專利名稱：克隆和轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的生產(chǎn)方法
背景技術(shù)：
核移植(或克隆)是用于生成多個(gè)相同胚胎的技術(shù)，它一般如下進(jìn)行收集未受精卵母細(xì)胞；或在體外或在體內(nèi)使這些卵母細(xì)胞成熟；將處于適當(dāng)成熟階段的卵母細(xì)胞去核；去核后，使卵母細(xì)胞與供體細(xì)胞或供體細(xì)胞核融合，供體細(xì)胞可以是來(lái)自胚胎、胎兒、或成年哺乳動(dòng)物的體細(xì)胞或非體細(xì)胞；可以在融合過(guò)程中同時(shí)激活去核卵母細(xì)胞與供體細(xì)胞，或在融合之前或之后進(jìn)行激活，例如可在將供體細(xì)胞或細(xì)胞核與去核卵母細(xì)胞一起保溫一段時(shí)間(如可長(zhǎng)達(dá)24小時(shí))后，例如通過(guò)化學(xué)或物理方法激活卵母細(xì)胞；然后立即移植產(chǎn)生的胚胎，或者，進(jìn)行體外培養(yǎng)并在直到胚泡階段的任何時(shí)間進(jìn)行移植。
發(fā)明概述本發(fā)明部分基于如下發(fā)現(xiàn)，即通過(guò)提供可為發(fā)育中生物體供給胚外成份的細(xì)胞，可優(yōu)化胚胎向稍后階段(如出生后動(dòng)物)的發(fā)育。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，通過(guò)移植重建胚胎以及四倍體聚集體，可降低核移植操作的有害后果。雖然使用重建胚胎技術(shù)有可能在幾種哺乳動(dòng)物物種中獲得足月妊娠，但是這些妊娠在移植后不久或圍產(chǎn)期大量喪失。此外，克隆妊娠的子代常常展示生理學(xué)缺陷和異常。這些后果可能是由克隆胚胎胚外成份的不適當(dāng)發(fā)育產(chǎn)生的。胚外細(xì)胞(如四倍體聚集體)可用于降低克隆胚胎胚外成份的缺陷。
因此，一方面，本發(fā)明的特色是促進(jìn)出生前非人動(dòng)物(如胚胎)發(fā)育的方法。該方法包括向胚胎提供一個(gè)或多個(gè)胚外細(xì)胞。在不希望受限于理論的同時(shí)，發(fā)明人認(rèn)為胚外細(xì)胞有助于或?qū)l(fā)育成胎盤或可促進(jìn)發(fā)育的其它非胚組織。因而，該方法包括向胚胎(如重建胚胎)提供一個(gè)或多個(gè)胚外細(xì)胞；使胚胎在體內(nèi)或在體外發(fā)育到稍后階段，如使胚胎完成足月妊娠以提供出生后非人動(dòng)物。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，胚外細(xì)胞是除了二倍體細(xì)胞以外的細(xì)胞，如倍性超過(guò)2的細(xì)胞；在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，胚外細(xì)胞是四倍體細(xì)胞。胚外細(xì)胞可衍生自胚胎，如融合細(xì)胞以增加倍性的胚胎，如四倍體化的兩細(xì)胞階段胚胎。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，胚胎是重建胚胎，如聯(lián)合第一種細(xì)胞的基因組與第二種功能性去核細(xì)胞(如去核卵母細(xì)胞)所產(chǎn)生的。例如，通過(guò)將細(xì)胞(例如體細(xì)胞，如胚胎、胎兒、或成年體細(xì)胞；干細(xì)胞或干細(xì)胞樣細(xì)胞(如由直到形成胚盤的胚胎獲得的細(xì)胞)；胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞基因組與受體細(xì)胞(例如功能性去核細(xì)胞，如去核卵母細(xì)胞)合并可形成重建胚胎?？蓪?duì)胚胎進(jìn)行克隆、遺傳工程操作、或二者兼之。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將來(lái)受精卵母細(xì)胞功能性去核，如去核。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)物理或化學(xué)方法將卵母細(xì)胞去核。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)融合將細(xì)胞基因組，例如體細(xì)胞(如成纖維細(xì)胞)或非體細(xì)胞(如干細(xì)胞、干細(xì)胞樣細(xì)胞、或生殖細(xì)胞)基因組，導(dǎo)入卵母細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)電、化學(xué)、或物理方法進(jìn)行融合。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在導(dǎo)入基因組之前、同時(shí)、或之后激活卵母細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，卵母細(xì)胞是通過(guò)電融合、離子載體激活、乙醇激活而激活的，或者處于激活階段，如分裂末期。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將重建胚胎移植到受體動(dòng)物中；在形成重建胚胎后將其移植到受體動(dòng)物中；在體外培養(yǎng)重建胚胎，如體外培養(yǎng)直至兩細(xì)胞階段、四細(xì)胞階段、八細(xì)胞階段、十六細(xì)胞階段、胚泡階段。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該方法包括使非人動(dòng)物發(fā)育至分娩期并由該非人動(dòng)物或其產(chǎn)物(如乳汁)獲得有用物質(zhì)(如蛋白質(zhì))。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，動(dòng)物是哺乳動(dòng)物，如山羊、綿羊、牛、豬、馬、兔、小鼠、美洲駝、或駱駝。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物是雄性或雌性哺乳動(dòng)物。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物分泌乳汁。
另一方面，本發(fā)明的特色是促進(jìn)出生前非人動(dòng)物(如胚胎)發(fā)育的方法，包括將供體基因組導(dǎo)入受體去核細(xì)胞以形成重建胚胎；將重建胚胎以及一個(gè)或多個(gè)胚外細(xì)胞聯(lián)合移植到受體非人哺乳動(dòng)物中，并使胚胎發(fā)育到稍后階段，如胎兒或出生后非人動(dòng)物。
重建胚胎可在任何時(shí)間(優(yōu)選移植前)聯(lián)合胚外細(xì)胞。因而，重建胚胎可在導(dǎo)入供體基因組之前、之時(shí)、或之后聯(lián)合胚外細(xì)胞。例如，胚外細(xì)胞可在導(dǎo)入供體基因組之前或之后聯(lián)合受體功能性去核細(xì)胞，如功能性去核卵母細(xì)胞。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，使重建胚胎發(fā)育成稍后階段，如使它完成足月妊娠以提供出生后非人動(dòng)物。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，胚外細(xì)胞是除了二倍體細(xì)胞以外的細(xì)胞，如倍性超過(guò)2的細(xì)胞；在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，胚外細(xì)胞是四倍體細(xì)胞。胚外細(xì)胞可衍生自胚胎，如四倍體化的兩細(xì)胞階段胚胎。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)合并細(xì)胞(例如體細(xì)胞，如胚胎、胎兒、或成年體細(xì)胞；干細(xì)胞或干細(xì)胞樣細(xì)胞，如由直到形成胚盤的胚胎獲得的細(xì)胞；胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞)基因組與受體細(xì)胞(例如功能性去核細(xì)胞，如去核卵母細(xì)胞)可形成重建胚胎。可對(duì)胚胎進(jìn)行克隆、遺傳工程操作、或二者兼之。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將未受精卵母細(xì)胞功能性去核，如去核。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)物理或化學(xué)方法將卵母細(xì)胞去核。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)融合將供體細(xì)胞基因組，例如體細(xì)胞或非體細(xì)胞(如干細(xì)胞、干細(xì)胞樣細(xì)胞、或生殖細(xì)胞)基因組，導(dǎo)入卵母細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)電、化學(xué)、或物理方法進(jìn)行融合。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在導(dǎo)入基因組之前、同時(shí)、或之后激活卵母細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，卵母細(xì)胞是通過(guò)電融合、離子載體激活、乙醇激活而激活的，或者處于激活階段，如分裂末期。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將重建胚胎移植到受體動(dòng)物中；在形成重建胚胎后將其移植到受體動(dòng)物中；在體外培養(yǎng)重建胚胎，如體外培養(yǎng)直至兩細(xì)胞階段、四細(xì)胞階段、八細(xì)胞階段、十六細(xì)胞階段、胚泡階段。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該方法還包括使用經(jīng)遺傳工程改造的基因組作為供體基因組?？稍趯⒐w基因組導(dǎo)入受體細(xì)胞之前或之后導(dǎo)入遺傳工程變化。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該方法還包括在供體基因組中導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因，如包含乳汁啟動(dòng)子以及與之偶聯(lián)的異源蛋白質(zhì)編碼序列的構(gòu)建物。可在將供體基因組導(dǎo)入受體細(xì)胞之前或之后導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，構(gòu)建物還包含一種或多種調(diào)控序列，如5’側(cè)翼序列、3’側(cè)翼序列、至少一種絕緣子序列。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該方法還包括使非人動(dòng)物發(fā)育至分娩期并由該非人動(dòng)物或其產(chǎn)物(如乳汁)獲得有用物質(zhì)(如蛋白質(zhì))。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，動(dòng)物是哺乳動(dòng)物，如山羊、綿羊、牛、豬、馬、兔、小鼠、美洲駝、或駱駝。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物是雄性或雌性哺乳動(dòng)物。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物分泌乳汁。
另一方面，本發(fā)明的特色是提供產(chǎn)物的方法，包括提供通過(guò)本文所述方法生成的非人動(dòng)物，如轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物；由該非人動(dòng)物獲得產(chǎn)物，例如由非人動(dòng)物的產(chǎn)物(如乳汁)獲得有用物質(zhì)(如多肽)。
另一方面，本發(fā)明的特色是聯(lián)合一個(gè)或多個(gè)胚外細(xì)胞的胚胎，如通過(guò)本文所述任何方法生成的聯(lián)合一個(gè)或多個(gè)胚外細(xì)胞的胚胎。
另一方面，本發(fā)明的特色是通過(guò)本文所述任何方法生成的非人動(dòng)物。
另一方面，本發(fā)明的特色是抑制由重建胚胎衍生的克隆非人哺乳動(dòng)物的缺陷的方法，包括將至少一個(gè)胚外細(xì)胞與重建胚胎合并；將胚胎移植到受體哺乳動(dòng)物中；并使胚胎發(fā)育成出生后哺乳動(dòng)物。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，胚外細(xì)胞是除了二倍體細(xì)胞以外的細(xì)胞，如倍性超過(guò)2的細(xì)胞；在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，胚外細(xì)胞是四倍體細(xì)胞。胚外細(xì)胞可衍生自胚胎，如融合細(xì)胞以增加倍性的胚胎，如已被四倍體化的兩細(xì)胞階段胚胎。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)合并細(xì)胞(例如體細(xì)胞，如胚胎、胎兒、或成年體細(xì)胞；干細(xì)胞或干細(xì)胞樣細(xì)胞，如由直到形成胚盤的胚胎獲得的細(xì)胞；胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞)基因組與受體細(xì)胞(例如功能性去核細(xì)胞，如去核卵母細(xì)胞)可形成重建胚胎。可對(duì)胚胎進(jìn)行克隆、遺傳工程操作、或二者兼之。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將未受精卵母細(xì)胞功能性去核，如去核。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)物理或化學(xué)方法將卵母細(xì)胞去核。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)融合將細(xì)胞基因組，例如體細(xì)胞(如成纖維細(xì)胞)或非體細(xì)胞(如干細(xì)胞、干細(xì)胞樣細(xì)胞、或生殖細(xì)胞)基因組，導(dǎo)入卵母細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)電、化學(xué)、或物理方法進(jìn)行融合。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在導(dǎo)入基因組之前、同時(shí)、或之后激活卵母細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，卵母細(xì)胞是通過(guò)電融合、離子載體激活、乙醇激活而激活的，或者處于激活階段，如分裂末期。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將重建胚胎移植到受體動(dòng)物中；在形成重建胚胎后將其移植到受體動(dòng)物中；在體外培養(yǎng)重建胚胎，如體外培養(yǎng)直至兩細(xì)胞階段、四細(xì)胞階段、八細(xì)胞階段、十六細(xì)胞階段、胚泡階段。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該方法包括使非人動(dòng)物發(fā)育至分娩期并由該非人動(dòng)物或其產(chǎn)物(如乳汁)獲得有用物質(zhì)(如蛋白質(zhì))。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，動(dòng)物是哺乳動(dòng)物，如山羊、綿羊、牛、豬、馬、兔、小鼠、美洲駝、或駱駝。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物是雄性或雌性哺乳動(dòng)物。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物分泌乳汁。
另一方面，本發(fā)明的特色是抑制受體哺乳動(dòng)物自發(fā)流產(chǎn)重建胚胎的方法，包括合并至少一個(gè)胚外細(xì)胞與重建胚胎；將胚胎移植到受體哺乳動(dòng)物中；并使胚胎發(fā)育成出生后哺乳動(dòng)物。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，胚外細(xì)胞是除了二倍體細(xì)胞以外的細(xì)胞，如倍性超過(guò)2的細(xì)胞；在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，胚外細(xì)胞是四倍體細(xì)胞。胚外細(xì)胞可衍生自胚胎，如融合細(xì)胞以增加倍性的胚胎，如已被四倍體化的兩細(xì)胞階段胚胎。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)合并細(xì)胞(例如體細(xì)胞，如胚胎、胎兒、或成年體細(xì)胞；干細(xì)胞或干細(xì)胞樣細(xì)胞，如由直到形成胚盤的胚胎獲得的細(xì)胞；胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞)基因組與受體細(xì)胞(例如功能性去核細(xì)胞，如去核卵母細(xì)胞)可形成重建胚胎?？蓪?duì)胚胎進(jìn)行克隆、遺傳工程操作、或二者兼之。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將未受精卵母細(xì)胞功能性去核，如去核。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)物理或化學(xué)方法將卵母細(xì)胞去核。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)融合將細(xì)胞基因組，例如體細(xì)胞(如成纖維細(xì)胞)或非體細(xì)胞(如干細(xì)胞、干細(xì)胞樣細(xì)胞、或生殖細(xì)胞)基因組，導(dǎo)入卵母細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)電、化學(xué)、或物理方法進(jìn)行融合。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在導(dǎo)入基因組之前、同時(shí)、或之后激活卵母細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，卵母細(xì)胞是通過(guò)電融合、離子載體激活、乙醇激活而激活的，或者處于激活階段，如分裂末期。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將重建胚胎移植到受體動(dòng)物中；在形成重建胚胎后將其移植到受體動(dòng)物中；在體外培養(yǎng)重建胚胎，如體外培養(yǎng)直至兩細(xì)胞階段、四細(xì)胞階段、八細(xì)胞階段、十六細(xì)胞階段、胚泡階段。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括由出生后動(dòng)物或其產(chǎn)物(如乳汁)獲得有用物質(zhì)(如蛋白質(zhì))。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，動(dòng)物是哺乳動(dòng)物，如山羊、綿羊、牛、豬、馬、兔、小鼠、美洲駝、或駱駝。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物是雄性或雌性哺乳動(dòng)物。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物分泌乳汁。
另一方面，本發(fā)明的特色是生成克隆非人哺乳動(dòng)物的方法，包括形成聯(lián)合至少一個(gè)胚外細(xì)胞的重建胚胎；將胚胎移植到受體哺乳動(dòng)物中；并使胚胎發(fā)育成出生后哺乳動(dòng)物，由此獲得克隆哺乳動(dòng)物。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，胚外細(xì)胞是除了二倍體細(xì)胞以外的細(xì)胞，如倍性超過(guò)2的細(xì)胞；在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，胚外細(xì)胞是四倍體細(xì)胞。胚外細(xì)胞可衍生自胚胎，如融合細(xì)胞以增加倍性的胚胎，如已被四倍體化的兩細(xì)胞階段胚胎。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)合并細(xì)胞(例如體細(xì)胞，如胚胎、胎兒、或成年體細(xì)胞；干細(xì)胞或干細(xì)胞樣細(xì)胞，如由直到形成胚盤的胚胎獲得的細(xì)胞；胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞)基因組與受體細(xì)胞(例如功能性去核細(xì)胞，如去核卵母細(xì)胞)可形成重建胚胎?？蓪?duì)胚胎進(jìn)行克隆、遺傳工程操作、或二者兼之。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將未受精卵母細(xì)胞功能性去核，如去核。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)物理或化學(xué)方法將卵母細(xì)胞去核。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)融合將細(xì)胞基因組，例如體細(xì)胞(如成纖維細(xì)胞)或非體細(xì)胞(如干細(xì)胞、干細(xì)胞樣細(xì)胞、或生殖細(xì)胞)基因組，導(dǎo)入卵母細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)電、化學(xué)、或物理方法進(jìn)行融合。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在導(dǎo)入基因組之前、同時(shí)、或之后激活卵母細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，卵母細(xì)胞是通過(guò)電融合、離子載體激活、乙醇激活而激活的，或者處于激活階段，如分裂末期。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將重建胚胎移植到受體動(dòng)物中；在形成重建胚胎后將其移植到受體動(dòng)物中；在體外培養(yǎng)重建胚胎，如體外培養(yǎng)直至兩細(xì)胞階段、四細(xì)胞階段、八細(xì)胞階段、十六細(xì)胞階段、胚泡階段。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該方法包括由非人哺乳動(dòng)物或其產(chǎn)物(如乳汁)獲得有用物質(zhì)(如蛋白質(zhì))。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物是山羊、綿羊、牛、豬、馬、兔、小鼠、美洲駝、或駱駝。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物是雄性或雌性哺乳動(dòng)物。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物分泌乳汁。
另一方面，本發(fā)明的特色是生成轉(zhuǎn)基因非人哺乳動(dòng)物的方法，包括將經(jīng)遺傳工程改造的哺乳動(dòng)物供體細(xì)胞基因組導(dǎo)入卵母細(xì)胞以形成聯(lián)合至少一個(gè)胚外細(xì)胞的重建胚胎；將胚胎移植到受體哺乳動(dòng)物中；并使重建胚胎發(fā)育成出生后哺乳動(dòng)物，由此提供轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，胚外細(xì)胞是除了二倍體細(xì)胞以外的細(xì)胞，如倍性超過(guò)2的細(xì)胞；在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，胚外細(xì)胞是四倍體細(xì)胞。胚外細(xì)胞可衍生自胚胎，如融合細(xì)胞以增加倍性的胚胎，如四倍體化的兩細(xì)胞階段胚胎。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)合并細(xì)胞(例如體細(xì)胞，如胚胎、胎兒、或成年體細(xì)胞；干細(xì)胞或干細(xì)胞樣細(xì)胞，如由直到形成胚盤的胚胎獲得的細(xì)胞；胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞)基因組與受體細(xì)胞(例如功能性去核細(xì)胞，如去核卵母細(xì)胞)可形成重建胚胎。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將未受精卵母細(xì)胞功能性去核，如去核。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)物理或化學(xué)方法將卵母細(xì)胞去核。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)融合將細(xì)胞基因組，例如體細(xì)胞(如成纖維細(xì)胞)或非體細(xì)胞(如干細(xì)胞、干細(xì)胞樣細(xì)胞、或生殖細(xì)胞)基因組，導(dǎo)入卵母細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)電、化學(xué)、或物理方法進(jìn)行融合。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在導(dǎo)入基因組之前、同時(shí)、或之后激活卵母細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，卵母細(xì)胞是通過(guò)電融合、離子載體激活、乙醇激活而激活的，或者處于激活階段，如分裂末期。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將重建胚胎移植到受體動(dòng)物中；在形成重建胚胎后將其移植到受體動(dòng)物中；在體外培養(yǎng)重建胚胎，如體外培養(yǎng)直至兩細(xì)胞階段、四細(xì)胞階段、八細(xì)胞階段、十六細(xì)胞階段、胚泡階段。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該方法還包括由非人哺乳動(dòng)物或其產(chǎn)物(如乳汁)獲得有用物質(zhì)(如蛋白質(zhì))。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物是山羊、綿羊、牛、豬、馬、兔、小鼠、美洲駝、或駱駝。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物是雄性或雌性哺乳動(dòng)物。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物分泌乳汁。
發(fā)明詳述供體基因組供體基因組可以是天然發(fā)生的或遺傳加工的。供體基因組可衍生自胚胎、胎兒、或成年細(xì)胞。細(xì)胞可以是體細(xì)胞或非體細(xì)胞，如不屬于體細(xì)胞譜系的細(xì)胞。
體細(xì)胞體細(xì)胞可以為生成重建胚胎提供基因組。在用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)“體細(xì)胞”指分化細(xì)胞。該細(xì)胞可以是體細(xì)胞或?qū)儆隗w細(xì)胞譜系的細(xì)胞?；蛘?，可以利用將生成生殖細(xì)胞的二倍體干細(xì)胞為生成重建胚胎提供基因組。
體細(xì)胞可以來(lái)自動(dòng)物或細(xì)胞培養(yǎng)物。若來(lái)自動(dòng)物，則動(dòng)物可處于任何發(fā)育階段，如胚胎、胎兒、或成體。優(yōu)選胚胎細(xì)胞。胚胎細(xì)胞可包括胚胎干細(xì)胞以及屬于體細(xì)胞譜系的胚胎細(xì)胞。這些細(xì)胞可得自胚胎的內(nèi)胚層、中胚層、或外胚層。優(yōu)選的是，胚胎細(xì)胞屬于體細(xì)胞譜系。屬于體細(xì)胞譜系的胚胎細(xì)胞指在胚胎形成第10天或以后分離的細(xì)胞。然而，可以在胚胎形成第10天以前獲取細(xì)胞。若將細(xì)胞系用作染色體基因組的來(lái)源，則優(yōu)選原代細(xì)胞。在用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)“原代細(xì)胞系”包括原代細(xì)胞系以及原代衍生細(xì)胞系。
合適體細(xì)胞包括成纖維細(xì)胞(例如原代成纖維細(xì)胞，如胚胎原代成纖維細(xì)胞)、肌細(xì)胞(例如肌原細(xì)胞)、卵丘細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、和乳房細(xì)胞。其它合適細(xì)胞包括肝細(xì)胞和胰島。優(yōu)選的是，體細(xì)胞是胚胎體細(xì)胞，如在胚胎形成第10天或以后分離的細(xì)胞。體細(xì)胞基因組可以是天然發(fā)生的基因組(如用于生成克隆哺乳動(dòng)物)，或者基因組可以經(jīng)遺傳改變而包含轉(zhuǎn)基因序列(如用于生成轉(zhuǎn)基因克隆哺乳動(dòng)物)。
例如可如下獲得體細(xì)胞，如通過(guò)機(jī)械(如剁碎、切碎)或酶促(如胰蛋白酶消化)方法解離組織以獲得細(xì)胞懸浮液，然后培養(yǎng)細(xì)胞直至獲得匯合單層。然后可收獲并制備體細(xì)胞以冷藏，或者作為原種培養(yǎng)物維持。
體細(xì)胞可以是休眠或非休眠的體細(xì)胞。在用于本文時(shí)，“非休眠的”指細(xì)胞處于有絲分裂細(xì)胞周期中。有絲分裂細(xì)胞周期具有四個(gè)不同期，即G1、S、G2、和M期。細(xì)胞周期的開始事件，稱為啟動(dòng)點(diǎn)，發(fā)生于G1期。在用于本文時(shí)，“啟動(dòng)點(diǎn)”指細(xì)胞周期中細(xì)胞經(jīng)歷細(xì)胞周期之前的早G1期。例如，在細(xì)胞進(jìn)入G1期之后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、直到11小時(shí)，認(rèn)為細(xì)胞處于啟動(dòng)點(diǎn)以前。啟動(dòng)點(diǎn)決定細(xì)胞是否將經(jīng)歷另一個(gè)細(xì)胞周期。一旦細(xì)胞通過(guò)了啟動(dòng)點(diǎn)，那么它將經(jīng)歷剩余G1期(即DNA合成前期)。S期是DNA合成期，隨后是介于合成與有絲分裂之間的G2期。有絲分裂發(fā)生于M期。若處于啟動(dòng)點(diǎn)，細(xì)胞不經(jīng)歷另一個(gè)細(xì)胞周期，則細(xì)胞變成休眠的。另外，可以誘導(dǎo)細(xì)胞退出細(xì)胞周期并變成休眠的。“休眠”細(xì)胞，也稱為處于G0期的細(xì)胞，指不處于細(xì)胞周期四個(gè)階段之任一階段的細(xì)胞。優(yōu)選的是，體細(xì)胞是處于G0期或有絲分裂細(xì)胞周期G1期的細(xì)胞。
使用處于細(xì)胞周期某一階段(如G0或G1期)的供體體細(xì)胞，能夠在卵母細(xì)胞與體細(xì)胞基因組之間實(shí)現(xiàn)同步。例如，通過(guò)同時(shí)激活和融合將G0或G1期體細(xì)胞細(xì)胞核導(dǎo)入中期II卵母細(xì)胞而進(jìn)行的重建，可以模擬受精過(guò)程中發(fā)生的事件。又例如，通過(guò)同時(shí)激活和融合使分裂末期II卵母細(xì)胞與啟動(dòng)點(diǎn)前G1期體細(xì)胞基因組融合，可以在卵母細(xì)胞和供體細(xì)胞核之間實(shí)現(xiàn)細(xì)胞周期的同步。
用于確定細(xì)胞處于細(xì)胞周期哪一個(gè)階段的方法是已知的。例如，如下文實(shí)施例所述，細(xì)胞周期的不同階段存在多種標(biāo)記物。這些標(biāo)記物包括細(xì)胞周期蛋白D1、2、3，G1期的增殖細(xì)胞核抗原(proliferatingcell nuclear antigen，PCNA)，和用于檢測(cè)DNA合成活性的BrDu。另外，通過(guò)在缺少血清的培養(yǎng)基上培養(yǎng)細(xì)胞，可以誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入G0期。在本文中，這些細(xì)胞也稱為“血清饑餓細(xì)胞”?；蛘撸ㄟ^(guò)血清激活，可以誘導(dǎo)處于G0期的細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期，即G1期(也稱為“非血清饑餓細(xì)胞”)。經(jīng)基因工程改造的體細(xì)胞轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物用于生成非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物作為生成重建胚胎的體細(xì)胞來(lái)源的方法在本領(lǐng)域是已知的。這些方法可包括將DNA構(gòu)建物導(dǎo)入哺乳動(dòng)物種系以生成轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物。例如，可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)基因技術(shù)將一個(gè)或幾個(gè)拷貝的構(gòu)建物摻入哺乳動(dòng)物胚胎的基因組。
雖然山羊是遺傳工程改造的體細(xì)胞的優(yōu)選來(lái)源，但是也可以使用其它非人哺乳動(dòng)物。優(yōu)選的非人哺乳動(dòng)物是反芻動(dòng)物，如牛、綿羊、駱駝、或山羊。瑞士起源的山羊，如Alpine、Saanen、和Toggenburg品種的山羊，可用于本文描述的方法。優(yōu)選非人動(dòng)物的其它范例包括牛、馬、美洲駝、和豬。用作經(jīng)遺傳工程改造細(xì)胞來(lái)源的哺乳動(dòng)物取決于將要通過(guò)本發(fā)明的方法獲得的轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物，例如應(yīng)當(dāng)將山羊基因組導(dǎo)入山羊功能性去核卵母細(xì)胞。
優(yōu)選的是，用于本發(fā)明的體細(xì)胞得自轉(zhuǎn)基因山羊。用于生成轉(zhuǎn)基因山羊的方法在本領(lǐng)域是已知的。例如，可以如Ebert等人，Bio/Technology，12699，1994(收入本文作為參考)中所述通過(guò)顯微注射將轉(zhuǎn)基因?qū)肷窖虻姆N系。
可以通過(guò)將轉(zhuǎn)基因?qū)敕侨藙?dòng)物的種系來(lái)制成用作經(jīng)遺傳工程改造體細(xì)胞來(lái)源的其它轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物。處于各種發(fā)育階段的胚胎靶細(xì)胞可用于導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因。根據(jù)胚胎靶細(xì)胞的發(fā)育階段，使用不同方法。根據(jù)好的全面健康狀況、好的胚胎產(chǎn)量、胚胎中好的前核可見度、和好的生殖適合度，選擇用于實(shí)踐本發(fā)明的任何動(dòng)物的特定品系。另外，單倍型是重要因素。
經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系經(jīng)遺傳工程改造的體細(xì)胞可得自已導(dǎo)入了目的核酸(如編碼蛋白質(zhì)的核酸)的細(xì)胞系。
可以通過(guò)常規(guī)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染技術(shù)將構(gòu)建物導(dǎo)入細(xì)胞。在用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)染”和“轉(zhuǎn)化”包括用于將轉(zhuǎn)基因序列導(dǎo)入宿主細(xì)胞的多種技術(shù)，包括磷酸鈣或氯化鈣共沉淀、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、脂轉(zhuǎn)染、或電穿孔。另外，可以如下文所述使用生物學(xué)載體，如病毒載體?？梢栽赟ambrook等人，Molecular CloningA Laboratory Manual，第2版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，NY，1989和其它合適實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)中找到用于轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的合適方法。
兩種有用方法是電穿孔和脂轉(zhuǎn)染。下文描述了它們的簡(jiǎn)要范例。
可以通過(guò)電穿孔使用如下方案將DNA構(gòu)建物穩(wěn)定導(dǎo)入供體體細(xì)胞系以大約4×106個(gè)細(xì)胞/ml將體細(xì)胞(例如成纖維細(xì)胞，如胚胎成纖維細(xì)胞)重懸于PBS中。向0.5ml細(xì)胞懸浮液中加入50μg線性化DNA，并將懸浮液置于0.4cm電擊杯(Biorad)中。使用Biorad Gene Pulser電擊儀進(jìn)行電穿孔，25mA、1000μF、和無(wú)限電阻的330V脈沖。若DNA構(gòu)建物包含用于選擇的新霉素抗性基因，則在與350μg/ml G418(BibcoBRL)保溫15天后選擇新霉素抗性克隆。
可以通過(guò)脂轉(zhuǎn)染使用如下方案將DNA構(gòu)建物穩(wěn)定導(dǎo)入供體體細(xì)胞系將大約2×105個(gè)細(xì)胞置于3.5cm直徑的孔中，并使用LipofectAMINETM(GibcoBRL)轉(zhuǎn)染2μg線性化DNA。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，將細(xì)胞以1∶1000和1∶5000分離。若DNA構(gòu)建物包含用于選擇的新霉素抗性基因，則加入G418至終濃度0.35mg/ml。分離并擴(kuò)增新霉素抗性克隆，用于冷藏以及核移植。經(jīng)遺傳工程改造的基因組的構(gòu)建物蛋白質(zhì)的組織特異性表達(dá)常常希望在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的特定組織或流體(如乳汁)中表達(dá)蛋白質(zhì)(如異源蛋白)。可以由表達(dá)異源蛋白的組織或流體回收異源蛋白。例如，常常希望在乳汁中表達(dá)異源蛋白。下文描述了用于在乳汁特異性啟動(dòng)子控制下生成異源蛋白的方法。另外，下文描述了其它組織特異性啟動(dòng)子以及其它調(diào)控元件(如信號(hào)序列和增強(qiáng)非分泌蛋白分泌的序列)。
乳汁特異性啟動(dòng)子有用的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子是那些優(yōu)先在哺乳動(dòng)物上皮細(xì)胞中激活的啟動(dòng)子，包括控制乳汁蛋白質(zhì)(諸如酪蛋白、β-乳球蛋白(Claek等人，Bio/Technology，7487-492，1989)、乳清酸性蛋白質(zhì)(Gordon等人，Bio/Technology，51183-1187，1987)、和乳清蛋白(Soulier等人，F(xiàn)EBS Letts.，29713，1992))編碼基因的啟動(dòng)子。酪蛋白啟動(dòng)子可衍生自任何哺乳動(dòng)物物種的α、β、γ或κ-酪蛋白基因；優(yōu)選啟動(dòng)子衍生自山羊β-酪蛋白基因(Di tullio，Bio/Technology，1074-77，1992)。乳汁特異性蛋白質(zhì)啟動(dòng)子和在哺乳動(dòng)物組織中特異性激活的啟動(dòng)子可衍生自cDNA或基因組序列。優(yōu)選的是，它們是基因組起源的。
可以在至少一種，常常是幾種生物體中獲得上文所列乳腺特異性基因的DNA序列信息。參閱例如Richards等人，J.Biol.Chem.，256526-532，1981(α-乳清蛋白，大鼠)；Campbell等人，Nucleic AcidsRes.，128685-8697，1984(WAP，大鼠)；Jones等人，J.Biol.Chem.，2607042-7050，1985(β-酪蛋白，大鼠)；Yu-Lee和Rosen，J.Biol.Chem.，25810794-10804，1983(γ-酪蛋白，大鼠)；Hall，Biochem.J.，242735-742，1987(α-乳清蛋白，人類)；Stewart，NucleicAcids Res.，12389，1984(αs1和κ-酪蛋白cDNA，牛)；Gorodetsky等人，Gene，6687-96，1988(β-酪蛋白，牛)；Alexander等人，Eur.J.Biochem.，178395-401，1988(κ-酪蛋白，牛)；Brignon等人，F(xiàn)EBSLett.，18848-55，1977(αS2-酪蛋白，牛)；Jamieson等人，Gene，6185-90，1987、Ivanov等人，Biol.Chem.Hoppe-Seyler，369425-429，1988、Alexander等人，Nucleic AcidsRes.，176739，1989(β-乳球蛋白，牛)；Vilotte等人，Biochimie，69609-620，1987(α-乳清蛋白，牛)。Mercier和Vilotte，J.DairySci.，763079-3098，1993(完整收入本文作為參考用于所有目的)回顧了多種乳汁蛋白質(zhì)基因的結(jié)構(gòu)和功能。若額外側(cè)翼序列對(duì)于優(yōu)化異源蛋白的表達(dá)是有用的，則可以使用現(xiàn)有序列作為探針來(lái)克隆這些序列。可以使用相關(guān)連核苷酸序列或針對(duì)關(guān)連蛋白質(zhì)的抗體作為探針來(lái)篩選來(lái)自不同生物體的文庫(kù)，從而獲得來(lái)自這些生物體的乳腺特異性調(diào)控序列。
信號(hào)序列有用的信號(hào)序列是乳汁特異性信號(hào)序列或?qū)е抡婧嘶蛟说鞍踪|(zhì)分泌的其它信號(hào)序列。優(yōu)選的是，信號(hào)序列選自乳汁特異性信號(hào)序列，即來(lái)自分泌到乳汁中的產(chǎn)物的編碼基因。最優(yōu)選的是，乳汁特異性信號(hào)序列與下文所述構(gòu)建物中使用的乳汁特異性啟動(dòng)子有關(guān)。信號(hào)序列的大小并不重要。所有要求就是序列大小足以實(shí)現(xiàn)期望重組蛋白(如在乳房組織中)的分泌。例如，可以使用來(lái)自酪蛋白(如α、β、γ、或κ-酪蛋白)、β-乳球蛋白、乳清酸性蛋白質(zhì)、和乳清蛋白編碼基因的信號(hào)序列。優(yōu)選信號(hào)序列是山羊β-酪蛋白信號(hào)序列。
也可以使用來(lái)自其它分泌蛋白(如由腎細(xì)胞、胰細(xì)胞、或肝細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì))的信號(hào)序列。優(yōu)選的是，信號(hào)序列導(dǎo)致蛋白質(zhì)分泌到例如尿液或血液中。
分泌蛋白的氨基末端區(qū)還可以通過(guò)某種方式修飾非分泌蛋白從而使之分泌，諸如在將待分泌蛋白質(zhì)中包含通常分泌的蛋白質(zhì)的所有或部分編碼序列。優(yōu)選的是，在蛋白質(zhì)序列中包含的不是通常分泌的蛋白質(zhì)的完整序列，而是足以導(dǎo)致蛋白質(zhì)分泌的通常分泌的蛋白質(zhì)氨基末端一部分。例如，將通常不分泌的蛋白質(zhì)(通常在氨基末端)與通常分泌的蛋白質(zhì)的氨基末端片段融合。
一方面，通常分泌的蛋白質(zhì)是通常分泌到乳汁中的蛋白質(zhì)。這類蛋白質(zhì)包括由乳房上皮細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì)，乳汁蛋白質(zhì)，諸如酪蛋白、β-乳球蛋白、乳清酸性蛋白質(zhì)、和乳清蛋白。酪蛋白包括任何哺乳動(dòng)物物種的α、β、γ、或κ-酪蛋白基因。優(yōu)選的蛋白質(zhì)是β-酪蛋白，如山羊β-酪蛋白。分泌蛋白的編碼序列可衍生自cDNA或基因組序列。優(yōu)選的是，它們是基因組起源的，而且包含一個(gè)或多個(gè)內(nèi)含子。
其它組織特異性啟動(dòng)子可以使用在特定組織中提供表達(dá)的其它組織特異性啟動(dòng)子。組織特異性啟動(dòng)子是在特定組織中比其它組織表達(dá)更強(qiáng)的啟動(dòng)子。組織特異性啟動(dòng)子常?；旧蟽H在特定組織中表達(dá)。
可以使用的組織特異性啟動(dòng)子包括神經(jīng)特異性啟動(dòng)子，如nestin、Wnt-1、Pax-1、Engrailed-1、Engrailed-2、Sonic hedgehog；肝特異性啟動(dòng)子，如清蛋白、α1-抗胰蛋白酶；肌肉特異性啟動(dòng)子，如肌細(xì)胞生成素、肌動(dòng)蛋白、MyoD、肌球蛋白；卵母細(xì)胞特異性啟動(dòng)子，如ZP1、ZP2、ZP3；睪丸特異性啟動(dòng)子，如魚精蛋白(protamine)、fertilin、聯(lián)會(huì)復(fù)合體蛋白質(zhì)-1；血液特異性啟動(dòng)子，如球蛋白、GATA-1、膽色素原脫氨酶；肺特異性啟動(dòng)子，如表面活性物質(zhì)蛋白質(zhì)C；皮膚或毛發(fā)特異性啟動(dòng)子，如角蛋白、彈性蛋白；內(nèi)皮特異性啟動(dòng)子，如Tie-1、Tie-2；和骨特異性啟動(dòng)子，如BMP。
另外，通用啟動(dòng)子可用于在幾種組織中的表達(dá)。通用啟動(dòng)子的范例包括β-肌動(dòng)蛋白、ROSA-21、PGK、FOS、c-myc、Jun-A、和Jun-B。
絕緣子序列用于生成轉(zhuǎn)基因重建胚胎的DNA構(gòu)建物可以包含至少一個(gè)絕緣子序列。術(shù)語(yǔ)“絕緣子”、“絕緣子序列”、和“絕緣子元件”在本文中可以互換使用。絕緣子元件是隔離置于其作用范圍內(nèi)的基因轉(zhuǎn)錄的控制元件，但是它既不正面也不負(fù)面影響基因表達(dá)。優(yōu)選的是，將絕緣子序列插入待轉(zhuǎn)錄序列的任一端。例如，絕緣子可以位于啟動(dòng)子5’端大約200bp-大約1kb，位于目的基因3’端距離啟動(dòng)子至少大約1kb-5bk。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員可以根據(jù)構(gòu)建物中使用的目的基因、啟動(dòng)子、和增強(qiáng)子的相對(duì)大小來(lái)確定絕緣子序列與啟動(dòng)子和目的基因3’端之間的距離。另外，超過(guò)一個(gè)絕緣子序列可以位于啟動(dòng)子5’端，或者位于轉(zhuǎn)基因3’端。例如，兩個(gè)或多個(gè)絕緣子序列可以位于啟動(dòng)子5’端。位于轉(zhuǎn)基因3’端的絕緣子可以位于目的基因的3’端，或者位于3’調(diào)控序列(如3’非翻譯區(qū)(UTR)或3’側(cè)翼序列)的3’端。
優(yōu)選絕緣子是涵蓋小雞β-珠蛋白基因座5’末端且對(duì)應(yīng)于小雞5’組成性超敏位點(diǎn)的DNA區(qū)段，描述于PCT發(fā)表物94/23046(將它的內(nèi)容收入本文作為參考)。
DNA構(gòu)建物可以將編碼異源蛋白的盒裝配成包含用于特定組織(如乳房上皮細(xì)胞)的啟動(dòng)子(例如酪蛋白啟動(dòng)子，如山羊β-酪蛋白啟動(dòng)子)、乳汁特異性信號(hào)序列(例如酪蛋白信號(hào)序列，如β-酪蛋白信號(hào)序列)、和編碼該異源蛋白的DNA的構(gòu)建物。
構(gòu)建物還可以在編碼非分泌蛋白的DNA序列下游包含3’非翻譯區(qū)。這些區(qū)域可以穩(wěn)定表達(dá)系統(tǒng)的RNA轉(zhuǎn)錄本，并由此增加表達(dá)系統(tǒng)生成期望蛋白質(zhì)的產(chǎn)量。可用于本發(fā)明構(gòu)建物的有用3’非翻譯區(qū)是提供polyA信號(hào)的序列。這類序列可衍生自例如SV40小t抗原、酪蛋白3’非翻譯區(qū)、或本領(lǐng)域眾所周知的其它3’非翻譯區(qū)。一方面，3’非翻譯區(qū)可衍生自乳汁特異性蛋白質(zhì)。3’非翻譯區(qū)的長(zhǎng)度并不重要，但是其polyA轉(zhuǎn)錄本的穩(wěn)定作用在穩(wěn)定表達(dá)序列的RNA中顯得比較重要。
任選的是，構(gòu)建物可以在啟動(dòng)子與編碼信號(hào)序列的DNA序列之間包含5’非翻譯區(qū)。這類非翻譯區(qū)可來(lái)自與獲得啟動(dòng)子相同的控制區(qū)域，或者可來(lái)自不同基因，如它們可衍生自其它合成、半合成、或天然來(lái)源。同樣，它們的具體長(zhǎng)度并不重要，但是它們?cè)诟倪M(jìn)表達(dá)水平中似乎有用。
構(gòu)建物還可以包含優(yōu)先在乳房上皮細(xì)胞中表達(dá)的基因N端編碼區(qū)的大約10％、20％、30％、或更多。例如，N端編碼區(qū)可對(duì)應(yīng)于所用啟動(dòng)子，如山羊β-酪蛋白N端編碼區(qū)。
可以使用本領(lǐng)域已知方法制備構(gòu)建物。可以作為大型質(zhì)粒的一部分制備構(gòu)建物。這種制備能夠以有效方式克隆并選擇正確構(gòu)建。構(gòu)建物可以位于質(zhì)粒上方便限制性位點(diǎn)之間，從而易于由剩余質(zhì)粒序列分離，以便摻入期望的哺乳動(dòng)物。
異源蛋白可以將編碼異源蛋白的轉(zhuǎn)基因序列導(dǎo)入非人哺乳動(dòng)物的種系，或者轉(zhuǎn)染到細(xì)胞系中，以提供上文所述遺傳工程化改造的體細(xì)胞來(lái)源。
蛋白質(zhì)可以是復(fù)合物或多聚體蛋白質(zhì)，如同型或異型多聚體，如天然為同型或異型的多聚體蛋白質(zhì)，如同型或異型二聚體、三聚體、或四聚體。蛋白質(zhì)可以是通過(guò)除去(如切割)N端或C端或內(nèi)部片段而得到加工的蛋白質(zhì)。甚至可以活性形式表達(dá)復(fù)合物蛋白質(zhì)?？梢詫?dǎo)入哺乳動(dòng)物(如山羊)基因組的蛋白質(zhì)編碼序列包括糖蛋白、神經(jīng)肽、免疫球蛋白、酶、肽、和激素。蛋白質(zhì)可以是天然蛋白或重組蛋白，如片段、融合蛋白(如免疫球蛋白融合蛋白)、或突變蛋白。它可以是人或非人起源。異源蛋白可以是潛在的治療或藥用試劑，諸如但不限于α1-蛋白酶抑制劑、α1-抗胰蛋白酶、堿性磷酸酶、血管生成素、抗凝血酶III、任何血液凝結(jié)因子(包括因子VIII、因子IX、和因子X)、幾丁質(zhì)酶、核心蛋白聚糖、促紅細(xì)胞生成素、胞外超氧化物歧化酶、纖維蛋白原、葡糖腦苷脂酶、谷氨酸脫羧酶、人生長(zhǎng)因子、人血清清蛋白、免疫球蛋白、胰島素、髓鞘堿性蛋白、血小板衍生生長(zhǎng)因子、胰島素原、催乳素、可溶性CD4或其成份或復(fù)合物、乳鐵蛋白、乳球蛋白、溶菌酶、乳清蛋白、組織纖溶酶原激活物、或其變體。
免疫球蛋白是特別優(yōu)選的異源蛋白。免疫球蛋白的范例包括IgA、IgG、IgE、IgM、嵌合抗體、人源化抗體、重組抗體、單鏈抗體、和抗體-蛋白質(zhì)融合物。
可以在至少一種，常常是幾種生物體中獲得上文所列幾種異源蛋白編碼基因的核苷酸序列信息。參閱例如Long等人，Biochem.，23(21)4828-4837，1984(α1-抗胰蛋白酶)；Mitchell等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，837182-7186，1986(堿性磷酸酶)；Schneider等人，EMBO J.，7(13)4151-4156，1988(血管生成素)；Bock等人，Biochem.，27(16)6171-6178，1988(抗凝血酶III)；0lds等人，Br.J.Haematol.，78(3)408-413，1991(抗凝血酶III)；Lin等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82(22)7580-7584，1985(促紅細(xì)胞生成素)；美國(guó)專利號(hào)5,614,184(促紅細(xì)胞生成素)；Horowitz等人，Genomics，4(1)87-96，1989(葡糖腦苷脂酶)；Kelly等人，Ann.Hum.Genet.，56(3)255-265，1992(谷氨酸脫羧酶)；美國(guó)專利號(hào)5,707,828(人血清清蛋白)；美國(guó)專利號(hào)5,652,352(人血清清蛋白)；Lawn等人，，Nucleic AcidsRes.，9(22)6103-6114，1981(人血清清蛋白)；Kamholz等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83(13)4962-4966，1986(髓鞘堿性蛋白)；Hiraoka等人，Mol.Cell Endocrinol.，75(1)71-80，1991(催乳素)；美國(guó)專利號(hào)5,571,896(乳鐵蛋白)；Pennica等人，Nature，301(5897)214-221，1983(組織纖溶酶原激活物)；Sarafanov等人，Mol.Biol.，29161-165，1995(將它們的內(nèi)容收入本文作為參考)。受體細(xì)胞可以使用可支持發(fā)育成稍后階段的任何功能性去核細(xì)胞。特別優(yōu)選卵母細(xì)胞。
卵母細(xì)胞可用于生成重建胚胎的卵母細(xì)胞包括處于中期II的卵母細(xì)胞，如停頓于中期II和末期II的卵母細(xì)胞。處于中期II的卵母細(xì)胞包含一個(gè)極體，然而可以根據(jù)細(xì)胞質(zhì)膜由第二個(gè)極體突起的存在直至第二個(gè)極體的形成，來(lái)鑒定處于末期的卵母細(xì)胞。另外，可以根據(jù)生化和/或發(fā)育差別，將處于中期II的卵母細(xì)胞與處于末期II的卵母細(xì)胞區(qū)分開來(lái)。例如，中期II卵母細(xì)胞可以處于停頓狀態(tài)，而末期卵母細(xì)胞處于激活狀態(tài)。優(yōu)選的是，卵母細(xì)胞是山羊卵母細(xì)胞。其它優(yōu)選卵母細(xì)胞來(lái)源包括綿羊、牛、豬、美洲駝、駱駝、兔、和小鼠。
可以在哺乳動(dòng)物生殖周期中的多個(gè)時(shí)間獲得卵母細(xì)胞。例如，在生殖周期的指定時(shí)間，顯著百分比的卵母細(xì)胞，如大約55％、60％、65％、70％、75％、80％、或更多，是處于末期的卵母細(xì)胞。另外，可以獲得處于細(xì)胞周期各個(gè)階段的卵母細(xì)胞，并在體外誘導(dǎo)而進(jìn)入減數(shù)分裂的特定階段。例如，在血清饑餓培養(yǎng)基上培養(yǎng)的卵母細(xì)胞停頓于末期。另外，通過(guò)血清激活可以誘導(dǎo)停頓卵母細(xì)胞進(jìn)入末期。因而，可以容易的獲得處于末期的卵母細(xì)胞以用于本發(fā)明。
在用于形成重建胚胎之前，可以使卵母細(xì)胞在體外成熟。該過(guò)程通常需要由哺乳動(dòng)物卵巢收集未成熟卵母細(xì)胞，并在去核前使卵母細(xì)胞在培養(yǎng)基中成熟，直至卵母細(xì)胞達(dá)到期望減數(shù)分裂階段，如中期或末期。另外，可以將已經(jīng)在體外成熟的卵母細(xì)胞用于生成重建胚胎。
可以在超排卵過(guò)程中由雌性哺乳動(dòng)物收集卵母細(xì)胞。簡(jiǎn)而言之，可以通過(guò)手術(shù)回收卵母細(xì)胞，即沖洗來(lái)自雌性供體輸卵管的卵母細(xì)胞。用于誘導(dǎo)超排卵和收集卵母細(xì)胞的方法是已知的。
優(yōu)選的是，卵母細(xì)胞的有絲分裂階段，如中期II或末期II，與供體體細(xì)胞的細(xì)胞周期階段相關(guān)。卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂階段與供體體細(xì)胞的細(xì)胞周期有絲分裂階段之間的相關(guān)性在本文中稱為“同步”。例如，通過(guò)同時(shí)激活和融合將G0或G1期體細(xì)胞細(xì)胞核導(dǎo)入中期II卵母細(xì)胞而進(jìn)行的重建，可以模擬受精過(guò)程中發(fā)生的事件。又例如，通過(guò)同時(shí)激活和融合使末期卵母細(xì)胞與啟動(dòng)點(diǎn)前G1期體細(xì)胞基因組融合，可以在卵母細(xì)胞和供體細(xì)胞核之間實(shí)現(xiàn)同步。功能性去核應(yīng)當(dāng)將供體卵母細(xì)胞功能性去核，使得卵母細(xì)胞的內(nèi)源基因組不能發(fā)揮功能，如復(fù)制或合成DNA。用于將卵母細(xì)胞功能性去核的方法包括由卵母細(xì)胞除去基因組(即去核)；滅活卵母細(xì)胞內(nèi)的DNA，如通過(guò)照射(如X射線照射或激光照射)；化學(xué)滅活等。
去核使得卵母細(xì)胞基因組不能發(fā)揮功能的一種方法是由卵母細(xì)胞除去基因組(即去核)?？梢詫⑽⒘恳埔汗芑蜥橆^插入透明帶，由卵母細(xì)胞除去細(xì)胞核物質(zhì)。例如，通過(guò)用微量移液管抽吸第一個(gè)極體和圍繞極體的鄰近細(xì)胞質(zhì)(如大約20％、30％、40％、50％、60％的細(xì)胞質(zhì)，推測(cè)其包含中期板)，可以將具有一個(gè)極體的中期II卵母細(xì)胞去核。通過(guò)用微量移液管或針頭除去第二極體和周圍細(xì)胞質(zhì)(如大約5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％的細(xì)胞質(zhì))，可以將具有兩個(gè)極體的末期卵母細(xì)胞去核。具體而言，可以在從細(xì)胞質(zhì)膜中第二個(gè)極體突起的存在直至第二極體形成的任何點(diǎn)，將處于末期的卵母細(xì)胞去核。因而，在用于本文時(shí)，認(rèn)為質(zhì)膜中展示突起(通常鄰接紡錘體)直至第二極體擠出的卵母細(xì)胞是處于末期的卵母細(xì)胞?；蛘?，認(rèn)為具有一個(gè)細(xì)胞核和明顯極體而沒有突起顯現(xiàn)的卵母細(xì)胞是處于中期的卵母細(xì)胞。
照射可以通過(guò)使用照射滅活卵母細(xì)胞內(nèi)源DNA將卵母細(xì)胞功能性去核。使用照射的方法在本領(lǐng)域是已知的，且描述于例如Bradshaw等人，Mol.Reprod.Dev，41503-512，1995，將它的內(nèi)容收入本文作為參考。
化學(xué)滅活可以通過(guò)化學(xué)滅活卵母細(xì)胞內(nèi)源DNA將卵母細(xì)胞功能性去核?；瘜W(xué)滅活DNA的方法在本領(lǐng)域是已知的。例如，可以使用表鬼臼亞乙苷-環(huán)己酰亞胺方法來(lái)進(jìn)行化學(xué)滅活，該方法描述于Fulkaj和Moore，Mol.Reprod.Dev.，34427-430，1993，將它的內(nèi)容收入本文作為參考。將功能性染色體基因組導(dǎo)入卵母細(xì)胞本文所述方法可包括將功能性染色體基因組導(dǎo)入卵母細(xì)胞，如功能性去核卵母細(xì)胞，如去核卵母細(xì)胞，以生成重建胚胎。功能性染色體基因組指導(dǎo)由重建胚胎生成的克隆或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的發(fā)育。可以使用將基本上完整的染色體基因組移植到卵母細(xì)胞中的方法。范例包括使包含功能性染色體基因組的細(xì)胞與卵母細(xì)胞融合，和細(xì)胞核注射，即直接將細(xì)胞核移植到卵母細(xì)胞中。
融合可以通過(guò)例如電融合、病毒融合、生化試劑融合(如HA蛋白質(zhì))、或化學(xué)融合(如聚乙二醇(PEG)或乙醇)來(lái)進(jìn)行體細(xì)胞與卵母細(xì)胞的融合。
可以同時(shí)進(jìn)行體細(xì)胞與卵母細(xì)胞的融合和激活。例如，可以將體細(xì)胞細(xì)胞核置于包含卵母細(xì)胞的透明帶內(nèi)。然后，可以通過(guò)例如應(yīng)用電場(chǎng)來(lái)同時(shí)進(jìn)行細(xì)胞核與卵母細(xì)胞的融合和激活步驟。也可以在激活卵母細(xì)胞之前或之后進(jìn)行體細(xì)胞與卵母細(xì)胞的融合。激活重建胚胎激活指胚胎發(fā)育的開始，如復(fù)制和合成DNA。例如可以通過(guò)電休克(如在電融合中)、離子載體的使用、乙醇激活來(lái)誘導(dǎo)激活，或者可以在天然激活的階段中獲得卵母細(xì)胞，如處于末期的卵母細(xì)胞。
電融合可以使用電休克(如在電融合中)來(lái)激活重建胚胎。使用電融合能夠促使同時(shí)進(jìn)行體細(xì)胞與卵母細(xì)胞的融合和激活。
用于進(jìn)行電融合的槽(諸如BTX200胚胎操作系統(tǒng))可以由例如BTX(San Diego)購(gòu)買。
離子載體另外，可以通過(guò)離子載體激活來(lái)激活重建胚胎。通過(guò)使用離子載體，如鈣離子載體，可以改變重建胚胎的跨膜鈣濃度。由于細(xì)胞中的游離鈣濃度升高，因此胞內(nèi)蛋白質(zhì)的磷酸化降低，由此激活卵母細(xì)胞。這些激活方法描述于例如美國(guó)專利號(hào)5,496,720，將它的內(nèi)容收入本文作為參考。
乙醇激活在去核前，可以使用乙醇依照Presicce和Yang，Mol.Reprod.Dev.，3761-68，1994；和Bordignon和Smith，Mol.Reprod.Dev.，4929-36，1998(將它們的內(nèi)容收入本文作為參考)所述的乙醇激活處理來(lái)激活中期卵母細(xì)胞。
處于末期的卵母細(xì)胞處于末期的卵母細(xì)胞通常早已激活。因而，這些細(xì)胞通常天然展示鈣濃度降低，由此預(yù)防受精并使胚胎發(fā)育。胚外細(xì)胞在優(yōu)選的實(shí)施方案中，胚外細(xì)胞是外源加入胚胎的細(xì)胞。胚外細(xì)胞指不發(fā)育成胚胎(即胚胎本身)而是支持組織(諸如胎盤)的細(xì)胞。例如，滋養(yǎng)外胚層的細(xì)胞是有助于胎盤發(fā)育的胚外細(xì)胞。優(yōu)選的是，胚外細(xì)胞是倍性超過(guò)2的細(xì)胞，如四倍體細(xì)胞。胚外細(xì)胞可衍生自胚胎或卵母細(xì)胞，如衍生自胚胎或卵母細(xì)胞的倍性超過(guò)2的細(xì)胞。
四倍體化可以使用植入前胚胎，優(yōu)選而非必需的是處于兩細(xì)胞階段胚胎，并將這些胚胎進(jìn)行四倍體化操作而生成四倍體胚胎。術(shù)語(yǔ)“四倍體胚胎”指已進(jìn)行四倍體化操作的激活后胚胎。可以通過(guò)物理、化學(xué)、或電方法進(jìn)行四倍體化。四倍體化用于生成具有兩倍于普通細(xì)胞遺傳成分的胚胎細(xì)胞。例如，可以使用例如電融合誘導(dǎo)兩細(xì)胞階段的胚胎，以重新生成遺傳物質(zhì)為4N而非2N(在未操作的兩細(xì)胞階段胚胎中觀察到的)的單細(xì)胞胚胎。
電融合可用于生成四倍體胚胎。例如，可以將胚胎(如兩細(xì)胞階段的胚胎)暴露于電場(chǎng)脈沖，引起細(xì)胞膜降解和細(xì)胞融合，從而生成四倍體胚胎，如由兩細(xì)胞階段胚胎生成單細(xì)胞四倍體胚胎?？梢匀鏙ames等人，Dev.Biol.，167213-226，1995；Prather等人，Mol.Reprod.Dev.，4538-42，1996；Duncan等人，Development，124279-287，1997(收入本文作為參考)中所述，通過(guò)電學(xué)方法進(jìn)行四倍體化方法。
還可以使用化學(xué)方法生成四倍體胚胎。例如，松胞菌素B(Sigma，St.Louis，MO)可用于生成四倍體胚胎。這些方法描述于例如Koizumi等人，Exp.Anim.，44(2)105-109，1995；Koizumi等人，Exp.Anim.，45(2)179-181，1996，將它們的內(nèi)容收入本文作為參考。
四倍體化操作后，可以培養(yǎng)四倍體胚胎至至少單細(xì)胞階段直至胚泡階段。然后可以通過(guò)化學(xué)、生物學(xué)、或物理方法處理四倍體胚胎以除去透明帶，并使四倍體細(xì)胞與重建胚胎的細(xì)胞聚集(在本文中稱為“四倍體聚集”)。重建胚胎可以處于由單細(xì)胞階段直至胚泡階段的任何階段。聚集(或加入)克隆胚胎的四倍體胚胎也可以處于由單細(xì)胞階段直至胚泡階段的任何階段。四倍體胚胎和克隆胚胎不需要處于相同發(fā)育階段。還可以通過(guò)使四倍體胚胎干細(xì)胞與處于任何發(fā)育階段的克隆胚胎聚集來(lái)進(jìn)行這些操作。
然后，可以在體外培養(yǎng)產(chǎn)生的四倍體聚集/克隆胚胎(在本文中也稱為“偶聯(lián)體(couplet)”)直至胚泡階段，或者可以立即移植到假孕受體中。還可以在移植到假孕受體中之前在體外在中間受體中培養(yǎng)產(chǎn)生的偶聯(lián)體。重建胚胎的移植可以將重建胚胎移植到受體雌獸中，并使之發(fā)育成克隆或轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物。例如，如下文實(shí)施例所述，可以經(jīng)輸卵管傘部將重建胚胎移植到每個(gè)受體雌獸的輸卵管內(nèi)腔中。另外，將胚胎移植到受體哺乳動(dòng)物中的方法在本領(lǐng)域是已知的，且描述于例如Ebert等人，Bio/Technology，12699，1994。
可以在培養(yǎng)基中維持重建胚胎至至少第一次分裂(兩細(xì)胞階段)直至胚泡階段，優(yōu)選在兩細(xì)胞或四細(xì)胞階段移植胚胎。用于胚胎發(fā)育的多種培養(yǎng)培養(yǎng)基在本領(lǐng)域是已知的。例如，可以將重建胚胎與由本發(fā)明將要提供的哺乳動(dòng)物類型衍生的輸卵管上皮細(xì)胞單層共培養(yǎng)。由乳汁純化蛋白質(zhì)可以相對(duì)較高濃度和較大體積在乳汁中生成轉(zhuǎn)基因蛋白質(zhì)，可以連續(xù)高水平產(chǎn)量提供易于由可更新來(lái)源收獲的正常加工肽。本領(lǐng)域已知幾種不同方法可用于由乳汁分離蛋白質(zhì)。
通常通過(guò)聯(lián)合方法分離乳汁蛋白質(zhì)。首先通過(guò)例如撇取浮沫、離心、沉降(H.E.Swaisgood，《Developments in Dairy Chemistry，IChemistry of Milk Protein》，Applied Science Publishers，NY，1982)、酸沉淀(美國(guó)專利號(hào)4,644,056)、或者使用凝乳酶或胰凝乳蛋白酶(Swaisgood，同上)的酶促凝結(jié)，分級(jí)分離全脂乳以除去脂肪。然后，可將主要乳汁蛋白質(zhì)分級(jí)分離成澄清溶液或大批沉淀，從中易于純化感興趣的特定蛋白質(zhì)。
法國(guó)專利號(hào)2487642描述了通過(guò)將膜超濾與排阻層析或離子交換層析聯(lián)合，由脫脂乳或乳清分離乳汁蛋白質(zhì)。首先通過(guò)用粗制凝乳酶或乳酸凝結(jié)除去酪蛋白而生成乳清。美國(guó)專利號(hào)4,485,040描述了通過(guò)兩個(gè)順序超濾步驟由乳清分離滯留物中富含α-乳球蛋白的產(chǎn)物。美國(guó)專利號(hào)4,644,056提供了通過(guò)酸沉淀(pH4.0-5.5)和依次交叉流動(dòng)過(guò)濾(首先在0.1-1.2μm孔徑的膜上過(guò)濾以澄清產(chǎn)物，然后在分離極限5-80kd的膜上濃縮)由乳汁或初乳純化免疫球蛋白的方法。
相似的，美國(guó)專利號(hào)4,897,465傳授了通過(guò)在金屬氧化物膜上pH變化的順序超濾由血清、卵黃、或乳清濃縮和富集蛋白質(zhì)(諸如免疫球蛋白)。首先在低于選定蛋白質(zhì)等電點(diǎn)(pI)的pH下進(jìn)行過(guò)濾，由蛋白質(zhì)滯留物除去大批污染物；然后是高于選定蛋白質(zhì)pI的pH下過(guò)濾，使雜質(zhì)保留而使選定蛋白質(zhì)透過(guò)。歐洲專利號(hào)EP 467 482 B 1傳授了不同的過(guò)濾濃縮方法，其中將脫脂乳降至pH3-4(低于乳汁蛋白質(zhì)的pI)，以溶解酪蛋白和乳清蛋白質(zhì)二者。3輪連續(xù)超濾或滲濾，然后濃縮蛋白質(zhì)，可形成含15-20％固體的滯留物，其中90％是蛋白質(zhì)?；蛘撸?guó)專利申請(qǐng)?zhí)?179947公開了通過(guò)超濾來(lái)濃縮樣品，隨后進(jìn)行近中性pH的弱陽(yáng)離子交換層析，從而由乳清分離乳鐵蛋白。沒有雜質(zhì)測(cè)量的報(bào)導(dǎo)。在PCT發(fā)表物編號(hào)WO 95/22258中，通過(guò)加入濃縮鹽將乳汁調(diào)至高離子強(qiáng)度，隨后進(jìn)行陽(yáng)離子交換層析，由此由乳汁回收蛋白質(zhì)(諸如乳鐵蛋白)。
在所有這些方法中，首先處理乳汁或其級(jí)分以除去脂肪、脂質(zhì)、和將會(huì)淤塞濾膜或?qū)游鼋橘|(zhì)的其它顆粒物質(zhì)。如此生成的初級(jí)級(jí)分可包含酪蛋白、乳清、或總?cè)橹鞍踪|(zhì)，然后由此分離感興趣的蛋白質(zhì)。
PCT發(fā)表物編號(hào)WO 94/19935公開了通過(guò)用帶正電荷的試劑(諸如精氨酸、咪唑、或Bis-Tris)穩(wěn)定總?cè)橹鞍踪|(zhì)的溶解度，由全乳分離生物學(xué)活性蛋白質(zhì)的方法。這種處理形成澄清溶液，然后使之通過(guò)原本會(huì)被沉淀蛋白質(zhì)阻塞的濾膜，由此分離蛋白質(zhì)。
USSN 08/648,235公開了通過(guò)切向流過(guò)濾由全乳或其級(jí)分分離處于生物學(xué)活性形式的可溶性乳汁成份(諸如肽)的方法。與以前的分離方法不同，這不需要首先分級(jí)分離全乳以除去脂肪和酪蛋白微團(tuán)，由此簡(jiǎn)化了該方法并避免了回收和生物活性的損失。該方法可與其它純化步驟聯(lián)合使用，以進(jìn)一步除去污染物并純化目的產(chǎn)物(如蛋白質(zhì))。
收入整篇申請(qǐng)書中引用的所有參考(包括參考文獻(xiàn)、發(fā)表的專利、發(fā)表的專利申請(qǐng)、和共同待審專利申請(qǐng))的內(nèi)容作為參考。
權(quán)利要求
1.促進(jìn)出生前非人哺乳動(dòng)物發(fā)育的方法，包括形成與至少一個(gè)胚外細(xì)胞聯(lián)合的重建胚胎；將重建胚胎移植到受體哺乳動(dòng)物中；并使胚胎發(fā)育，由此促進(jìn)哺乳動(dòng)物的發(fā)育。
2.權(quán)利要求1的方法，其中胚外細(xì)胞是倍性超過(guò)2的細(xì)胞。
3.權(quán)利要求2的方法，其中胚外細(xì)胞是四倍體細(xì)胞。
4.權(quán)利要求2的方法，其中胚外細(xì)胞可來(lái)源于其內(nèi)細(xì)胞被融合在一起以增加倍性的胚胎。
5.權(quán)利要求1的方法，其中重建胚胎是經(jīng)遺傳工程改造的重建胚胎。
6.權(quán)利要求1的方法，其中在大約兩細(xì)胞階段至胚泡階段移植重建胚胎。
7.抑制受體哺乳動(dòng)物自發(fā)流產(chǎn)重建胚胎的方法，包括將至少一個(gè)胚外細(xì)胞與重建胚胎合并；將胚胎移植到受體哺乳動(dòng)物中；并使胚胎發(fā)育成出生后哺乳動(dòng)物。
8.權(quán)利要求7的方法，其中胚外細(xì)胞是倍性超過(guò)2的細(xì)胞。
9.權(quán)利要求8的方法，其中胚外細(xì)胞是四倍體細(xì)胞。
10.權(quán)利要求8的方法，其中胚外細(xì)胞可來(lái)源于其內(nèi)細(xì)胞被融合在一起以增加倍性的胚胎。
11.權(quán)利要求7的方法，其中重建胚胎是經(jīng)遺傳工程改造的重建胚胎。
12.權(quán)利要求7的方法，其中在大約兩細(xì)胞階段至胚泡階段移植重建胚胎。
13.抑制由重建胚胎衍生的克隆非人哺乳動(dòng)物的缺陷的方法，包括將至少一個(gè)胚外細(xì)胞與重建胚胎合并；將胚胎移植到受體哺乳動(dòng)物中；并使胚胎發(fā)育成出生后哺乳動(dòng)物。
14.權(quán)利要求13的方法，其中胚外細(xì)胞是倍性超過(guò)2的細(xì)胞。
15.權(quán)利要求14的方法，其中胚外細(xì)胞是四倍體細(xì)胞。
16.權(quán)利要求14的方法，其中胚外細(xì)胞可來(lái)源于其內(nèi)細(xì)胞被融合在一起以增加倍性的胚胎。
17.權(quán)利要求13的方法，其中重建胚胎是經(jīng)遺傳工程改造的重建胚胎。
18.權(quán)利要求13的方法，其中在大約兩細(xì)胞階段至胚泡階段移植重建胚胎。
全文摘要
本發(fā)明涉及促進(jìn)出生前非人哺乳動(dòng)物發(fā)育的方法，包括形成與至少一個(gè)胚外細(xì)胞，如四倍體細(xì)胞聯(lián)合的重建胚胎；將重建胚胎移植到受體哺乳動(dòng)物中；并使胚胎發(fā)育，由此促進(jìn)哺乳動(dòng)物的發(fā)育。
文檔編號(hào)A01K67/02GK1402781SQ00813583
公開日2003年3月12日 申請(qǐng)日期2000年9月27日 優(yōu)先權(quán)日1999年9月30日
發(fā)明者Y·艾切拉德 申請(qǐng)人:根茨美轉(zhuǎn)基因公司