專利名稱：來曲唑在用于制備成年牛超數排卵藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種新型的超數排卵方法，具體地說，涉及來曲唑在用于制備成年牛超數排卵藥物中的應用，可用于利用超排的卵母細胞生產轉基因克隆家畜、家畜育種及瀕危物種的保護。屬于應用型胚胎生物技術領域。
背景技術：
超數排卵技術最初是以嚙齒類實驗動物為研究對象發(fā)現的，通過埋植垂體前葉物質或注射孕馬血清技術獲取了大量的卵母細胞，以此奠定了超排技術基礎，是胚胎移植技術中最重要的環(huán)節(jié)。采用超數排卵技術可以最大限度利用卵巢資源，獲得大量整齊、優(yōu)質的卵子，充分發(fā)揮優(yōu)良母畜的繁殖潛力，為胚胎移植提供充足的胚源。該項技術的應用使得優(yōu)良后代數量成倍增長，加快了優(yōu)良品種擴繁和動物育種的步伐?；谠擁椉夹g的優(yōu)勢，目前已廣泛應用于畜牧業(yè)生產，其中在牛單胎動物生產方面尤為突出。牛超數排卵同時結合胚胎移植集成的MOET技術，加速了優(yōu)良牛品種擴繁，縮短了世代間隔，提高了畜牧業(yè)生產效率，獲得了巨大的經濟及社會效益。目前畜牧業(yè)生產中廣泛使用的超排方案形成于20世紀80年代初，常用的激素主要有孕馬血清促性腺激素(PMSG)和卵泡刺激素(FSH)。由于PMSG對卵巢影響較大，逐漸被FSH替代或與FSH結合使用，超排方法主要有FSH遞減法、FSH恒量法、PMSG與FSH組合方法。另外由于FSH半衰期較短，連續(xù)注射增加了勞動強度，而且會對家畜產生應激，成本也較高，也有研究將FSH溶解在PVP等高分子聚合物中緩釋的超排方法，同樣獲得了較好的超排效果。盡管超數排卵技術已廣泛應用于生產，但是由于超排選用的激素種類、供體牛的生理狀態(tài)、環(huán)境及營養(yǎng)等因素的影響，現有的超排方案在獲卵率和可用胚數方面不穩(wěn)定，嚴重地影響了胚胎移植技術的推廣。同時，為提高超排效率，一些科研工作者將生長激素(GH)、胰島素樣生長因子I (IGF-1)、血管表皮生長因子(VE`GF)等激素或因子也納入家畜超排方案。雖有研究表明，添加一些生長相關的因子可以有效提高家畜的胚胎質量及增加可用囊胚的比例，但目前尚無有效提高家畜超排效果，明顯提高單次排卵數的超排方案的報道。另據國際胚胎移植協會(IETS)的數據表明，近10年來，供體母牛單次超排獲得的可用胚胎數平均保持在6枚左右，由此可見，目前現有的超排方法在獲取的卵母細胞數量上沒有獲得較大的突破。哺乳動物出生后卵巢存在大量的卵母細胞，隨著年齡的增長，這些卵細胞不斷退化，到性成熟時大部分已消失，但卵巢上仍有相當數量的卵原細胞和初級卵母細胞存在。例如:青年母牛有5-7.5萬個。但是家畜在一個性周期同時有一組卵泡啟動發(fā)育，但最后只有一部分卵泡發(fā)育成熟。牛一般只有I個卵泡成熟排卵，而當前在生產中應用的超排方案結合人工受精平均僅能獲取6枚胚胎，其它卵泡則閉鎖，因此，卵巢中有大量的卵細胞并末得到利用，導致卵巢卵泡資源的巨大浪費。鑒于上述原因，畜牧業(yè)生產亟需新型的高效、穩(wěn)定的超排技術來替代傳統(tǒng)的超排方案。來曲唑(LE)為非留體類第三代芳香化酶抑制劑，最早應用于人絕經期乳腺癌的臨床治療。近年來動物實驗和臨床研究表明，來曲唑具有促排卵作用。促排機理可能通過抑制芳香酶的活性，阻礙雄激素和雌二醇的轉化，降低機體內雌激素水平，從而解除雌激素對下丘腦和(或)垂體的負反饋作用，使垂體促性腺激素分泌增加，促進卵泡的發(fā)育和排卵；另外卵巢內雄激素暫時性的增多，從而增加卵巢內卵泡對FSH的敏感性，同時卵巢內雄激素的增加能夠刺激胰島素樣生長因子I(IGFl)以及內分泌、旁分泌因子與FSH協同作用促進卵泡發(fā)育和排卵。來曲唑為口服劑型，生物利用度高達99.9%，具有高度選擇性，可阻斷98%以上的芳香化酶活性，且半衰期較短，代謝速度快，無副作用。大量的研究表明，LE與FSH聯合使用提高了超排效率，是一種新型的促排卵藥物，目前已廣泛應用于人的促排卵治療及實驗動物研究。牛是單排卵動物，在卵巢生理、胚胎發(fā)育特點及輔助生殖技術方面與人具有相似的特點，而且在研究人卵母細胞發(fā)育領域是一個重要的模型動物。因此，鑒于牛與人繁殖生理特點的相似性，推測LE與FSH聯合應用于超數排卵將有一定作用效果，但是在牛超排方案的改進方面尚無研究報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種來曲唑在用于制備成年牛超數排卵藥物及輔助藥物中的應用。本發(fā)明的另一目的是提供一種誘導牛超數排卵的方法。為了實現本發(fā)明目的，本發(fā)明提供來曲唑(LE)在用于制備成年牛超數排卵藥物及輔助藥物中的應用。本發(fā)明來曲唑與卵泡刺激素(FSH)聯合用于制備成年牛超數排卵藥物。本發(fā)明提供一種誘導成年牛超數排卵的方法，包括如下步驟:I)卵泡同 期化發(fā)育處理:將成年母牛經孕酮持續(xù)處理6天，在第O天同時使用苯甲酸雌激素，在第6天使用前列腺素；2)卵泡刺激素、來曲唑聯合處理 第4天開始每間隔12小時使用一次卵泡刺激素，在第5天聯合使用來曲唑。其中，所述來曲唑的用量為0.1-0.8mg/kg體重,優(yōu)選為0.2mg/kg體重。所述卵泡刺激素使用8次,用量為0.06-0.02mg/kg體重。步驟I)中所述孕酮的用量2.5-3.0mg/kg體重，所述苯甲酸雌激素的用量
0.003-0.006mg/kg體重,所述前列腺素的用量0.04-0.lmg/kg體重。步驟I)中在使用苯甲酸雌激素的同時，還再使用0.15-0.2mg/kg體重量的孕酮。本發(fā)明研究人員經過研究發(fā)現，在傳統(tǒng)成年母牛超排方案中增加使用LE，利用來曲唑對內分泌及旁分泌的影響及卵巢卵泡募集的作用，促進卵泡的發(fā)育，增加可利用的卵母細胞數量；另外其半衰期較短，代謝速度快，無副作用，能夠成為家畜超排輔助藥物在畜牧業(yè)生產上推廣應用。而且利用來曲唑對內分泌及旁分泌的影響及卵巢卵泡募集的作用，在利用常規(guī)超排方法使用卵泡刺激素(FSH)的同時結合來曲唑，促進牛卵泡發(fā)育，提高超排效率，充分挖掘良種牛在卵泡閉鎖前豐富的種質資源，加速良種選育及擴繁技術體系，大幅度提高育種效率和技術水平。本發(fā)明通過針對外源FSH注射牛后活化芳香化酶活性，增加雌激素的產量，導致負反饋作用于下丘腦和(或)垂體，使內源FSH分泌下降，影響了超排效果的問題，在注射后FSH使用來曲唑抑制芳香化酶活性。LE是一種強效的芳香化酶抑制劑，其選擇性抑制雌激素的合成，顯著降低血清中雌激素水平，解除雌激素對下丘腦和(或)垂體的負反饋作用，使內源垂體促性腺激素分泌增加，促進卵泡的發(fā)育，增加可利用的卵母細胞數量；另外其半衰期較短，代謝速度快，無副作用，能夠成為家畜超排輔助藥物在畜牧業(yè)生產上推廣應用。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實施例1本發(fā)明通過傳統(tǒng)成年母牛超排方案使用FSH同時口服LE，通過口服不同劑量的LE確定牛最佳的LE使用劑量。FSH每天2次注射4天，時間為早晨8:00，晚上8:00，在第I次FSH注射24h后，即第3針FSH注射時使用不同劑量的LE處理(0.lmg、0.2mg、0.4mg及
0.8mg/kg體重)，同時以未LE處理為對照；超排、人工授精后采集的胚胎通過胚胎移植技術植入經過同期發(fā)情處理后具有明顯發(fā)情表現的受體牛，胚胎附植后經過全期發(fā)育產犢。具體地說，使用本發(fā)明來曲唑的牛超數排卵方案:(I)卵泡同期化發(fā)育處理:選擇體況良好、體重均一的成年荷斯坦母牛(10頭，體重約為650kg)，在第O天早晨8:00插入1.9g陰道孕酮栓制劑(CIDR，新西蘭)，CIDR處理
6.5d,第6天取出。在第O天插入CIDR同時注射苯甲酸雌激素(EV) 2mg和孕酮IOOmg,在第6d早上8:00注射25mg前列腺素(PGF2 α )。(2)FSH , LE處理 第4d開始間隔12h連續(xù)注射FSH(加拿大，Folltropin) 4d，早8:00，晚 8:00，劑量為 40,40, 30, 30, 20, 20,10, IOmg0 在第 5d 早 8:00 第 3 次注射 FSH后口服LE，采用4個LE處理分別為0.lmg、0.2mg、0.4mg及0.8mg/Kg體重，同時以未LE處理為對照。(3)人工授精及胚胎移植供體牛CIDR處理后第8d下午和第9d上午進行兩次人工授精，第15d采集胚胎分級計數后，按照牛胚胎移植操作規(guī)程進行胚胎移植。超排、人工授精后采集的胚胎通過胚胎移植技術植入經過同期發(fā)情處理后具有明顯發(fā)情表現的受體牛，胚胎附植后經過全期發(fā)育產犢。(4)獲取卵母細胞及胚胎數量實驗結果表明LE聯合FSH處理成年母牛提高了超排效果。其中LE0.2mg/kg處理效果最好，卵母細胞總數(11.4vs 8.0)和可移植胚胎數量(8.1vs 6.1)均顯著(P < 0.05)高于未經LE處理的對照。表ILE聯合FSH處理對牛超排的影響(平均數土標準誤，η = 10)
權利要求
1.來曲唑在用于制備成年牛超數排卵藥物及輔助藥物中的應用。
2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述來曲唑與卵泡生成素聯合使用。
3.一種誘導成年牛超數排卵的方法，其特征在于，包括如下步驟: 1)卵泡同期化發(fā)育處理:將成年母牛經孕酮持續(xù)處理6天，在第O天同時使用苯甲酸雌激素，在第6天使用前列腺素； 2)卵泡刺激素、來曲唑聯合處理 第4天開始每間隔12小時使用一次卵泡刺激素，在第5天聯合使用來曲唑。
4.根據權利要求3所述的誘導成年牛超數排卵的方法，其特征在于，所述來曲唑的用量為 0.1-0.8mg/kg 體重。
5.根據權利要求4所述的誘導成年牛超數排卵的方法，其特征在于，所述來曲唑的用量為0.2mg/kg體重。
6.根據權利要求3-5任意一項所述的誘導成年牛超數排卵的方法，其特征在于，所述卵泡刺激素使用8次，用量為0.06- 0.02mg/kg體重。
7.根據權利要求3-6任意一項所述的誘導成年牛超數排卵的方法，其特征在于，步驟I)中，所述孕酮的用量2.5-3.0mg/kg體重，所述苯甲酸雌激素的用量0.003-0.006mg/kg體重，所述前列腺素的用量0.04-0.lmg/kg體重。
8.根據權利要求3-7任意一項所述的誘導成年牛超數排卵的方法，其特征在于，步驟I)中在使用苯甲酸雌激素的同時，還再使用0.15-0.2mg/kg體重量的孕酮。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種來曲唑在用于制備成年牛超數排卵藥物中的應用。本發(fā)明在傳統(tǒng)成年母牛超排方案中增加使用LE，利用來曲唑對內分泌及旁分泌的影響及卵巢卵泡募集的作用，促進卵泡的發(fā)育，增加可利用的卵母細胞數量；另外其半衰期較短，代謝速度快，無副作用，能夠成為家畜超排輔助藥物在畜牧業(yè)生產上推廣應用。
文檔編號A61P15/08GK103169699SQ201110436200
公開日2013年6月26日 申請日期2011年12月22日 優(yōu)先權日2011年12月22日
發(fā)明者田見暉, 賈振偉, 吳中紅, 張家新, 安磊 申請人:中國農業(yè)大學