專利名稱：乙型肝炎病毒基因分型和基因變異診斷芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)體外診斷技術(shù)，具體地講是一種基因芯片。
目前在臨床上已開展的實(shí)驗(yàn)室診斷方法主要有三大類，即組織培養(yǎng)法、免疫學(xué)方法(酶聯(lián)免疫吸附ELISA和放射免疫法RIA)以及基因診斷技術(shù)(斑點(diǎn)雜交和聚合酶鏈反應(yīng)PCR)。這些方法對病毒性肝炎的診斷起到了非常積極的作用，但也有不足之處(1)組織培養(yǎng)法對實(shí)驗(yàn)室條件要求高，一般醫(yī)院難以開展，并且周期長，只能區(qū)分病毒的種。(2)ELISA和RIA檢測往往只能間接推測病毒在體內(nèi)的感染狀況，不能直接判斷是否存在以及病毒數(shù)量。(3)PCR和斑點(diǎn)雜交雖可直接檢測病毒基因組本身，甚至可以用來分析基因型和變異株，但由于對儀器、試劑及場地等要求條件較高，以及方法學(xué)上尚有欠妥之處，難以滿足臨床的大量篩查。并且從目前已獲得的結(jié)果看，各實(shí)驗(yàn)室之間利用基因診斷技術(shù)檢測肝炎病毒的結(jié)果很難取得一致，也缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。(4)上述方法共同的缺點(diǎn)是要檢查多個(gè)肝炎病毒標(biāo)志物時(shí)，只能一項(xiàng)項(xiàng)去做，耗時(shí)費(fèi)力，并且抽取患者的血量也較大。上述不足提示我們，多種檢測項(xiàng)目用一種儀器一次性檢測，并實(shí)現(xiàn)程序化和自動(dòng)化是診斷病毒性肝炎的研究方向之一。近年新興的生物芯片技術(shù)對解決此問題給我們帶來極大的希望。
我國是乙型肝炎的高發(fā)區(qū)，全國乙型肝炎病毒攜帶者至少有1.3億以上，每年的發(fā)病率在6000萬人次，乙肝病毒持續(xù)感染最終轉(zhuǎn)化為慢性肝炎、肝硬化或肝癌；總數(shù)約占世界感染者的40％。因此，我國自“六五”以來，一直將研究和開發(fā)肝炎病毒的新診斷技術(shù)和診斷試劑作為醫(yī)學(xué)攻關(guān)項(xiàng)目，并取得了一定的進(jìn)展。但隨著研究的深入，人們對肝炎病毒的認(rèn)識(shí)也不斷加深，乙肝病毒基因的變異、不同位點(diǎn)的突變可引起不同后果，如免疫逃避、疫苗逃避和抗病毒治療逃避，在臨床表現(xiàn)為漏診、盲目用藥和延誤治療，最終導(dǎo)致患者多花錢而使病情加重。最新研究結(jié)果表明，乙肝病毒的基因型與病情的輕重相關(guān)，抗病毒藥物引起乙肝病毒特定位點(diǎn)的變異而耐藥等。但是目前臨床常規(guī)的檢測方法越來越不適應(yīng)臨床診治的需要，這就需要研究更新的、更能反映肝炎病毒實(shí)際狀況的試劑或儀器、方法等，對肝炎病毒感染狀況進(jìn)行準(zhǔn)確判斷，并指導(dǎo)臨床治療方案的制定。
本發(fā)明的目的是提供一種乙型肝炎病毒基因分型和基因變異診斷芯片，該基因芯片具有診斷準(zhǔn)確、特異性強(qiáng)、信息量高的特點(diǎn)，是目前乙肝病毒感染診斷最好的手段，給數(shù)千萬乙肝患者帶來福音。此芯片成功應(yīng)用于臨床，其潛在市場巨大，并能帶來極大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。
本發(fā)明是在基質(zhì)尼龍膜上設(shè)置探針，探針在膜上的步陣，與核苷酸類似物等抗病毒藥物的耐藥相關(guān)探針.；與免疫逃亡，臨床漏檢有關(guān)的探針；與干擾素應(yīng)答，免疫逃避，臨床狀況有關(guān)的探針；與病毒復(fù)制和原發(fā)性肝癌相關(guān)的缺失突變等特異性探針100-1000個(gè)左右，在特異探針末端加一段特異引物。
本發(fā)明實(shí)施的具體步驟是1.設(shè)計(jì)乙肝病毒特異性探針100-1003個(gè)。
乙肝病毒基因組大小為3.2kb，P區(qū)從2357核苷酸開始-1621個(gè)核苷酸位置終止，在這段基因組中設(shè)計(jì)探針117-381個(gè)，S區(qū)分為三段，S12848-3172，S23173-155，S156-833核苷酸，設(shè)計(jì)探針52-137個(gè)，C區(qū)分為前C區(qū)和C區(qū)，從1814-1901-2450個(gè)核苷酸，設(shè)計(jì)探針177-380個(gè)，X區(qū)1374-1818個(gè)核苷酸之間，設(shè)計(jì)探針37-115個(gè)。探針的大小8-25個(gè)堿基。
2.合成探針使用上海生物工程有限公司DNA合成儀合成。
3.探針處理由于設(shè)計(jì)的探針比較短，很難固化在膜上，因此我們在3’末端加了一個(gè)尾巴，使它能夠固化在尼龍膜上。
4.基因芯片的制備使用羅氏公司生產(chǎn)的帶有正點(diǎn)荷的尼龍膜，使用南開大學(xué)設(shè)計(jì)的NKG-Microarray III點(diǎn)樣儀(如

圖1所示)按預(yù)先設(shè)定好的順序進(jìn)行點(diǎn)樣(見表2，表2是乙型肝炎病毒基因分型和基因變異診斷芯片合成的引物序列)。
圖1是基因芯片微點(diǎn)陣操作平臺(tái)示意圖。
如圖所示，1為點(diǎn)樣臂，為有機(jī)玻璃制作，可以是一個(gè)以上；2為精密平移臺(tái)，為一維精密操縱器；3為點(diǎn)樣頭架，有機(jī)玻璃制作，用于裝載針架；4針架；5為精密電控平移臺(tái)Z軸；6為精密電控平移臺(tái)Y軸；7為精密電控平移臺(tái)X軸；8為光學(xué)平臺(tái)；9為電控箱；10為計(jì)算機(jī)；利用計(jì)算機(jī)控制軟件通過電控箱操作機(jī)械手自動(dòng)化點(diǎn)樣。
尼龍膜大小1.0-2.5cm×5cm，點(diǎn)數(shù)，按照不同的要求從幾十點(diǎn)到千點(diǎn)，依針管徑粗細(xì)點(diǎn)的大小為100-1000微米，點(diǎn)間的距離為200-1500微米，每點(diǎn)上樣量為0.05-0.1微升。
5.將點(diǎn)好的膜放在長波紫外燈下進(jìn)行交聯(lián)5-10分鐘，使DNA牢固固定在膜上。
6.處理血清取20微升血清，加入Lysis Buffer20微升混勻，然后100℃煮沸10分鐘，離心。
7.PCR擴(kuò)增采用套式PCR使用引物見表3(表3套式PCR引物)。第一次PCR反應(yīng)在PCR反應(yīng)管中加入PCR mix、處理好的標(biāo)本和引物1，按下列程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
94℃ 1min，1個(gè)循環(huán) 第二次擴(kuò)增在PCR反應(yīng)管中加入PCR mix、處理好的標(biāo)本和引物2，按下列程序進(jìn)行擴(kuò)增 8.探針的回收采用硅膠樹脂的方法進(jìn)行所需DNA片段的回收。
9.探針標(biāo)記使用羅氏公司生產(chǎn)的地高辛標(biāo)記試劑盒，方法參照試劑盒的說明。
10.雜交預(yù)雜交為0.5小時(shí)-1小時(shí)，雜交為3-12小時(shí)，在雜交箱中進(jìn)行。
11.顯色參照DAB檢測方法試劑盒說明書進(jìn)行。
12.檢測將作好的芯片掃描進(jìn)入計(jì)算機(jī)，然后用自設(shè)的計(jì)算機(jī)分析軟件自動(dòng)進(jìn)行結(jié)果分析，將結(jié)果輸出。
本發(fā)明經(jīng)在天津市第三中心醫(yī)院120例臨床應(yīng)用，實(shí)驗(yàn)證明NKG-450s乙肝病毒基因分型和基因變異診斷芯片具有診斷準(zhǔn)確、特異性強(qiáng)、操作簡單、信息量大等特點(diǎn)，臨床實(shí)驗(yàn)深受大夫們的歡迎。
實(shí)例1
設(shè)計(jì)乙肝病毒特異性探針429個(gè)。P區(qū)117個(gè)，S區(qū)52個(gè)，C區(qū)177個(gè)，X區(qū)37個(gè)。探針的大小為18-24堿基。由上海生物工程有限公司使用DNA合成儀合成探針，末端轉(zhuǎn)移酶催化下在3’末端加T尾巴15個(gè)以上。
基因芯片的制備使用羅氏公司塵產(chǎn)的帶有正點(diǎn)荷的尼龍膜(20×30cm)，和南開大學(xué)設(shè)計(jì)的NKG-Microarray III點(diǎn)樣儀按上述預(yù)先設(shè)定好的順序進(jìn)行點(diǎn)樣。針管徑粗為170微米，點(diǎn)間的距離為1400微米，每點(diǎn)上樣量為0.1微升。將點(diǎn)好的膜放在長波紫外燈下進(jìn)行交聯(lián)5分鐘，使DNA牢固固定在膜上。
芯片使用方法如下處理血清取20微升血清，加入Lysis Buffer20微升混勻，然后100℃煮沸10分鐘，離心。
PCR擴(kuò)增采用套式PCR方法。第一次PCR反應(yīng)在PCR反應(yīng)管中加入PCR mix、處理好的標(biāo)本和引物1，按下列程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
94℃1min，1個(gè)循環(huán) 第二次擴(kuò)增在PCR反應(yīng)管中加入PCR mix、處理好的標(biāo)本和引物2，按下列程序進(jìn)行擴(kuò)增 用硅膠樹脂過濾，進(jìn)行所需DNA片段的回收。使用羅氏公司生產(chǎn)的地高辛標(biāo)記試劑盒，方法參照試劑盒的說明。雜交預(yù)雜交為1小時(shí)，雜交為12小時(shí)，在雜交箱中進(jìn)行。參照DAB檢測方法試劑盒說明書進(jìn)行顯色，雜交信號(hào)呈棕黃色。
將作好的芯片掃描輸入計(jì)算機(jī)，按照表1 NKG-450/s乙肝病毒基因診斷芯片布陣，將結(jié)果輸出。
表1是NKG-450/s乙肝病毒基因診斷芯片布陣，該乙肝芯片型號(hào)為NKG-450/s，其中，1，2，14，15，16，17，29，30，218，219，233，234，421，422，436，437，434，435，449，450號(hào)為質(zhì)控探針，3-36號(hào)為乙型肝炎基因分型探針、37-54號(hào)為血清分型探針，55-171號(hào)為核苷酸類似物等抗病毒藥物的耐藥相關(guān)探針；172-224號(hào)為免疫逃亡探針，225-404號(hào)為臨床漏檢；干擾素應(yīng)答，免疫逃避，臨床狀況有關(guān)的探針；405-448號(hào)為病毒復(fù)制和原發(fā)性肝癌相關(guān)的缺失突變等特異性探針。
本發(fā)明臨床應(yīng)用實(shí)例按照表1所說的NKG-450/s乙肝病毒基因診斷芯片布陣進(jìn)行檢測病例1XXX，男，患乙肝多年，服用賀普丁一年，開始半年病情好轉(zhuǎn)，HBV DNA含量下降，轉(zhuǎn)氨酶也趨于正常；但隨后沒有徹底緩解開始反彈。2001年1月使用乙肝病毒基因診斷芯片檢測后，發(fā)現(xiàn)該病人在P區(qū)552aa的甲硫氨酸(M)變異為纈氨酸(V)，因此對病人進(jìn)行換藥治療三個(gè)月，經(jīng)檢查各項(xiàng)指標(biāo)開始恢復(fù)正常。
病例2該發(fā)明用于血站獻(xiàn)血員的檢測，從血站所取自愿獻(xiàn)血者血液20份，經(jīng)該乙肝病毒基因芯片檢測有2例乙肝病毒攜帶者。
病例3該患者患乙型肝炎多年，經(jīng)治療痊愈，后又去醫(yī)院復(fù)診，經(jīng)乙肝病毒基因芯片檢測，乙型肝炎復(fù)發(fā)。
乙型肝炎除做上述檢測外，還可以進(jìn)行藥物篩選和藥物治療效果跟蹤。
表1NKG-450/s乙肝病毒基因診斷芯片布陣
表2乙肝病毒基因檢測芯片合成寡核苷酸引物序列
表3套式PCR引物序列
權(quán)利要求
1.一種乙型肝炎病毒基因分型和基因變異診斷芯片，其特征在于在基質(zhì)尼龍膜上設(shè)置探針，探針在膜上的步陣，乙肝病毒特異性探針100-1003個(gè)，包括P區(qū)從2357核苷酸開始至1621個(gè)核苷酸位置終止，與核苷酸類似物和抗病毒藥物的耐藥相關(guān)探針117-381個(gè)；S變異區(qū)S12848-3172，S23173-155，S156-833個(gè)核苷酸，與免疫逃亡，臨床漏檢有關(guān)的探針52-137個(gè)；C變異區(qū)從1814-1901-2450個(gè)核苷酸，與干擾素應(yīng)答，免疫逃避，臨床狀況有關(guān)的探針177-380個(gè)；X變異區(qū)1374-1818個(gè)核苷酸之間，與病毒復(fù)制和原發(fā)性肝癌相關(guān)的缺失突變探針37-115個(gè)；探針的大小8-25個(gè)堿基；探針的3’末端加尾巴10個(gè)以上。
2.按照權(quán)利要求1所說的乙型肝炎病毒基因分型和基因變異診斷芯片，其特征在于所說的探針在膜上的步陣1，2，14，15，16，17，29，30，218，219，233，234，421，422，436，437，434，435，449，450號(hào)為質(zhì)控探針；3-36號(hào)為乙型肝炎基因分型探針；37-54號(hào)為血清分型探針；55-171號(hào)為核苷酸類似物和抗病毒藥物的耐藥相關(guān)探針；172-224號(hào)為免疫逃亡探針；225-404號(hào)為臨床漏檢，干擾素應(yīng)答，免疫逃避，臨床狀況有關(guān)的探針；405-448號(hào)為病毒復(fù)制和原發(fā)性肝癌相關(guān)的缺失突變特異性探針。
3.權(quán)利要求1所說的乙型肝炎病毒基因分型和基因變異診斷芯片的制備方法，其特征在于它包括下述步驟(1)設(shè)計(jì)乙肝病毒特異性探針，包括P區(qū)、S區(qū)、C區(qū)、X區(qū)；(2)使用DNA合成儀合成探針；(3)在3’末端加尾巴進(jìn)行探針處理，使它能夠固化在尼龍膜上；(4)使用帶有正點(diǎn)荷的尼龍膜，用芯片點(diǎn)樣機(jī)上按預(yù)先設(shè)定好的順序進(jìn)行點(diǎn)樣；(5)將點(diǎn)好的膜放在長波紫外燈(365nm)下進(jìn)行交聯(lián)5-10分鐘，使DNA牢固固定在膜上。
4.權(quán)利要求1所說的乙型肝炎病毒基因分型和基因變異診斷芯片的使用方法，其特征在于它包括下述步驟(1)將待檢血清加入Lysis Buffer處理血清，然后100℃煮沸10分鐘，離心備用；(2)PCR擴(kuò)增采用套式PCR方法，第一次PCR反應(yīng)在PCR反應(yīng)管中加入PCRmix、處理好的標(biāo)本和引物1，按下列程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增94℃ 1min，1個(gè)循環(huán) 第二次擴(kuò)增在PCR反應(yīng)管中加入PCR mix、處理好的標(biāo)本和引物2，按下列程序進(jìn)行擴(kuò)增 (3)采用硅膠樹脂的方法進(jìn)行所需DNA片段的回收探針；(4)隨機(jī)引物標(biāo)記探針；(5)在雜交箱中進(jìn)行雜交預(yù)雜交為0.5小時(shí)-1小時(shí)，雜交為3-12小時(shí)；(6)顯色；(7)將作好的芯片掃描輸入計(jì)算機(jī)檢測，輸出結(jié)果。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)體外診斷技術(shù),具體地講是一種基因芯片。乙肝病毒基因分型和變異診斷芯片是100－1003個(gè)乙肝病毒特異性探針和20個(gè)質(zhì)控探針構(gòu)成的基因診斷體外檢測芯片,該基因芯片具有診斷準(zhǔn)確、特異性強(qiáng)、信息量高的特點(diǎn),是目前乙肝病毒感染診斷最好的手段,對我國數(shù)千萬乙肝患者帶來福音。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1339608SQ01116078
公開日2002年3月13日 申請日期2001年5月15日 優(yōu)先權(quán)日2001年5月15日
發(fā)明者陳瑞陽, 高英堂, 陳力, 宋文芹 申請人:天津南開基因工程有限公司, 南開大學(xué)