，Localization of genes encoding two human one-domain members of the AAAfamilyPSMC5(the thyroid receptor-interacting protein，TRIP1)and PSMC3(the tat-bindingprotein，TBP1).Hum Genet 1997；99285-8.)，而Tanahashi等卻將人的PSMC5基因定位HAS17q23.1-23.3(Tanahashi等，Chromosomal localization and immunological analysis of a family of human 26Sproteasomal ATPase.Biochem.And Biophys.Research communications 1998243229-32)。
用RH克隆板擴增豬的PSMC5的基因組DNA片段，豬的PSMC5基因被定位在豬12q14(Wang等，Mappingof genes encoding four ATPase and three non-ATPase components of the pig 26S proteasome.AnimGenet.200334393-395)。
PSMC5基因除了參與泛素-蛋白酶體途徑的蛋白水解，還參與其他的代謝途徑。但是PSMC5基因的功能研究還不是很透徹，研究突變位點在群體中的多態(tài)性，并進行性狀關(guān)聯(lián)分析是研究基因功能的一個非常有力的手段。所以我們對這個基因的最大的外顯子進行了多態(tài)研究和關(guān)聯(lián)分析，以期能夠發(fā)現(xiàn)它的功能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克隆豬PSMC5基因的部分基因組DNA序列，尋找PSMC5基因的突變位點以及基因多態(tài)性的檢測方法，建立適用于豬免疫性狀的分子標記的方法。
本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)一種豬免疫性狀相關(guān)基因PSMC5，它的DNA序列如序列表SEQ ID NO1所述。
PCR擴增的PSMC5基因序列全長為966bp，其中包含如附圖2所示的部分外顯子5，完整的外顯子6，7和部分的外顯子8的序列。
在序列表SEQ ID NO1的第120位堿基處有一個堿基突變(120T-120C)，導致MunI-RFLP多態(tài)性；
在序列表SEQ ID NO1的第309位堿基處有一個堿基突變(309T-309G)，導致SacI-RFLP多態(tài)性。
檢測120T-120C和309T-309G堿基處堿基突變的正、反向引物的DNA序列如下所示5’-CGTGGACAAGAACATCGACA-3’(正向)，5’-CGTGCGCTGGACTTCACTGT-3’(反向)一種篩選豬免疫性狀的分子標記的方法，按照以下步驟制備用人PSMC5基因cDNA為信息探針，作同源序列篩選，獲得同源性90％以上的表達序列標簽(EST)；然后對EST進行拼接；根據(jù)與人PSMC5基因的基因組全長DNA序列的比對結(jié)果大致得出外顯子的拼接位點，設(shè)計擴增引物；從豬血液基因組提取DNA，PCR擴增、PCR產(chǎn)物純化和克隆測序，獲得如序列表SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
應(yīng)用PCR-RFLP的方法檢測豬PSMC5基因120T-120C和309T-309G的多態(tài)性，并初步進行其基因型與豬的部分免疫性狀之間的關(guān)聯(lián)分析。本發(fā)明為豬的分子育種提供了兩個新的分子標記。
依照本發(fā)明，所述的豬免疫性狀相關(guān)基因PSMC5可以應(yīng)用在豬標記輔助選擇中。
以下對本發(fā)明詳細細節(jié)作進一步的描述1.PSMC5基因部分DNA序列的克隆(1)引物設(shè)計用人PSMC5基因cDNA(GenBank收錄號NM_002805)為信息探針，利用NCBI中的BLAST工具在GenBank豬EST數(shù)據(jù)庫中做同源序列篩選，獲得一系列同源性為90％以上的ESTs(片段長度大于100bp)，將這些ESTs的收錄號在NCBI中用ENTREZ(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/Web/Search/index.html)查詢相應(yīng)序列，然后用GeneTool中的ASSEMBLY程序構(gòu)建豬EST-重疊群。根據(jù)EST拼接序列設(shè)計擴增引物。序列如下5’-CGTGGACAAGAACATCGACA-3’(正向)，5’-CGTGCGCTGGACTTCACTGT-3’(反向)(2)PCR產(chǎn)物的純化、克隆和測序PCR產(chǎn)物的純化在紫外燈下從低熔點瓊脂糖凝膠上切下含目的片段的凝膠，放入1.5ml Ependorff管中，于70℃溫育至凝膠完全融化，然后用PCR產(chǎn)物純化試劑盒(Promega)純化PCR產(chǎn)物，按照試劑盒說明書操作，具體步驟是在每300μl融化的凝膠中加入1ml Resin，混勻20s，將Resin/DNA混合物裝入注射器，使?jié){液通過Minicolumn擠出。再在注射器中加入80％的異丙醇2ml，輕推活塞使異丙醇通過Minicolumn擠出，取下Minicolumn裝入1.5ml Ependorff管中，10,000g離心2min以干燥Resin，將Minicolumn裝入另一個干凈的1.5ml Ependorff管中，加入30~50μl滅菌水，靜置1min，10,000g離心20s，以洗脫DNA存于Ependorff管中。
連接反應(yīng)將純化RACE產(chǎn)物與pGEM-T載體連接，連接反應(yīng)總體積是5μl，其中包括2.5μl2×buffer，0.5μl的T載體，0.5μl的純化PCR產(chǎn)物，0.5μl的T4連接酶，最后加入1μl滅菌水置4℃水浴過夜。
感受態(tài)細胞的制備從37℃培養(yǎng)了16~20h的新鮮平板上挑取一個DH5α單菌落接種于2ml LB中，于37℃振蕩培養(yǎng)3h，轉(zhuǎn)接1ml菌液于含有30ml LB的鹽水瓶中，繼續(xù)在37℃振蕩培養(yǎng)約4h，待OD600達到0.3~0.4時將鹽水瓶從搖床取出置冰浴冷卻10~15min，然后將菌液轉(zhuǎn)入離心管中于4℃4，000g離心10min以收集細胞，將離心管倒置以棄凈培養(yǎng)液，用10ml冰預(yù)冷的0.1mol/L的CaCl2重懸沉淀，冰浴30min，重復4℃4,000g離心10min一次，用4ml冰預(yù)冷的0.1mol/L的CaCl2重懸沉淀，置4℃保存?zhèn)溆谩?br> 轉(zhuǎn)化無菌狀態(tài)下取100~120μl感受態(tài)細胞于1.5ml Ependorff管中，將5μl的連接產(chǎn)物加入混勻，在冰上放置30min，42℃熱激90s，其間不要搖動Ependorff管，取出后冰浴3~4min，加入400μl無抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)45min。取100μl涂布于已提前4h涂布了IPTG(Isopropylthio-β-D-galactoside，異丙基硫代-β-D-半乳糖苷)和X-gal的瓊脂平板上，37℃平放1h后倒置培養(yǎng)。
質(zhì)粒的小量制備挑取平板上的單菌落，接種于2-3ml LB中，37℃300r/min培養(yǎng)過夜。用1.5ml EP管12000r/min離心數(shù)秒收集菌體。每管加入100μl用冰預(yù)冷的溶液I[50mM葡萄糖，25mMTris.Cl(pH8.0)，10mM EDTA(pH8.0)]，渦旋振蕩至菌體充分懸浮。加入新配制的溶液II
200μl，快速顛倒混勻，冰浴5min，然后加入預(yù)冷的溶液III[5M乙酸鉀，冰乙酸11.5ml，H2O28.5ml]150μl，混勻后冰浴5min，12000r/min離心5min，將上清轉(zhuǎn)至另一EP管中，加入苯酚氯仿異戊醇500μl，渦旋振蕩，離心后小心吸取上層水相，加入2倍體積的無水乙醇，-20℃沉淀30min，12000r/min離心5min，沉淀用70％乙醇洗滌2次，抽干，加入含有RNA酶的TE 20μl。
重組質(zhì)粒的酶切鑒定取3μl質(zhì)粒DNA與適量的雙蒸水混勻，使其總體積為15μl，加入2-3U限制性內(nèi)酶EcoR I及2μl相應(yīng)的10X限制性內(nèi)切酶反應(yīng)緩沖液，輕彈管壁混勻并離心，置37℃水浴1-2小時，取2-3μl反應(yīng)液于瓊脂糖凝膠電泳檢測，酶切結(jié)果與預(yù)計完全相同者，即為目的重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒采用雙脫氧末端終止法在DNA自動測序儀上進行測序，序列測定由上海博亞生物技術(shù)有限公司完成。
(3)DNA序列同源性檢索鑒定通過美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI，National Center for Biotechnology Information，http//www.ncbi.nlm.nih.gov)網(wǎng)站的BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)軟件，將測序后獲得的DNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中公布的已知生理功能基因進行序列同源性比較，以鑒定和獲得該DNA序列的功能信息。
2.PCR-RFLP診斷方法建立(1)引物序列5’-CGTGGACAAGAACATCGACA-3’(正向)，5’-CGTGCGCTGGACTTCACTGT-3’(反向)該引物擴增片段長度966bp。
(2)PCR擴增條件PCR反應(yīng)總體積為20μl，其中豬基因組DNA約100ng，含1×buffer(Promega)，1.5mmol/L MgCl2，dNTP終濃度為150μmol/L，引物終濃度為0.2μmol/L，2U Taq DNA聚合酶(Promega)。PCR擴增程序是94℃ 4min，然后循環(huán)35次94℃ 30s，62℃ 30s，72℃ 30s，最后72℃延伸5min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物用1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測。
(3)RFLP檢測條件
PCR產(chǎn)物酶切反應(yīng)體積是10μl，其中1×buffer 1μl，PCR產(chǎn)物3~5μl，限制性內(nèi)切酶MunI或SacI為0.3μl(3U)，用H2O補足10μl，將樣品混勻后離心，37℃水浴4h，用2％瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結(jié)果，記錄基因型，在紫外燈下拍照。
3、標記性狀關(guān)聯(lián)分析在利用申請人組建的湖北省通城豬群做性狀關(guān)聯(lián)分析，96個DNA樣品用于基因型檢測。
所分析的性狀有部分免疫性狀，部分生產(chǎn)性能，部分肉質(zhì)性狀。申請人建立了如下最小二乘模型yijk＝μ+GENOTYPEi+SEXj+COMBINATIONk+εijk，其中，yijk是性狀觀察值，μ為總體均數(shù)，GENOTYPEi為基因型效應(yīng)，SEXj為性別效應(yīng)，COMBINATIONk為組合的效應(yīng)，εijk為隨機誤差，假定服從N(0，σ2)分布。
本發(fā)明的效果1、豬PSMC5基因部分DNA序列的克隆PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果顯示均為特異的PCR產(chǎn)物。將PCR產(chǎn)物回收純化后克隆測序，測序結(jié)果顯示PCR產(chǎn)物的長度為966bp。其中包括部分外顯子5，完整的外顯子6，7和部分的外顯子8的序列。所涉及的完整的內(nèi)含子5，6，7序列均符合GT-AG規(guī)則。
2、PCR-RFLP診斷方法建立用引物擴增豬基因組DNA得到了966bp特異性擴增片段，該序列包括部分外顯子5和部分外顯子8序列以及完整的內(nèi)含子5，6，7的DNA序列(詳見圖2)。
序列分析結(jié)果表明在120bp處存在1個MunI酶切位點(C↓AATTG)，該基因座由兩個等位基因控制，C等位基因只有966bp一個片段，T等位基因有117bp+849bp兩個片段。這兩個等位基因可組成三種基因型CC，CT，TT(見圖3)。
序列分析結(jié)果表明在309bp處存在1個SacI酶切位點(GAGCT↓C)，該基因座由兩個等位基因控制，G等位基因只有966bp一個片段，C等位基因有308bp+658bp兩個片段。這兩個等位基因可組成三種基因型CC，CG，GG(見圖4)。
3、標記性狀關(guān)聯(lián)分析3.1豬PSMC5基因MunI-RFLP多態(tài)性與免疫性狀及部分生產(chǎn)性狀之間的關(guān)聯(lián)分析對豬PSMC5基因MunI-RFLP多態(tài)性位點基因型檢測結(jié)果表明在91個個體中TT基因型有6個，TC基因表1不同PSMC5基因第六外顯子MunI-RFLP基因型與部分生產(chǎn)性狀的關(guān)聯(lián)分析

型有22個個體，CC基因型有63個個體。在與部分生產(chǎn)性狀進行關(guān)聯(lián)分析中，所分析的性狀有免疫性狀，部分生產(chǎn)性狀和肉質(zhì)性狀。不同基因型之間性狀顯著差異的結(jié)果(最小二乘均數(shù)和標準誤分析)總結(jié)于表1。其它性狀在不同的基因型之間沒有顯著的差異。
由表1可知，TC基因型的T細胞百分比顯著高于CC基因型(p＜0.05)，而前者的平均背膘厚卻顯著地低于后者(P＜0.05)。與此相同的是，雜合基因型的豬的6-7肋骨處背膘厚度也是極顯著的低于CC型(P＜0.001)。可見，在這三個性狀上，有明顯的雜合效應(yīng)。對HGB來說，TT基因型組合要顯著的高于TC組合。TT型豬的肉色極顯著地低于CC基因型的豬(P＜0.01)，顯著地低于雜合型的豬(P＜0.05)。
3.2 豬PSMC5基因SacI-RFLP多態(tài)性與免疫性狀及部分生產(chǎn)性狀之間的關(guān)聯(lián)分析對豬PSMC5基因SacII-RFLP多態(tài)性位點基因型檢測結(jié)果表明在92個個體中GG基因型有13個，GC基因型有55個個體，CC基因型有24個個體。在與部分生產(chǎn)性狀進行關(guān)聯(lián)分析中，所分析的性狀有免疫性狀，部分生產(chǎn)性狀和肉質(zhì)性狀。不同基因型之間性狀顯著差異的結(jié)果(最小二乘均數(shù)和標準誤分析)表2不同PSMC5基因第六外顯子SacI-RFLP基因型與部分生產(chǎn)性狀的關(guān)聯(lián)分析總結(jié)于表1。其它性狀在不同的基因型之間沒有顯著的差異。

由表2可知，GC基因型的T細胞百分比顯著高于CC基因型(P＜0.05)，而前者的平均背膘厚卻顯著地低于后者(P＜0.05)。與此相同的是，雜合基因型的豬的6-7肋骨處背膘厚度也是極顯著的低于CC型(P＜0.05)。而且，對初生重來說，GC基因型要顯著的高于GG組合(P＜0.05)。 GC型豬的肉色極顯著地高于CC基因型的豬(P＜0.05)。可見，在這幾個性狀上，都具有明顯的雜合效應(yīng)。
序列表

序列表SEQ ID NO1是本發(fā)明克隆的豬免疫性狀相關(guān)基因PSMC5的DNA序列；圖1是本發(fā)明的技術(shù)流程圖。
圖2是豬PSMC5基因部分DNA序列。大寫字母分別為外顯子5，6，7，8。小寫字母分別為內(nèi)含子5，6，7。5’-和3’拼接位點的兩個保守核苷酸(GT/AG)用黑體標出，引物的位置用方框顯示(在提供的序列表1中已經(jīng)明確指出了內(nèi)含子和引物的確切位置)。
圖3MunI-RFLP的示意圖。
圖4SacI-RFLP的示意圖。
具體實施例方式
實施例1
PCR-RFLP-MunI多態(tài)性在6個豬品種中的分布情況(1)引物序列5’-CGTGGACAAGAACATCGACA-3’(正向)，5’-CGTGCGCTGGACTTCACTGT-3’(反向)(2)PCR擴增條件PCR反應(yīng)總體積為20μl，其中豬基因組DNA約100ng，含1×buffer(Promega)，1.5mmol/L MgCl2，dNTP終濃度為150μmol/L，引物終濃度為0.2μmol/L，2U Taq DNA聚合酶。擴增程序94℃ 4min，然后循環(huán)35次94℃ 30s，62℃ 30s，72℃ 30s，最后72℃延伸5min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物用1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測。
(3)RFLP檢測條件酶切反應(yīng)體積是10μl，其中1×buffer 10μl，PCR產(chǎn)物3～5μl，限制性內(nèi)切酶MunI為0.3μl(3U)，用H2O補足10μl，37℃水浴4h，用2％瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結(jié)果。
表3 PCR-RFLP-MunI多態(tài)性在3個豬品種中的分布

根據(jù)表3的基因型和基因頻率的結(jié)果顯示，在所檢測的3個豬品種中，”梅山豬”是A等位基因占優(yōu)勢，”藏豬”和”二花臉”都是B等位基因占優(yōu)勢。
實施例2對豬PSMC5基因MunI-RFLP多態(tài)性位點基因型檢測結(jié)果表明在91個個體中TT基因型有6個，TC基因型有22個個體，CC基因型有63個個體。在與部分生產(chǎn)性狀進行關(guān)聯(lián)分析中，所分析的性狀有免疫性狀，部分生產(chǎn)性狀和肉質(zhì)性狀。不同基因型之間性狀顯著差異的結(jié)果(最小二乘均數(shù)和標準誤分析)總結(jié)于表1。其它性狀在不同的基因型之間沒有顯著的差異。
表4 不同PSMC5基因第六外顯子MunI-RFLP基因型與部分生產(chǎn)性狀的關(guān)聯(lián)分析

由表4可知，TC基因型的T細胞百分比顯著高于CC基因型(P＜0.05)，而前者的平均背膘厚卻顯著地低于后者(P＜0.05)。與此相同的是，雜合基因型的豬的6-7肋骨處背膘厚度也是極顯著的低于CC型(P＜0.001)。可見，在這三個性狀上，有明顯的雜合效應(yīng)。對HGB來說，TT基因型組合要顯著的高于TC組合。TT型豬的肉色極顯著地低于CC基因型的豬(P＜0.01)，顯著地低于雜合型的豬(P＜0.05)。
實施例3PCR-RFLP-MunI多態(tài)性在清平豬，杜洛克和大白豬的分布表5 PCR-RFLP-MunI多態(tài)性在清平豬，杜洛克和大白豬的分布

根據(jù)表5的基因型和基因頻率的結(jié)果顯示，在所檢測的3個豬品種中都是B等位基因占優(yōu)勢。
實施例4PSMC5基因MunI酶切多態(tài)與部分性狀的關(guān)聯(lián)分析在下半年的通城雜交群體中，對PSMC5基因的MunI酶切產(chǎn)生的三種基因型與豬部分生產(chǎn)性能、部分肉質(zhì)性狀和部分生理指標進行最小二乘方差分析，發(fā)現(xiàn)6-7肋間背膘厚在三種基因型之間有極顯著的差異(P＜0.01)，三點平均背膘厚和平均血細胞容積在三種基因型之間有顯著的差異(P＜0.05)，屠宰率在三種基因型之間有差異的趨勢(P＜0.1)，如表6所示。CC基因型個體的6-7肋間背膘厚和三點平均背膘厚極顯著地高于CT基因型的個體(P＜0.01)，但其平均血細胞容積卻極顯著地低于CT基因型的個體(P＜0.01)。TT基因型個體的屠宰率顯著地高于CT基因型的個體(P＜0.05)。
表6.PSMC5基因MunI酶切多態(tài)性對部分性狀的影響

*表示P＜0.05；**表示P＜0.01a個體數(shù)均為2列，前列為計算生產(chǎn)性狀的個體數(shù)，后列為計算免疫性狀的個體數(shù)。
實施例5PCR-RFLP-SacI多態(tài)性在中國血統(tǒng)豬種”小梅山”，”二花臉”，”清平豬”，歐洲血統(tǒng)豬種”杜洛克”和”大白豬”中的分布情況表7 PCR-RFLP-SacI多態(tài)性在5個豬品種中的分布

這5個豬種中，除了杜洛克是G等位基因和C等位基因各占50％以外，其它都是C等位基因占優(yōu)勢。
實施例6不同PSMC5基因第六外顯子SaeI-RFLP基因型與部分生產(chǎn)性狀的關(guān)聯(lián)分析表8 不同PSMC5基因第六外顯子SacI-RFLP基因型與部分生產(chǎn)性狀的關(guān)聯(lián)分析

由表8可知，GC基因型的T細胞百分比顯著高于CC基因型(P＜0.05)，而前者的平均背膘厚卻顯著地低于后者(P＜0.05)。與此相同的是，雜合基因型的豬的6-7肋骨處背膘厚度也是極顯著的低于CC型(P＜0.05)。而且，對初生重來說，GC基因型要顯著的高于GG組合(P＜0.05)。GC型豬的肉色極顯著地高于CC基因型的豬(P＜0.05)。可見，在這幾個性狀上，都具有明顯的雜合效應(yīng)。
實施例7PSMC5基因SacI酶切多態(tài)與部分性狀的關(guān)聯(lián)分析在另一組通城豬雜交群體實驗中，對PSMC5基因的SacI酶切產(chǎn)生的三種基因型與豬部分生產(chǎn)性能、部分肉質(zhì)性狀和部分生理指標進行最小二乘方差分析，發(fā)現(xiàn)達上市體重的日齡、6-7肋間背膘厚在三種基因型之間的差異接近顯著水平(P＜0.1)，三點平均背膘厚在三種基因型之間有極顯著的差異(P＜0.01)，板油率在三種基因型之間有顯著差異(P＜0.05)，如表所示。CC基因型個體的達上市日齡顯著地高于GC基因型的個體(P＜0.05)，然而，其6、7肋間背膘厚卻顯著地低于GC基因型的個體(P＜0.05)，特別是其三點平均背膘厚，極顯著地低于GC基因型的個體(P＜0.01)。而且CC基因型個體的板油率也顯著地低于GC基因型的個體(P＜0.05)。
表9.PSMC5基因SacI酶切多態(tài)性對部分生產(chǎn)性狀的影響

*表示P＜0.05；**表示P＜0.01；*Indicate P＜0.05；**Indicate P＜0.01
豬免疫性狀相關(guān)基因PSMC5序列表(SEQUENCE LISTING)<110>華中農(nóng)業(yè)大學<120>豬免疫性狀相關(guān)基因PSMC5的克隆及其應(yīng)用<130>
<141>2004-06-07<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>966<212>DNA<213>豬(Sus serofa)<220>
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<221>exon<222>(1)..(28)<223>
<400>1cgt gga caa gaa cat cga cat caa tga t gtgagtgcag caggtgaggt 48Arg Gly Gln Glu His Arg His Gln1 5tgggagtggg ggggtcagct ctcaccatgc cccatcctaa aactctcttc tctcgcccag108gt gac acc caa ttg ccg ggt ggc tct cag aaa tga tag cta cac ttt 155Cys Asp Thr Gln Leu Pro Gly Gly Ser Gln Lys Leu His Phe10 15 20gca caa gat cct gcc caa caa ggt aga ccc act ggt gtc act gat gat 203Ala Gln Asp Pro Ala Gln Gln Gly Arg Pro Thr Gly Val Thr Asp Asp
25 30 35ggt gga gaa agt gcc aga ttc aac tta cga gat gat tgg tgg act gga 251Gly Gly Glu Ser Ala Arg Phe Asn Leu Arg Asp Asp Trp Trp Thr Gly40 45 50caa gca gat caa gga gat caa aga agt gat cga gct gcc cgt gaa gca 299Gln Ala Asp Gln Gly Asp Gln Arg Ser Asp Arg Ala Ala Arg Glu Ala55 60 65 70tcc tga gct ctt tga agc gct ggg cat tgc aca gcc caa g gtgagccggg 349Ser Ala Leu Ser Ala Gly His Cys Thr Ala Gln75 80cgtctctggg agggccgagc aggtgttggg gtagactggc gcctgccgaa gctggccctc409cttgtgcaca ggggctgtgg cagagatgct gccagggcag cgactggttt ggatgtaagg469cccagagggg accttgacat tcattttttg tatgtctggc gtctagcaca ggatctagga529cggtacagac actcagtaaa tattcactga atgacatggg ggacggcttt ttgccctgag589tcctgccatt gctctctag gg agt gct gct ata cgg acc ccc agg c 635Gly Ser Ala Ala Ile Arg Thr Pro Arg85 90actgggaaga cactgctggc ccgagctgtg gcccatcata cagactgcac ctttattcgc695gtctctggct ctgagctggt acagaaattc attggggaag gtaagtggcc agaagcgaaa755agactaagcc caagggggtc gggggagagg gagagggagc ttatcagctc aatgccagct815tggcctctgc acag gg gca agg atg gtg agg gag ctg ttt gtc atg gcc 864Arg Ala Arg Met Val Arg Glu Leu Phe Val Met Ala95 100cga gaa cac gct cca tct atc atc ttc atg gac gaa atc gac tcc att 912Arg Glu His Ala Pro Ser Ile Ile Phe Met Asp Glu Ile Asp Ser Ile105 110 115ggc tcc tcg cgg ctg gaa ggg ggc tct gga ggg gac agt gaa gtc cag 960Gly Ser Ser Arg Leu Glu Gly Gly Ser Gly Gly Asp Ser Glu Val Gln120 125 130cgc acg 966Arg Thr13權(quán)利要求
1.一種豬免疫性狀相關(guān)基因PSMC5，它的DNA序列如序列表SEQ ID NO1所述。
2.、根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因，其特征在于PCR擴增的序列全長為966bp，其中包含如附圖2所示的部分外顯子5，完整的外顯子6，7和部分的外顯子8的序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA序列，其特征在于序列表SEQ ID NO1的第120位堿基處有一個堿基突變(120T-120C)，導致MunI-RFLP多態(tài)性；
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA序列，其特征在于序列表SEQ ID NO1的第309位堿基處有一個堿基突變(309T-309G)，導致SacI-RFLP多態(tài)性。
5.權(quán)利要求1所述的基因，檢測120T-120C和309T-309G堿基處堿基突變的正、反向引物的DNA序列如下所示5’-CGTGGACAAGAACATCGACA-3’(正向)，5’-CGTGCGCTGGACTTCACTGT-3’(反向)
6.一種篩選豬免疫性狀的分子標記的方法，按照以下步驟用人PSMC5基因cDNA為信息探針，作同源序列篩選，獲得同源性90％以上的表達序列標簽(EST)；然后對EST進行拼接；根據(jù)與人PSMC5基因的基因組全長DNA序列的比對結(jié)果大致得出外顯子的拼接位點，設(shè)計擴增引物；從豬血液基因組提取DNA，PCR擴增、PCR產(chǎn)物純化和克隆測序，獲得如序列表SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
7.權(quán)利要求1-6任一項所述的豬免疫性狀相關(guān)基因PSMC5在豬標記輔助選擇中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種與豬免疫性狀相關(guān)基因PSMC5突變位點的檢測方法及其在豬遺傳育種技術(shù)領(lǐng)域作為輔助選擇的應(yīng)用?？寺×素i免疫性狀相關(guān)基因PSMC5的部分基因序列，它的DNA序列如序列表SEQ ID NO1所示，該序列全長為966bp，其中包含如附圖2所述的部分外顯子5，完整的外顯子6，7和部分的外顯子8的序列。在第120位堿基處有一個堿基突變(120T－120C)，導致MunI－RFLP多態(tài)性；在第309位堿基處有一個堿基突變(309T－309G)，導致SacI－RFLP多態(tài)性。應(yīng)用本發(fā)明分別對原產(chǎn)于中國地方豬種和歐洲的血統(tǒng)的豬種進行了相關(guān)檢測，肯定了本發(fā)明用于豬遺傳輔助選擇的效果。本發(fā)明還提出了制備上述基因和用于檢測應(yīng)用的方法。
文檔編號C12Q1/68GK1715419SQ20041001338
公開日2006年1月4日 申請日期2004年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月29日
發(fā)明者李奎, 王彥芳, 劉榜, 余梅, 樊斌, 朱猛進, 熊統(tǒng)安 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學