專利名稱：豬生長性狀基因inpp5f的克隆及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于動物基因工程技術領域，具體涉及豬生長性狀相關基因INPP5F基因的克隆以及其在標記輔助選擇上的應用。
背景技術：
我國養(yǎng)豬歷史悠久，已有6000～10000年。養(yǎng)豬業(yè)一直是畜牧業(yè)的重要組成部分，近年來，豬肉一直占肉類總產(chǎn)的65％左右，對于改善人民的生活，增加農(nóng)民收入，保證社會穩(wěn)定起到了重要的作用。尤其隨著我國經(jīng)濟體制的改革，農(nóng)民商品意識逐步增強，養(yǎng)豬業(yè)正由傳統(tǒng)家庭副業(yè)向專業(yè)化、規(guī)?；?、集約化、工廠化方向迅速發(fā)展。因此，加快遺傳育種學的發(fā)展用于支持養(yǎng)豬業(yè)有著極為重要的作用。
豬育種中選擇的主要目標性狀包括以下兩個方面，一方面是胴體性狀，包括胴體各組分的度量值(如背膘厚度、眼肌面積、胴體長、小腸長度、各種內臟重等等)和各組成的重量百分比(如屠宰率、腿臀比率、腿臀肉骨率、板油率和內脂等等)；另一方面是生長速度，其測定指標一般包括60日齡體重、前期平均日增重、后期平均日增重和全期平均日增重等等。
隨著人們對肉品需要量的增加，畜牧業(yè)必須縮短家畜飼養(yǎng)期，更多的為人們提供肉食產(chǎn)品。生長性狀屬于數(shù)量性狀，由多基因控制、并存在主基因(major gene)效應。分子生物學技術的發(fā)展，使人們可以在DNA水平尋找控制生長性狀的主基因或與其緊密連鎖的分子標記，在育種過程中用于標記輔助選擇(markerassisted selection，MAS)，以便提高選擇進展，更好地改善豬生長性狀，滿足人們的需要，同時獲得較大的經(jīng)濟效益。
通過候選基因法，已經(jīng)找到了一些影響豬的生長速度的基因。位于豬12號染色體上的生長激素基因(Growth Hormon，GH)是神經(jīng)分泌內生長軸中調控動物生長發(fā)育的核心基因，其產(chǎn)物生長激素具有調節(jié)新陳代謝、促進生長發(fā)育等作用，是與豬的生長相關的主要候選基因，許多學者對它的基因型與生產(chǎn)性狀的關系進行了廣泛的研究。實驗證明外源性豬GH能促進生長期豬的新陳代謝水平，增強消化道對飼料的消化吸收，促使肌肉蛋白、膠原蛋白合成增加、而脂肪沉積減少，使血液中的胰島素樣生長因子IGF-I濃度有所上升，總的結果提高了豬的平均日增重，增加了瘦肉率(賀淹才等，豬生長激素與養(yǎng)豬業(yè)，江西畜牧獸醫(yī)雜志，1994，312-14)。方美英等(方美英等，六個品種豬生長激素基因座位遺傳多態(tài)性檢測，動物學研究，1998，19(4)334-336)宋成義等(宋成義等，豬GH基因部分突變位點對生長性能的影響，遺傳，2001，23(5)427-430)俞沛初等(俞沛初等，香豬生長激素基因不同基因型對生長性能的影響，上海交通大學學報，2006，24(4)，326-329)也曾發(fā)現(xiàn)，不同的GH基因型與豬不同月齡平均日增重、不同月齡體重有著顯著相關。關學敏等(關學敏等，豬肌肉生長抑制素基因5’-調控區(qū)的突變與生產(chǎn)性能的相關分析，西北農(nóng)業(yè)學報，2006，15(2)7-9)在長白豬、大白豬、杜洛克豬、山西瘦肉型豬新品系(SD-III系)和山西地方品種馬身豬5個品種中研究發(fā)現(xiàn)肌肉生長抑制素(myostatin，MSTN)基因型對出生重影響顯著。
位于15號染色體的肌肉生長抑制素(myostatin，MSTN)是影響骨骼肌生長發(fā)育的抑制因子。其對豬瘦肉量和脂肪沉積有重要的影響(Sonstegard T S等，Myostatin maps to porcine chromosome 15by linkageand physical analyses.Anim Genet，1998，2919-22)。Grobet L等研究報道其突變能引起肌肉的增長(Grobet L等，A deletion in the bovine myostatin gene causes the double-muscled phenotype incattle.Nat Genet，1997，1771-74)。Te Pas等(Te Pas M F等，Influences of myogenin genotypes onbirth weight，growth rate，carcass weight，backfat thickness，and lean weight of pigs.J AnimSci，1999，772352-2356)同時發(fā)現(xiàn)Myogenin mRNA的表達水平能顯示肌肉中被激活的衛(wèi)星細胞數(shù)目，反映肌肉的生長速度。通過對豬MSTN基因在發(fā)育過程中表達水平的變化也說明MSTN基因的表達與生長速度有關(ji S等，Myostatin expression in porcine tissuestissue specificity and developmental andpostnatal egulation.Am.J.Physiol，1998，2751265-1273).
豬MC4R基因被認為是影響生長肥育性狀的主效基因之一(Kim K S等，Linkage and physical mappingof the porcine melanocortin-4 receptor(MC4R)gene.Journal of Animal Science，2000，78791-792)。它位于第1號染色體。肖石軍等(肖石軍等，豬資源家系MC4R基因掃描及其與脂肪性狀的相關分析，畜牧獸醫(yī)學報，2006，37(9)841-845)采用PCR-TaqI-RFLP技術，檢測了9個中國地方豬種、3個外來豬種和1個培育豬種的612個個體及白色杜洛克×二花臉資源家系418頭F個體在MC4R基因D298N主效位點的遺傳變異，統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)MC4R基因型與日增重等生長性狀顯著相關，同時，GG基因型個體的240日齡重、至240日齡平均日增重明顯大于AA基因型個體。Kim等(Kim K S等，Linkage and physical mapping of theporcine melanocortin-4 receptor(MC4R)gene.Journal of Animal Science，2000，78791-792；Kim KS等，A missense vari ant of the porcine melanocortin-4 receptor(MC4R)gene is associated withfatness，growth，and feed intake traits.Mammalian Genome，2000，1131-135)研究表明豬MC4R在該突變位點的基因型與一些品系的背膘厚和生長率以及所有品系的采食量呈強相關。
此外，豬胰島素樣生長因子(IGF-1)，PIT1基因，肥胖基因(LEP)等均被認為與豬的生長速度有關。
INPP5F(inositol polyphosphate-5-phosphatase F)基因是一個編碼肌醇磷酸酶的基因，肌醇磷酸酶參與神經(jīng)末梢的細胞的吞噬和外排作用。Jonathan等利用組織特異性的芯片技術，驗證該基因的其中的一個轉錄本/Inpp5f_v2在鼠上為母系印記，該轉錄本在小鼠的腦中特異的表達并印記。(Jonathan等，A NovelVariant of Inpp5f Is Imprinted in Brain，and Its Expression Is Correlated with DifferentialMethylation of an Internal CpG Island.MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY，2005，135514-5522)。后來的研究發(fā)現(xiàn)Inpp5f_v2在人的胎兒的大腦，心臟和舌頭里面也為母系印記基因。人和小鼠的基因組研究結果將INPP5F基因分別定位于人的10(10q26.11)號染色體和鼠的7號染色體。在人上面INPP5F基因有三個選擇性剪接的轉錄本，其DNA序列全長為103051bp，而在小鼠上目前只得到了一個轉錄本，其DNA全長為85072bp。通過對人與鼠之間的序列相似性比較發(fā)現(xiàn)，Inpp5f_v2在人和鼠之間有5個外顯子是高度保守的。肌醇磷酸酶參與神經(jīng)末梢的細胞吞噬和外排作用，而這個過程又是與內涵蛋白包膜的脫落和突觸小泡的再循環(huán)密切相關的，暗示該基因有可能在機體腦的發(fā)育和新生兒的存活率方面起著重要的作用(Arai等，Developmental changes of synaptojanin expression in the human cerebrum and cerebellum.Dev.Brain Res..2001，1291-9)。但是到目前為止，仍沒見到全面研究INPP5F基因功能的報導。研究突變位點在群體中的多態(tài)性，并進行性狀關聯(lián)分析是研究基因功能的一個非常有力的手段。所以申請人對這個基因的部分的外顯子進行了多態(tài)研究和關聯(lián)分析，以期能夠發(fā)現(xiàn)它的功能。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于克隆豬生長性狀基因INPP5F，尋找INPP5F基因的突變位點以及作為豬生長性狀基因多態(tài)性的檢測方法，為標記輔助育種提供一種有用的分子標記。
本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的一種豬生長相關基因INPP5F，它的DNA序列如序列表SEQ ID NO1所述。
PCR擴增的INPP5F基因組序列全長為355bp，其中全為如附圖2所述的外顯子20序列。
所獲得的INPP5F基因部分DNA序列中有1個如序列表SEQ ID NO1所述的A279-G279的堿基突變，導致HincII/-RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism)多態(tài)性。
一種制備豬生長性狀INPP5F基因DNA序列的方法，按照以下步驟用人INPP5F基因cDNA為信息探針，作同源序列篩選，獲得相似性90％以上的表達序列標簽(EST)；然后拼接豬EST-重疊群；根據(jù)EST-重疊群設計引物，引物用于PCR擴增，對獲得的PCR產(chǎn)物純化、克隆和測序，進行序列分析，獲得如序列表SEQ ID NO1所述的DNA序列。
本申請人應用上述PCR-RFLP方法對豬INPP5F基因第279位的堿基突變進行了檢測。
以下對本發(fā)明作進一步的描述1、INPP5F基因的第20外顯子的克隆(1)引物設計用人INPP5F基因cDNA(GenBank收錄號NM_014937)為信息探針，利用NCBI中的BLAST工具在GenBank豬EST數(shù)據(jù)庫中做同源序列篩選，獲得一系列相似性為90％以上的ESTs(片段長度大于100bp)，將這些ESTs的收錄號在NCBI中用ENTREZ(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Web/Search/index.html)查詢相應序列，然后用GeneTool中的ASSEMBLY程序構建豬EST-重疊群。根據(jù)EST拼接序列設計引物，序列如下5’GACTCCTACCACTCCGATGAAT 3’(正向)，5’GCTGGGTCACTTTGTTTTGTG 3’(反向)。
(2)PCR產(chǎn)物的純化、克隆和測序PCR產(chǎn)物的純化在紫外燈下從低熔點瓊脂糖凝膠上切下含目的片段的凝膠，放入1.5mL Ependorff管中，然后用PCR產(chǎn)物純化試劑盒(購自Promega公司)純化PCR產(chǎn)物，按照試劑盒說明書操作，具體步驟是每100mg的凝膠中300μL的S1液，于65℃溫育10min至凝膠完全融化，將S1/DNA混合物轉入回收柱，9200g離心30s，使?jié){液通過Minicolumn擠出。將下面管子中的廢液倒掉，再加入500μL的W1液至管中，9200g離心15s，倒掉管中的廢液。再加入500μL的W1液，靜置1min，9200g離心30s，取下Minicolumn裝入1.5ml Ependorff管中，加入25μL的滅菌水或者TE液，靜置1min之后，9200g離心1min，以洗脫DNA存于Ependorff管。
連接反應將純化PCR產(chǎn)物與pGEM-T載體(購自Promega公司)連接，連接反應總體積是5μl，其中包括2.5μl 2×buffer，0.5μl的T載體，0.5μl的純化PCR產(chǎn)物，0.5μl的T4連接酶，最后加入1μl滅菌水置4℃水浴過夜。
感受態(tài)細胞的制備從37℃培養(yǎng)了16-20h的新鮮平板上挑取一個DH5α單菌落接種于2ml LB中，于37℃振蕩培養(yǎng)3h，轉接1ml菌液于含有30ml LB的鹽水瓶中，繼續(xù)在37℃振蕩培養(yǎng)約4h，待OD600達到0.3-0.4時將鹽水瓶從搖床取出置冰浴冷卻10-15min，然后將菌液轉入離心管中于4℃4,000g離心10min以收集細胞，將離心管倒置以棄凈培養(yǎng)液，用10ml冰預冷的0.1mol/L的CaCl2重懸沉淀，冰浴30min，重復4℃4,000g離心10min一次，用4ml冰預冷的0.1mol/L的CaCl2重懸沉淀，置4℃保存?zhèn)溆谩?br> 轉化無菌狀態(tài)下取100-120μl感受態(tài)細胞于1.5ml Ependorff管中，將5μl的連接產(chǎn)物加入混勻，在冰上放置30min，42℃熱激90s，其間不要搖動Ependorff管，取出后冰浴3~4min，加入400μl無抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)45min。取100μl涂布于已提前4h涂布了IPTG(Isopropylthio-β-D-galactoside，異丙基硫代-β-D-半乳糖苷)和X-gal的瓊脂平板上，37℃平放1h后倒置培養(yǎng)。
(4)DNA序列同源性檢索鑒定通過美國國家生物技術信息中心(NCBI，National Center for Biotechnology Information，http://www.ncbi.nlm.nih.gov)網(wǎng)站的BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)軟件，將測序后獲得的DNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中公布的已知生理功能基因進行序列同源性比較，以鑒定和獲得該DNA序列的功能信息。
2.PCR-RFLP診斷方法建立(1)引物序列INPP5FPL1 5′-GACTCCTACCACTCCGATGAAT-3′PR2 5′-GCTGGGTCACTTTGTTTTGTG-3′該引物擴增片段長度355bp。
(2)PCR擴增條件PCR反應總體積20μl，其中豬基因組DNA約100ng，含1×buffer(購自Promega公司)，1.5mmol/LMgCl2，dNTP終濃度為150μmol/L，引物終濃度為0.2μmol/L，2U Taq DNA聚合酶(購自Promega公司)。PCR擴增程序是94℃4min，循環(huán)34次94℃30s，55℃30s，72℃20s，最后72℃延伸5min。PCR反應產(chǎn)物用2％瓊脂糖凝膠電泳檢測并拍照。
(3)RFLP檢測條件PCR產(chǎn)物酶切反應體積是10μl，其中1×buffer 1μl，PCR產(chǎn)物3-5μl，限制性內切酶HincII為0.2μl(2U)，用H2O補足10μl，將樣品混勻后離心，37℃水浴4h，用2％瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結果，記錄基因型，在紫外燈下拍照。
3.標記性狀關聯(lián)分析在利用本申請人分子生物學遺傳育種實驗室大白豬群體做性狀關聯(lián)分析，236個DNA樣品(取自豬耳朵組織)用于基因型檢測。所分析的性狀有部分生長性狀和部分繁殖性狀。運用SAS Vergion8.1軟件(一種公開使用的通用計算機軟件)中GLM程序按以下模型進行基因型和性狀間的關聯(lián)分析，分析有兩個步驟，先建立如下模型剔除所有系統(tǒng)效應yi＝μ+Gi+εi，其中，yi為性狀表型值，μ為總體平均值，Gi為基因型效應(包括Ai加性效應，Di顯性效應)。εi為隨機誤差，假定服從N(0，Iσ2)分布。
本發(fā)明的效果是1、豬INPP5F基因部分DNA序列的克隆PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳檢測結果顯示均為特異的PCR產(chǎn)物。將PCR產(chǎn)物回收純化后克隆測序，測序結果顯示PCR產(chǎn)物的長度為355bp。其全部為外顯子20序列(如圖2、SEQ ID NO1所示)。測序結果表明在該片段的279bp處存在A、G兩個等位基因，測序峰圖見圖4。
2、PCR-RFLP診斷方法建立用INPP5F-PL1和INPP5F-PR1擴增豬基因組DNA得到355bp特異擴增片段(詳見圖3)。測序的結果發(fā)現(xiàn)在該355bp片段中存在Hinc II酶切位點(GTY*RAC)，其中第281bp處為多態(tài)性切點，位于外顯子20中，用INPP5F-PL1和INPP5F-PR1擴增豬的INPP5F基因獲得長度為355bp的PCR產(chǎn)物，酶切產(chǎn)生三種基因型，基因型BB型有281bp和74bp兩條帶，AA型只有355bp的一條帶，雜合子AB型有355bp，281bp和74bp三條帶。(其中74bp的條帶在圖中看不到)3、標記性狀關聯(lián)分析對豬INPP5F基因第20外顯子HincII-RFLP多態(tài)性位點與部分生長、繁殖性狀進行關聯(lián)分析，基因型檢測結果表明在236個個體中AA基因型有113個，AB基因型有98個，BB基因型有25個(由于個別測定性狀的數(shù)據(jù)缺失，因此得到的實際值如表2、表3所示)，所得到相關的性狀是30-100Kg日增重和全程日增重。
由表2可知，A等位基因是豬30-100Kg日增重和全程日增重的有利標記，AA基因型標記可用于提高豬生長速度的選擇標記(分子標記)。
表2 INPP5F基因多態(tài)性對30-100Kg日增重的影響

表3 INPP5F基因多態(tài)性對全程日增重的影響



序列表SEQ ID NO1是本發(fā)明克隆的豬生長性狀相關基因INPP5F DNA序列。
圖1是本發(fā)明關于INPP5F基因制備的流程圖。
圖2是本發(fā)明中豬INPP5F基因20外顯子序列，其中第279位堿基處的括號內為等位基因的突變位點。
圖3是本發(fā)明中豬INPP5F基因第二十外顯子的擴增序列的電泳圖譜，片段大小為355bp(瓊脂糖膠濃度為1.5％)。圖中M泳道為DNA分子量標記(250bp ladder)。
圖4是本發(fā)明中豬INPP5F基因測序發(fā)現(xiàn)的279A-279G等位基因突變。
圖5是本發(fā)明中豬INPP5F基因第二十外顯子的Hinc II-RFLPs的三種基因型(AA AB BB)電泳圖譜。MDNA分子量標準(250bp ladder)具體實施方式
實施例1PCR-RFLP-Hinc II多態(tài)性在各豬品種中的分布情況利用PCR-Hinc II-RFLP檢測了五個豬種其中屬于中國地方血緣的豬種分別是二花臉豬，大花白豬，江西玉山黑豬，屬于外來的例如歐美血緣的豬種分別是杜洛克豬和大白豬，這些豬種基本涵蓋各豬種的基因型。試驗使用的豬種的基因頻率如表3所示，發(fā)現(xiàn)地方豬種均等位基因A占優(yōu)勢，國外豬種均等位基因G占優(yōu)勢。
表4 INPP5F基因PCR產(chǎn)物基因型頻率及基因頻率

幾個品種間基因型頻率的卡方檢驗結果如表5。x2檢驗五個豬種間基因型頻率差異性發(fā)現(xiàn)，國內豬和國外豬存在顯著或極顯著差異。
表5 INPP5F基因的PCR-Hinc II-RFLP基因型分布x2檢驗結果

注肩注*表述P＜0.05；肩注**表述P＜0.01實施例2豬標記性狀關聯(lián)分析對豬INPP5F基因第20外顯子Hinc II-RFLP多態(tài)性位點與部分生長、繁殖性狀進行關聯(lián)分析，基因型檢測結果表明在236個個體中AA基因型有113個，AB基因型有98個個體，BB基因型有25個(由于個別測定性狀的數(shù)據(jù)缺失，因此得到的實際值如表2所示)，在與部分生產(chǎn)性狀進行關聯(lián)分析中，所分析的性狀有部分生長性狀和繁殖性狀，所分析的性狀是30-100Kg日增重和全程日增重。
由表可知，A等位基因是30-100Kg日增重和全程日增重的有利標記，AA基因型標記可用于提高豬生長速度的選擇標記。
表2 INPP5F基因多態(tài)性對30-100Kg日增重的影響

表3 INPP5F基因多態(tài)性對全程日增重的影響

序列表SEQUENCE LISTING<110>華中農(nóng)業(yè)大學<120>豬生長性狀基因INPP5F的克隆及其應用<130>
<141>2007-03-30<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>355<212>DNA<213>豬(Sus scrofa)
<220>
<221>gene<222>(1)..(355)<223>
<220>
<221>mutation<222>(279)..(279)<223>
<400>1gactcctacc actccgatga attccttaca aattccaagt ctgatgaaga taggcagcta60gccaactctt tagagaatgt agggccgata gactatgttc tgcctagttg tggcattatt120gcttcagcac ctcgtttagg cagtcgatcc cagtctatta gcagcactga tattagcatt180cacgttcctt cagaggttcc tactgctcat ggaagtgggc ttggaaaagg ccacgagtct240tctttgaaga aaagtccttc tgctgacaac atacacacrt tgactggctt tgccaagcct300gtggatgttt actgccacag atttgtccaa gacgcacaaa acaaagtgac ccagc 35權利要求
1.一種豬生長性狀基因/NPP5F，它的DNA序列如序列表SEQ ID NO1所述。
2.根據(jù)權利要求1所述的基因/NPP5F，其特征在于，序列表SEQ ID NO1的第279bp處有一個A279-G279的堿基突變，導致Hinc II-RFLP多態(tài)性。
3.權利要求1所述的一種豬生長性狀基因/NPP5F，其中檢測A279-G279堿基處的突變的正、反向引物的DNA序列如下所示正向5′GACTCCTACCACTCCGATGAAT 3′，反向5′GCTGGGTCACTTTGTTTTGTG 3′。
4.權利要求1或2所述的一種豬生長性狀基因/NPP5F在豬標記輔助選擇中的應用。
5.權利要求3所述的一種豬生長性狀基因INPP5F的引物在豬標記輔助選擇中的應用。
6.一種篩選豬生長性狀基因/NPP5F分子標記的方法，按照以下步驟用人INPP5F基因cDNA為信息探針，作同源序列篩選，獲得相似性90％以上的表達序列標簽；然后拼接豬表達序列標簽-重疊群；根據(jù)表達序列標簽-重疊群設計引物，利用引物進行PCR擴增，對獲得的PCR產(chǎn)物純化、克隆和測序，進行序列分析，獲得如序列表SEQ IDNO1所述的DNA序列。
全文摘要
本發(fā)明屬于動物基因工程技術領域，具體涉及豬生長性狀基因INPP5F的克隆及其應用。本發(fā)明克隆了一種豬生長性狀基因INPP5F，它的DNA序列如序列表SEQ ID NO1所述。序列表SEQ ID NO1的第279bp處有一個A279－G279的堿基突變，導致Hinc II－RFLP多態(tài)性。本發(fā)明還公開了豬生長性狀基因INPP5F的制備方法、引物設計以及在豬分子標記輔助選擇中的應用。
文檔編號C12N15/65GK101054581SQ20071005177
公開日2007年10月17日 申請日期2007年4月2日 優(yōu)先權日2007年4月2日
發(fā)明者趙書紅, 周泉勇, 朱猛進, 李奎, 劉榜, 樊斌, 余梅, 李長春 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學