專利名稱：龍膽酸1,2－雙加氧酶基因工程菌的構(gòu)建和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明是一種來自肺炎克氏桿菌M5a1(Klebsiella pneumoniae M5a1)龍膽酸1，2-雙加氧酶(gentisate 1，2-dioxygenase)基因工程菌的構(gòu)建和應用。
背景技術：
肺炎克氏桿菌M5a1(Klebsiella pneumoniae M5a1)可以降解包括羥基苯甲酸在內(nèi)的一些芳香烴化合物。其中，有報道表明此菌株通過龍膽酸旁路途徑降解3-羥基苯甲酸成延胡索酸和丙酮酸進入三羧酸循環(huán)。此途徑編碼各個酶的基因被定位在一段長約8kb的由sphI酶切而來的DNA片段上。經(jīng)過測序分析，該片段含有八個讀碼框，其中mhbD編碼龍膽酸1，2-雙加氧酶(gentisate 1，2-dioxygenase)催化龍膽酸轉(zhuǎn)化成順丁烯二酸單酰丙酮酸(Maleylpyruvate，MP)(見圖2)。順丁烯二酸單酰丙酮酸一方面可以作為分析標樣，另一方面其可能存在潛在的用途(功能化合物，藥物中間體等)，但迄今市場上尚無此化合物供應。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種高效表達重組龍膽酸1，2-雙加氧酶基因工程菌，并利用此菌制備高純度的順丁烯二酸單酰丙酮酸，從而為順丁烯二酸單酰丙酮酸的生產(chǎn)丌辟了一條有效的生產(chǎn)途徑。
本發(fā)明所采用的技術方案如下1.龍膽酸1，2-雙加氧酶基因工程菌的構(gòu)建方法，其包括配制LB培養(yǎng)基、基因工程菌的增殖步驟，以及以下步驟(1)龍膽酸1，2-雙加氧酶基因的克隆及高效表達利用聚合酶鏈式反應的方法，從肺炎克氏桿菌M5a1中分離龍膽酸1，2-雙加氧酶基因，并連接至表達載體pET5a，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌，篩選陽性克隆后，再將陽性克隆子轉(zhuǎn)化至另一能識別六種稀有密碼子的大腸桿菌，然后進行誘導表達。
(2)龍膽酸1，2-雙加氧酶的提取每50毫升誘導表達好的培養(yǎng)物，離心收集菌體沉淀，在冰預冷的pH7.5的25毫摩爾/升的PBS緩沖液中洗滌一次后，重懸于pH8.0的5毫升PBS緩沖液中；在冰浴中超聲波破碎45分鐘，每破碎6秒，停9秒；最后以13500轉(zhuǎn)/分鐘，在4℃離心30分鐘，獲得上清液，得到龍膽酸1，2-雙加氧酶粗酶液。
2.龍膽酸1，2-雙加氧酶基因工程菌用于順丁烯二酸單酰丙酮酸的制備。
本發(fā)明具有如下主要優(yōu)點其一.利用pET5a作為表達載體，以天然而非融合形式產(chǎn)生龍膽酸1，2-雙加氧酶；以能識別六種稀有密碼子的E.coli Rosetta(DE3)pLysS作為受體菌，大大提高了表達效率，約為0.5-1倍。
其二.利用所構(gòu)建的龍膽酸1，2-雙加氧酶基因工程菌生產(chǎn)順丁烯二酸單酰丙酮酸，有利于最大限度地收獲順丁烯二酸單酰丙酮酸；并且大大減少了其它副產(chǎn)物的產(chǎn)生。
其三.制備方法簡單，順丁烯二酸單酰丙酮酸產(chǎn)物純度高。在此條件下，順丁烯二酸單酰丙酮酸純度約為97.8％。
其四.操作方便，適于規(guī)?；可a(chǎn)和應用。


圖1是來自肺炎克氏桿菌M5a1的龍膽酸1，2-雙加氧酶的基因序列。
圖2是龍膽酸在龍膽酸1，2-雙加氧酶作用下生成MP的掃描圖。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步說明。
一.龍膽酸1，2-雙加氧酶基因工程菌底物為龍膽酸，在有氧條件下，將兩個氧原子加入至龍膽酸苯環(huán)上，生成順丁烯二酸單酰丙酮酸。催化反應的最適pH值為pH8.0(50mM PBS緩沖液)，最適溫度為30℃。對龍膽酸的Km(米氏常數(shù))值是52μM。
二.龍膽酸1，2-雙加氧酶基因工程菌的構(gòu)建包括以下步驟(1)龍膽酸1，2-雙加氧酶基因的克隆及高效表達利用聚合酶鏈式反應的方法，從肺炎克氏桿菌M5a1中分離龍膽酸1，2-雙加氧酶基因(其基因序列見圖1)，并連接至表達載體pET5a(本實驗室保存)，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α(E.coli DH5α，本實驗室保存)，篩選陽性克隆后，再將陽性克隆子轉(zhuǎn)化至另一能識別六種稀有密碼子的大腸桿菌Rosetta(E.coli Rosetta(DE3)pLysS(本實驗室保存)，然后進行誘導表達。
上段內(nèi)容也可以用下述內(nèi)容表達通過堿裂解法提取(參照分子克隆實驗指南第二版p19)編碼龍膽酸單加氧酶的質(zhì)粒，經(jīng)驗證后，以此作為模板，以引物(上游引物5’--gaa cgc ata tgt ccc agt cca ccacgg--3’；下游引物5’--tcg gca gaa ttc cag aag aag aac ggc--3’)擴增龍膽酸單加氧酶基因(約1200bp)。送交上?；瞪锛夹g有限公司測序。將測序結(jié)果與業(yè)已發(fā)布的龍膽酸單加氧酶基因序列作對比分析，確定所得序列無誤后，將該序列進行雙酶切酶切體系為NdeI0.8μLEcoRI 0.8μLBuffer H2μL
PCR產(chǎn)物 8μL超純水 8.4μL將裝有以上成分的離心管置于37℃恒溫水浴鍋中，反應3-4h后進行膠回收(按“維特潔”膠回收試劑盒說明書進行操作)。
將回收產(chǎn)物連接到pET5a(同樣經(jīng)過雙酶切，體系同上)連接體系為Ligase 1μLLigase buffer1μL膠回收的基因片段 6μL膠回收的pET5a2μL將裝有以上成分的離心管置于4℃冰箱中，反應12h后，將所有產(chǎn)物加入裝有200μL感受態(tài)細胞大腸桿菌DH5α的離心管中，參照分子克隆實驗指南第二版中的方法進行轉(zhuǎn)化，最后將經(jīng)過轉(zhuǎn)化處理的反應物涂布于加有抗性(氨芐青霉素)的LB平板上。置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h左右。
通過堿裂解法提取由平板上的菌落培養(yǎng)而來發(fā)酵物的質(zhì)粒，經(jīng)驗證挑取到陽性克隆子并經(jīng)PCR產(chǎn)物測序再度驗證正確后，將正確的連接物轉(zhuǎn)化至另一感受態(tài)細胞大腸桿菌Rosetta中。然后進行誘導表達。
(2)配制LB培養(yǎng)基培養(yǎng)基的成分每升含胰蛋白胨10g，酵母抽提物5g，NaCl10g。
培養(yǎng)基的配制用10摩爾/升的NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.0-7.5，1.05kg/cm230分鐘滅菌后備用；固體培養(yǎng)基需添加1.6％的瓊脂粉。
(3)基因工程菌的增殖a.接菌種到含氯霉素、氨芐青霉素的10毫升LB中，在37℃、300轉(zhuǎn)/分鐘條件下培養(yǎng)6～8小時，到OD600值0.6取出，放入冰箱中4℃過夜，氯霉素、氨芐青霉素的終濃度分別是34、100微克/毫升。
b.第二天早，5000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘收集菌體，用1毫升LB重懸。
c.取200微升懸液到50毫升LB中37℃，300轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)3～4小時到OD600值0.6。
d.加入異丙基硫代-β-D-半乳糖苷到培養(yǎng)液中誘導3～4小時，異丙基硫代-β-D-半乳糖苷的終濃度為0.4毫摩爾。
(4)龍膽酸1，2-雙加氧酶的提取每50毫升誘導表達好的培養(yǎng)物，離心收集菌體沉淀，在冰預冷的pH7.5的25毫摩爾/升的PBS緩沖液中洗滌一次后，重懸于pH8.0的5毫升PBS緩沖液中；在冰浴中超聲波破碎45分鐘，每破碎6秒，停9秒；最后以13500轉(zhuǎn)/分鐘，在4℃離心30分鐘，獲得上清液，得到龍膽酸1，2-雙加氧酶粗酶液。
三.龍膽酸1，2-雙加氧酶基因工程菌的應用用于順丁烯二酸單酰丙酮酸的制備，即將該工程菌專一性地將龍膽酸轉(zhuǎn)化成順丁烯二酸單酰丙酮酸(Maleylpyruvate，MP)(見圖2)。
四.順丁烯二酸單酰丙酮酸的制備1.順丁烯二酸單酰丙酮酸溶液的制備(1)往龍膽酸1，2-雙加氧酶粗酶液中加入終濃度為1.0毫摩爾/升龍膽酸，并且置于250轉(zhuǎn)/分鐘和30℃下進行2小時催化反應。外觀特征表現(xiàn)為催化體系從無色轉(zhuǎn)變成桔黃色。
(2)將催化反應產(chǎn)物置于離心管中，以13500轉(zhuǎn)/分鐘離心30分鐘。然后，收集上清液，該上清液含有由龍膽酸轉(zhuǎn)化而來的順丁烯二酸單酰丙酮酸。
2.順丁烯二酸單酰丙酮酸固體物的制備往順丁烯二酸單酰丙酮酸的上清液中加入3倍體積的95％冰預冷乙醇，混勻靜置后離心，收集上清液，再加入3倍體積的乙醚，經(jīng)混勻、靜置后，去除上清液，用真空泵或置室溫將沉淀物中的痕量乙醚與乙醇去除干凈，得黃色沉淀物即順丁烯二酸單酰丙酮酸，將其置于-20℃保存。
權利要求
1.龍膽酸1，2-雙加氧酶基因工程菌的構(gòu)建方法，其步驟包括配制LB培養(yǎng)基、基因工程菌的增殖，其特征是還包括以下步驟(1)龍膽酸1，2-雙加氧酶基因的克隆及高效表達利用聚合酶鏈式反應的方法，從肺炎克氏桿菌M5a1中分離龍膽酸1，2-雙加氧酶基因，并連接至表達載體pET5a，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌，篩選陽性克隆后，再將陽性克隆子轉(zhuǎn)化至另一能識別六種稀有密碼子的大腸桿菌，然后進行誘導表達，(2)龍膽酸1，2-雙加氧酶的提取每50毫升誘導表達好的培養(yǎng)物，離心收集菌體沉淀，在冰預冷的pH7.5的25毫摩爾/升的PBS緩沖液中洗滌一次后，重懸于pH8.0的5毫升PBS緩沖液中；在冰浴中超聲波破碎45分鐘，每破碎6秒，停9秒；最后以13500轉(zhuǎn)/分鐘，在4℃離心30分鐘，獲得上清液，得到龍膽酸1，2-雙加氧酶粗酶液。
2.龍膽酸1，2-雙加氧酶基因工程菌用于順丁烯二酸單酰丙酮酸的制備。
3.根據(jù)權利要求2所述的順丁烯二酸單酰丙酮酸的制備方法，其特征是包括以下步驟(1)往龍膽酸1，2-雙加氧酶粗酶液中加入龍膽酸，進行催化反應，(2)將催化反應產(chǎn)物離心，收集上清液，該上清液含有由龍膽酸轉(zhuǎn)化而來的順丁烯二酸單酰丙酮酸，(3)順丁烯二酸單酰丙酮酸固體物的制備往順丁烯二酸單酰丙酮酸的上清液中加入3倍體積的95％冰預冷乙醇，混勻靜置后離心，收集上清液，再加入3倍體積的乙醚，經(jīng)混勻、靜置后，去除上清液，用真空泵或置室溫將沉淀物中的痕量乙醚與乙醇去除干凈，得黃色沉淀物即順丁烯二酸單酰丙酮酸。
4.根據(jù)權利要求3所述的順丁烯二酸單酰丙酮酸的制備方法，其特征是往龍膽酸1，2-雙加氧酶粗酶液中加入終濃度為1.0毫摩爾/升龍膽酸，并且置于250轉(zhuǎn)/分鐘和30℃下進行2小時催化反應。
5.根據(jù)權利要求3所述的順丁烯二酸單酰丙酮酸的制備方法，其特征是將催化反應產(chǎn)物置于離心管中，以13500轉(zhuǎn)/分鐘離心30分鐘。
6.根據(jù)權利要求3所述的順丁烯二酸單酰丙酮酸的制備方法，其特征是將順丁烯二酸單酰丙酮酸固體物置于-20℃保存。
全文摘要
本發(fā)明是一種來自肺炎克氏桿菌M5a1龍膽酸1，2－雙加氧酶基因工程菌的構(gòu)建和應用。龍膽酸1，2－雙加氧酶基因工程菌的構(gòu)建方法包括配制LB培養(yǎng)基、基因工程菌的增殖步驟，以及以下步驟(1)龍膽酸1，2－雙加氧酶基因的克隆及高效表達；(2)龍膽酸1，2－雙加氧酶的提取。龍膽酸1，2－雙加氧酶基因工程菌用于順丁烯二酸單酰丙酮酸的制備。本發(fā)明具有方法簡單，操作方便，順丁烯二酸單酰丙酮酸產(chǎn)物純度高，適于規(guī)?；可a(chǎn)和應用等優(yōu)點。
文檔編號C12P7/50GK1594557SQ200410013360
公開日2005年3月16日 申請日期2004年6月25日 優(yōu)先權日2004年6月25日
發(fā)明者周寧一, 劉冬啟, 高曉莉, 劉虹, 王淑君 申請人:中國科學院武漢病毒研究所