專利名稱：乙型肝炎病毒基因分型的熒光pcr檢測方法及其試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)基因分型的熒光聚合酶鏈式反應(PCR)檢測方法及其試劑盒。
背景技術：
乙型肝炎病毒主要通過宿主免疫機制引起肝臟損害，機體細胞識別病毒抗原并攻擊受感染的肝細胞引起炎癥，這個過程受包括宿主與病毒的多個因素影響。病毒基因異質性影響著抗原的表達，可能也從中扮演了重要的角色。不同的毒株出現(xiàn)某些變異的頻率不同，不同毒株對機體免疫清除抵抗力不同以及其它的因素可能導致了不同基因型具有不同的感染后疾病譜。從目前的研究來看，HBV C基因型與較重的肝臟病變相關，B型則與較輕的病變相關；A型與慢性肝炎相關，D型與急性自限型肝炎相關；其它基因型與疾病譜的關系還有待特殊發(fā)現(xiàn)。Kao發(fā)現(xiàn)C型與重癥如肝硬化和肝細胞癌有關，B型多存在于年輕的非肝硬化患者中。C型患者多是HBeAg(+)并且血清DNA含量高于B型，C型患者在HBV的免疫清除階段血清轉化比B型延遲，同時C型比B型有更高的C基因啟動子突變率。在抗病毒治療中，B型比C型對拉咪呋啶敏感，不過兩型產(chǎn)生藥抗性的幾率是一樣的。Mayerat等比較了35例急性肝炎及30例慢性肝炎病人中的基因型分布，發(fā)現(xiàn)在慢性肝炎組中，A型占80％(28/35)，D型占11％(4/35)；急性肝炎組D型占80％(24/30)，A型占10％(3/30)，提示病毒基因型在病毒-宿主相互作用中有一定差異，這可能是因為基因型A所產(chǎn)生的抗原性要弱于基因型D，誘導機體產(chǎn)生免疫清除的能力也較弱，導致感染遷延。Lindh等對東亞地區(qū)的43名基因型為B和C的HBV慢性感染者的基因型及CP變異的研究表明，T1762變異更易出現(xiàn)在C基因型，感染C型后更易出現(xiàn)較重的肝臟炎癥。
對HBV進行基因分型有利于對HBV感染的流行病學、病因學和臨床診治進行更加深入細致的研究，現(xiàn)有研究表明不同亞型的HBV感染的臨床病程和對治療的反應都存在著一定的差異。病毒變異是生物遺傳進化的基本因素之一，乙型肝炎病毒變異是在慢性感染過程中為適應生存環(huán)境而自然發(fā)生的，也可發(fā)生于應用藥物或接種疫苗后。HBV在復制中利用RNA中間體，病毒聚合酶和逆轉錄酶活性是有效而迅速的，病毒聚合酶缺乏校對酶活性，發(fā)生核苷酸替代變異后難以修正。已發(fā)現(xiàn)HBV序列的變異在基因組各個區(qū)域均可發(fā)生。不同的病人機體和不同的藥物與不同的變異毒株長期相互作用表現(xiàn)出不同的基因型。雖然沒有確切數(shù)據(jù)表明HBV的變異比例，但病毒變異是高頻并永恒的，現(xiàn)在已經(jīng)由最初的A～D四型發(fā)展到了A～H八型，病毒與機體的繼續(xù)斗爭將會出現(xiàn)更多的變異熱點和基因型。盡管HBV分型、變異與臨床表征有著一定關聯(lián)度，但是目前仍然沒有完全闡明清楚。大規(guī)模的系統(tǒng)流行病學分子特征普查將更有助人們認識HBV與機體以及藥物的辨證關系，這就依賴于簡便快速的HBV分型方法。
目前我國的HBV攜帶者眾多，約占10％。在沒有特效藥的今天，治療乙肝仍然難有一個普遍應用的標準方案，造成不同患者的治療效果不一，長期的宿主攜帶和藥物濫用會提高變異株出現(xiàn)的風險。乙型肝炎是病毒與機體免疫應答的主要結果，需要制訂長期有針對性的治療方案。對HBV進行基因分型以及變異熱點的檢測，在選擇合適的藥物或制訂治療方案等方面都有重要指導。目前臨床檢測市場迫切需要有相關成熟的技術方案尤其是針對病毒分子特征以及機理的方法，來進一步指導乙肝的臨床治療以及發(fā)現(xiàn)和構建特效藥物，雖然有很多實驗室都在研究HBV分型及變異的檢測方法，但國內外市場上還是一片空白。
國內外對HBV進行基因分型的方法可分為全基因序列比對和片段基因序列比對兩大類。全基因序列比對是以生物系統(tǒng)發(fā)生學中的基因同源性為基礎的，它主要是通過HBV全基因序列測定來進行基因分型，另外，也可應用對HBV全基因進行限制性片段長度多態(tài)性分析技術(RFLP)。片段基因序列比對是利用HBV中的代表性片段的序列類型來反映全基因序列的類型，主要技術類型有片段基因序列測定、PCR-RFLP、型特異引物(SSP)擴增法和型特異探針(SSO)檢測法等。序列測定雖然結果準確可靠，但是由于其技術復雜、實驗流程長、實驗條件要求高、耗時長和費用昂貴難以作臨床常規(guī)使用，目前只作為實驗室研究使用；RFLP技術相對簡單，但是酶切位點易受基因變異影響，且遇混合感染或酶切不完全，會出現(xiàn)復雜條帶，影響分型結果判斷；應用SSP法進行PCR擴增需要多個擴增管，使用常規(guī)的PCR后產(chǎn)物電泳的方法也容易污染，其靈敏性比特異性探針低；應用SSO法可通過對單管的PCR產(chǎn)物進行檢測來分型，因此具有操作相對簡單和費用較低等特點，最具有實用價值?；蛐酒夹g是近幾年發(fā)展起來的新技術，它通過借鑒電子計算機機芯片陣列原理，利用核酸分子雜交和化學發(fā)光技術，使檢測結果具有靈敏度高、所需樣本微量和操作簡便等特點，是一種先進的SSO法。理論上，利用基因芯片技術建立乙型肝炎病毒基因分型診斷的方法是完全可能的，不過費用較高，還在實驗研究階段，目前尚未見有基因芯片進行HBV基因分型的研究報道。
實時熒光PCR反應是在常規(guī)PCR的一對引物之外，加入一個兩端帶有熒光標記的寡核苷酸探針。在探針完好的狀態(tài)下，5′端報告熒光基團的激發(fā)光被3′端的淬滅熒光基團所抑制。PCR反應過程中，隨著鏈的延伸，Taq酶沿著DNA模板移動到熒光標記探針的結合位置，由于它的5′→3′外切核酸酶活性，將熒光探針切斷，釋放出報告熒光基團的熒光信號，每合成一條新生鏈，就有一個報告基團的信號釋放，被釋放的激離報告熒光基團的數(shù)目和PCR產(chǎn)物是一對一的關系。通過熒光PCR儀定時動態(tài)監(jiān)測每一循環(huán)，可以得到樣品實際擴增曲線，找到PCR擴增的對數(shù)期，可以對樣本作定性定量檢測。到目前止還未見熒光PCR用于HBV基因分型的報道。HBV的變異是絕對的，并且要不斷的產(chǎn)生和累積各種變異，目前除了基因組全序列分析之外的所有方法都不能保證100％分型準確。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種更有效又簡便的乙型肝炎病毒基因分型的檢測方法；本發(fā)明的另一目的在于提供用于該方法的試劑盒。
本發(fā)明在大量分析現(xiàn)有已分型的HBV DNA序列的基礎上，找出HBV基因型的型特異性堿基的分布規(guī)律，采取了特異性引物和特異性探針結合的熒光PCR檢測方法，既提高了分型靈敏度、準確度，又延續(xù)了熒光PCR檢測方法的快速簡便性能，實現(xiàn)了本發(fā)明的目的。
本發(fā)明的一種乙型肝炎病毒基因分型的熒光PCR檢測方法的技術特征在于，在按下述方法設計得到的探針和對應引物的存在下，在熒光PCR儀中，對從血清樣品提取的乙型肝炎病毒DNA進行PCR擴增，實現(xiàn)乙型肝炎病毒基因分型檢測；所述的探針和引物的設計方法如下1.序列聯(lián)配從GenBank中找出已作基因分型的HBV DNA全序列進行序列聯(lián)配；2.根據(jù)序列聯(lián)配結果找出HBV基因型的型特異性堿基的聚集區(qū)域；3.根據(jù)型特異性堿基的聚集區(qū)域確定型特異的HBV DNA序列片斷；4.根據(jù)型特異的HBV DNA序列片斷設計探針；5.根據(jù)探針設計引物。
本發(fā)明從GenBank中找出盡量多的HBV DNA全序列，計有530多條，其中已經(jīng)作基因分型描述的有143條，其中A型23條，B型34條，C型52條，D型13條，E型3條，F(xiàn)型14條，G型2條，H型2條；把序列格式整理成FASTA格式；然后把已經(jīng)作基因分型的143條序列提交到EBI(European Bioinformatics Institute，歐洲生物信息學研究所)作序列聯(lián)配(Multiple Sequence alignment，又稱多序列比對)以發(fā)現(xiàn)HBV DNA在變異累積以及進化上的微小區(qū)別。
我們分析序列聯(lián)配結果在全序列范圍上找出型特異性堿基(所謂型特異性堿基是指各型在同一位置上各自相對于其他型而異的堿基，也就是說例如在某一位置上A型絕大多數(shù)出現(xiàn)某一個固定的堿基，而其他型都不會是這一堿基)，再進一步找出各型HBV DNA型特異性堿基的聚集區(qū)域，本發(fā)明遵循的原則是100bp內至少有6個以上的型特異性堿基才認為是型特異性堿基聚集區(qū)域。型特異性堿基的分布多數(shù)是無規(guī)則分布的，但是長期的病毒進化發(fā)展及其與宿主的相互關系使病毒在某些區(qū)域呈一定規(guī)律的型特異性堿基分布，這是本方法分型的最基本依據(jù)。例如A型和D型，這兩型有很明顯的特征，A型在第2355堿基附近比其他型多出約6個堿基，D型在第2845堿基附近缺失約33個堿基。這種插入和缺失也同樣被本發(fā)明視為是型特異性堿基。再仔細分析BC兩型的型特異性堿基是B型在第1611～1677堿基之間存在型特異性堿基聚集區(qū)域，C型在第1314～1390堿基之間存在型特異性堿基聚集區(qū)域。
根據(jù)熒光PCR探針設計的一般原則設計探針(探針Tm值在68～70℃之間，GC含量在30％～80％之間，不能有連續(xù)出現(xiàn)的6個相同堿基，5’端不能為堿基G，避免二級結構)，使得探針盡可能包含型特異性堿基。在探針的基礎上，根據(jù)熒光PCR引物設計的一般原則設計引物(引物Tm值要比探針低10℃左右，與探針同向的那一條引物應該與探針靠近，最好相隔不超過2個堿基，避免二級結構)，使得引物3’端最后一個堿基盡可能是型特異性堿基。以上描述主要針對B/C兩型，對于A/D兩型因為型特異性堿基差異太大，只要把探針設計在插入/缺失的幾個堿基上就可以了。設計的引物探針與反應結果成正對應，即是說在某一型反應中有擴增就定為某一型。
本發(fā)明所述的探針和引物的設計方法適用于乙型肝炎病毒各基因型，但針對東南亞尤其是中國人常見的B、C、D和A型，下面僅給出這幾個型最好的探針和引物的設計(FAM為發(fā)光基團，BHQ1為淬滅基團，冒號前是引物或探針的名稱，后面是具體序列；各型引物探針分別是上游引物、探針、下游引物的排列方式)。
乙型肝炎病毒C基因型，其型特異的HBV DNA序列片段為GAAACTTATCGGCACCGACAACTCTGTTGTCCTCTCTCGGAAATACACCTCCTTTCCATGGCTGCTAGGCTGTG所述的引物和探針的序列為BVc1314priGAAACTTATCGGCACCGACAACBVc1340proFAM-CTGTTGTCCTCTCTCGGAAATACACCTCCT-BHQ1BVc1390rpriCACAGCCTAGCAGCCATGG乙型肝炎病毒B基因型，其型特異的HBV DNA序列片段為AGACCACCGTGAACGCCCACCGGAACCTGCCCAAGGTCTTGCATAAGAGGACTCTTGGACTTTCAG所述的引物和探針的序列為BVb1611priAGACCACCGTGAACGCCCBVb1650rproFAM-AGACCTTGGGCAGGTTCCGGTG-BHQ1BVb1677rpriCTGAAAGTCCAAGAGTCCTCTTATGC乙型肝炎病毒D基因型，其型特異的HBV DNA序列片段為GTGGGTCACCATATTCTTGGGAACAAGAGCTACAGCATGGGGCAGAATCTTTCCACCAGCAATCCTCTG所述的引物和探針的序列為BVd2811priGTGGGTCACCATATTCTTGGGABVd2835proFAM-CAAGAGCTACAGCATGGGGCAGAATC-BHQ1BVd2879rpriCAGAGGATTGCTGGTGGAAA乙型肝炎病毒A基因型，其型特異的HBV DNA序列片段為ATCACTTCCGGAAACTACTGTTGTTAGACGACGG(A)GACCGAGGCAGGTCCCCTAGAAGAAGAACTCCTCGCCTC所述的引物和探針的序列為
BVa2322priATCAGTTCCGGAAACTACTGTTGTTABVa2349proFAM-ACGACGGGACCGAGGCAGGTC-BHQ1BVa2390rpriGAGGCGAGGGAGTTCTTCTTCTA本發(fā)明的熒光PCR反應與一般的熒光PCR反應一樣，所需的熒光PCR反應液中含有PCR反應緩沖液，Mg2+溶液，dNTP，Taq DNA聚合酶，以及探針和所對應的一對上、下游引物；上述物質的濃度都在通常的PCR反應所需的濃度范圍內，所述的PCR反應緩沖液為1×PCR反應緩沖液包括10mmol/L Tris-HCl，pH 8.9，50mmol/L KCl，5％甘油；Mg2+溶液濃度為2.5mmol/L；所述的dNTP濃度為0.2mmol/L；Taq DNA聚合酶為1U；探針濃度為0.12μmol/L；上、下游引物濃度各為0.6μmol/L；為預防污染PCR反應液中最好還含有尿嘧啶糖苷酶(UNG)0.1U。
本發(fā)明確定的PCR擴增條件為94℃ 1min→94℃ 5s→退火溫度55～65℃ 30s，其中94℃ 5s→55～65℃ 30s之間進行30～50次循環(huán)；所述的退火溫度最好為60℃，所述的循環(huán)最好為40次。依據(jù)本公司以往的經(jīng)驗，利用熒光PCR儀檢測HBV，擴增的長度在200bp以內，可以采用兩步法。因為PCR最關鍵的是退火溫度，所以根據(jù)以上體系和已選擇的引物探針嘗試不同的退火溫度，根據(jù)設計引物和探針的Tm值，在退火溫度55～65℃范圍內，對55℃、58℃、60℃、61℃和62℃五個溫度的反應結果作比較，發(fā)現(xiàn)用60℃作退火溫度適合98％的HBV DNA型特異性擴增，少數(shù)在60℃沒有擴增的HBV DNA在調節(jié)到55℃后可以明確分型，少數(shù)B型C型都有擴增的HBV DNA在調節(jié)到61℃后可以明確分型。
本發(fā)明所需的乙型肝炎病毒DNA可以用通常的方法從血清樣品中提取，最好采用本發(fā)明提供的方法，詳見實施例。
本發(fā)明標記探針的熒光染料是通常熒光PCR檢測采用的，最好是FAM(Carboxyfluorescein，羧基熒光素，吸收波長492nm，發(fā)射波長518nm，綠色)；淬滅劑是BHQ1(Black Hole Quencher 1，一種叫黑洞的光吸收物質，其有效吸收光的波長在500-580nm。)。
本發(fā)明測定結果的判斷引物和探針設計的期望結果判斷是呈正對應的，即哪一型有熒光擴增就可判別為此型。因為A型和D型與其他型有比較明顯的序列差異，所以在結果判斷上，先看A/D型有否擴增，A/D型有擴增而B/C型都沒擴增的就應是A/D型；A/D型沒有擴增的前提下再看B/C型哪一個有擴增，就為哪一型。有時候會碰到BC都沒擴增，這種現(xiàn)象通過降低反應退火溫度(2～5℃左右)仍然可以再分型；有時候也有BC都有擴增的現(xiàn)象，這種現(xiàn)象通過升高反應退火溫度(1～2℃左右)仍然可以再分型。不過這只針對中國人常見的ABCD型，對于都沒有擴增的不能惘下斷言，因為可能會是EFGH等型；對于都有擴增的也要謹慎，因為可能存在混合型病毒感染或者是不同型的HBV的嵌合體。所以推薦進行全序列分析。
一種用于本發(fā)明乙型肝炎病毒基因分型的熒光PCR檢測方法的試劑盒，含有PCR反應液，包括PCR反應緩沖液，Mg2+溶液，dNTP，Taq DNA聚合酶，以及由本發(fā)明上述方法設計的任一條探針和所對應的一對上、下游引物。上述物質的濃度都在通常PCR反應所需的濃度范圍內，所述的PCR反應緩沖液為1×PCR反應緩沖液包括10mmol/L Tris-HCl，pH 8.9，50mmol/LKCl，5％甘油；所述的Mg2+溶液濃度為2.5mmol/L；所述的dNTP濃度為0.2mmol/L；所述的Taq DNA聚合酶為1U；所述的探針濃度為0.12μmol/L；所述的上、下游引物濃度各為0.6μmol/L；PCR反應液中最好還含有尿嘧啶糖苷酶(UNG)0.1U。本發(fā)明試劑盒最好還含有DNA提取試劑，包括A液6mol/L異硫氰酸胍，30mmol/L檸檬酸鈉，0.58％十二烷基磺酸鈉，1mmol/L乙二胺四乙酸二鈉，2％糖原；B液異丙醇；C液75％乙醇水溶液。
本發(fā)明效果及優(yōu)點經(jīng)過超過100份標本的驗證，本發(fā)明方法分型準確度達到98％，通過調整反應條件可達到100％的準確度；比全序列分析方法簡單快捷，實驗流程少，耗時短，費用又低，又比常規(guī)的PCR及RFLP相關的方法準確，而且本發(fā)明方法封閉式的檢測能有效的避免污染。
具體實施例方式
下列僅以中國人常見的HBV基因A、B、C、和D型實驗為例進一步說明本發(fā)明，不應該當作對本發(fā)明的限制。
實施例1本發(fā)明乙型肝炎病毒基因分型的熒光PCR測定方法及其試劑盒。
1.試劑盒組成(1)DNA提取試劑包括A液6mol/L異硫氰酸胍，30mmol/L檸檬酸鈉，0.58％十二烷基磺酸鈉，1mmol/L乙二胺四乙酸二鈉，2％糖原；B液異丙醇；C液75％乙醇水溶液。
(2)PCR反應試劑A型PCR反應液(每人份用量)加入量 終濃度10×PCR緩沖液(100mmol/L Tris-HCl，2.5μL 1×PCR緩沖液pH 8.9，500mmol/L KCl，50％甘油)25mmol/L MgCl22.5μL 2.5mmol/L5mmol/L dNTP 1μL 0.2mmol/L100pmol/μL A型引物1 0.15μL0.6μmol/L100pmol/μL A型引物2 0.15μL0.6μmol/L100pmol/μL A型探針 0.03μL0.12μmol/L5U/μL Taq酶 1U
1U/μL UNG 0.1U用純化水定容至23μL。
所述的A型引物和探針的序列為引物1ATCACTTCCGGAAACTACTGTTGTTA引物2GAGGCGAGGGAGTTCTTCTTCTA探針ACGACGGGACCGAGGCAGGTCB型PCR反應液(每人份用量)除引物和探針為B型，其序列與A型的序列不同外，其它試劑及其濃度與A型PCR反應液相同。
所述的B型引物和探針的序列為引物1AGACCACCGTGAACGCCC引物2CTGAAAGTCCAAGAGTCCTCTTATGC探針AGACCTTGGGCAGGTTCCGGTGC型PCR反應液(每人份用量)除引物和探針為C型，其序列與A型的序列不同外，其它試劑及其濃度與A型PCR反應液相同。
所述的C型引物和探針的序列為引物1GAAACTTATCGGCACCGACAAC引物2CACAGCCTAGCAGCCATGG探針CTGTTGTCCTCTCTCGGAAATACACCTCCTD型PCR反應液(每人份用量)除引物和探針為D型，其序列與A型的序列不同外，其它試劑及其濃度與A型PCR反應液相同。
所述的D型引物和探針的序列為引物1GTGGGTCACCATATTCTTGGGA引物2CAGAGGATTGCTGGTGGAAA探針CAAGAGCTACAGCATGGGGCAGAATC(3)型別陽性標準品乙型肝炎病毒基因A型標準品(105～107copies/mL)、乙型肝炎病毒基因B型標準品(105～107copies/mL)、乙型肝炎病毒基因C型標準品(105～107copies/mL)、乙型肝炎病毒基因D型標準品(105～107copies/mL)。
2.乙型肝炎病毒基因分型的熒光PCR測定
(1)臨床樣本取樣用無菌注射器抽取受檢者靜脈血1mL，注入無菌1.5mL離心管中，于室溫靜置2小時，轉入4℃放置。如果沒有明顯的血清上清，則5000r/min離心5分鐘，取上清轉入另一無菌離心管中(注意勿帶入紅細胞)，即為血清標本。
(2)血清標本的DNA提取處理取120μL DNA提取A液于0.5mL離心管中，每管分別加入已檢定為HBV DNA陽性的待檢血清、陰性對照血清60μL，做好標記，混勻，98℃加熱10分鐘裂解；加入180μL DNA提取B液，充分混勻，13000r/min離心8分鐘，去上清；加入150μL DNA提取C液，顛倒混勻數(shù)次，13000出r/min離心3分鐘，吸棄上清(將200μL加樣槍槍尖伸至管底一次吸干)，開蓋室溫放置5分鐘晾干；加入15μL純化水稀釋混懸沉淀物，短暫離心使液體落于管底部，備用(提取所用A、B和C液見試劑盒)。
按上述試劑盒加入量分別取各型反應液于各個PCR反應管內，再分別加入2μL提取的DNA模板及各型的陽性對照品，整個反應體系為25μL，同時做空白對照；蓋上管蓋，將反應管置于全自動熒光PCR ABI7000檢測儀中，參照儀器操作說明設定空白對照、各型陽性對照、待檢樣本等參數(shù)進行PCR反應。
熒光PCR反應條件設定94℃ 1分鐘；94℃ 5秒，60℃ 30秒，40個循環(huán)。熒光素設定為FAM。
3.結果判定綜合分析儀器給出的各項數(shù)據(jù)，設定合理的閾值(Threshold)和基線(Baseline)，使儀器給出正確的結果?？瞻准瓣幮詫φ諡殛幮裕桓餍完栃詫φ站鶠殛栃?。待測樣本在A型反應液中有擴增即為A型，在D型反應液中有擴增即為D型；A/D型陰性的在B型反應液中有擴增即為B型，在C型反應液中有擴增即為C型。
實施例2臨床實驗本實驗共檢測了103份標本，其中A型1例，D型1例，B型46例，C型53例。有1例標本所有型反應液都為陰性，適當降低反應溫度(55℃)再進行PCR反應，發(fā)現(xiàn)為C型。有1例B、C型反應都有擴增，提高反應溫度(61℃)再進行PCR反應，發(fā)現(xiàn)也是C型。臨床中也出現(xiàn)過多型HBV混合感染、或嵌合型HBV感染的情況，因此如果出現(xiàn)多個型反應液中都有擴增的情況，而反應條件的調整沒能明顯分型的話，應該進行HBV全序列分析。
權利要求
1.一種乙型肝炎病毒基因分型的熒光PCR檢測方法，其特征在于，在按下述方法設計得到的探針和對應引物的存在下，在熒光PCR儀中，對從血清樣品提取的乙型肝炎病毒DNA進行PCR擴增，實現(xiàn)乙型肝炎病毒基因分型檢測；所述的探針和引物的設計方法如下(1)序列聯(lián)配從GenBank中找出已作基因分型的乙型肝炎病毒DNA全序列進行序列聯(lián)配；(2)根據(jù)序列聯(lián)配結果找出乙型肝炎病毒基因型的型特異性堿基的聚集區(qū)域；(3)根據(jù)型特異性堿基的聚集區(qū)域確定型特異的乙型肝炎病毒DNA序列片斷；(4)根據(jù)型特異的乙型肝炎病毒DNA序列片斷設計探針；(5)根據(jù)探針設計引物。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種乙型肝炎病毒基因分型的熒光PCR檢測方法，其特征在于所述的乙型肝炎病毒基因型為C基因型，所述的型特異的乙型肝炎病毒DNA序列片段為GAAACTTATCGGCACCGACAACTCTGTTGTCCTCTCTCGGAAATACACCTCCTTTCCATGGCTGCTAGGCTGTG所述的引物和探針的序列為引物1GAAACTTATCGGCACCGACAAC引物2CACAGCCTAGCAGCCATGG探針CTGTTGTCCTCTCTCGGAAATACACCTCCT
3.根據(jù)權利要求1所述的一種乙型肝炎病毒基因分型的熒光PCR檢測方法，其特征在于所述的乙型肝炎病毒基因型為B基因型，所述的型特異的乙型肝炎病毒DNA序列片段為GGGAGCATTCGGGCCAGGGTTCACCCCTCCCCATGGGGGACTGTTGGGGTGGAGCCCTC所述的引物和探針的序列為引物1AGACCACCGTGAACGCCC引物2CTGAAAGTCCAAGAGTCCTCTTATGC探針AGACCTTGGGCAGGTTCCGGTG
4.根據(jù)權利要求1所述的一種乙型肝炎病毒基因分型的熒光PCR檢測方法，其特征在于所述的乙型肝炎病毒基因型為D基因型，所述的型特異的乙型肝炎病毒DNA序列片段為GTGGGTCACCATATTCTTGGGAACAAGAGCTACAGCATGGGGCAGAATCTTTCCACCAGCAATCCTCTG所述的引物和探針的序列為引物1GTGGGTCACCATATTCTTGGGA引物2CAGAGGATTGCTGGTGGAAA探針CAAGAGCTACAGCATGGGGCAGAATC
5.根據(jù)權利要求1所述的一種乙型肝炎病毒基因分型的熒光PCR檢測方法，其特征在于所述的乙型肝炎病毒基因型為A基因型，所述的型特異的乙型肝炎病毒DNA序列片段為ATCACTTCCGGAAACTACTGTTGTTAGACGACGG(A)GACCGAGGCAGGTCCCCTAGAAGAAGAACTCCTCGCCTC所述的引物和探針的序列為引物1ATCACTTCCGGAAACTACTGTTGTTA引物2GAGGCGAGGGAGTTCTTCTTCTA探針ACGACGGGACCGAGGCAGGTC
6.根據(jù)權利要求1～5中所述的任一種乙型肝炎病毒基因分型的熒光PCR檢測方法，其特征在于所述的PCR擴增條件為
94℃ 1min→94℃ 5s→退火溫度55～65℃ 30s，其中94℃ 5s→55～65℃ 30s之間進行30～50次循環(huán)。
7.根據(jù)權利要求6所述的一種乙型肝炎病毒基因分型的熒光PCR檢測方法，其特征在于所述的退火溫度為60℃，所述的循環(huán)為40次。
8.根據(jù)權利要求1所述的一種乙型肝炎病毒基因分型的熒光PCR檢測方法，其特征在于所述的乙型肝炎病毒DNA提取方法如下取120μL DNA提取A液于0.5mL離心管中，每管分別加入待檢血清、陰性對照血清60μL，做好標記，混勻，98℃加熱10分鐘裂解；加入180μL DNA提取B液，充分混勻，13000r/min離心8分鐘，去上清；加入150μL DNA提取C液，顛倒混勻數(shù)次，13000rpm/min離心3分鐘，吸棄上清，開蓋室溫放置5分鐘晾干；加入15μL純化水稀釋混懸沉淀物，短暫離心使液體落于管底部；所述的A液包括6mol/L異硫氰酸胍，30mmol/L檸檬酸鈉，0.58％十二烷基磺酸鈉，1mmol/L乙二胺四乙酸二鈉，2％糖原；所述的B液為異丙醇；所述的C液為75％乙醇水溶液。
9.一種用于乙型肝炎病毒基因分型的熒光PCR檢測方法的試劑盒，其特征在于該試劑盒含有PCR反應液，包括PCR反應緩沖液，Mg2+溶液，dNTP，Taq DNA聚合酶，以及權利要求1～5中所述的任一組探針和所對應的一對上、下游引物。
10.根據(jù)權利要求9所述的一種用于乙型肝炎病毒基因分型的熒光PCR檢測方法的試劑盒，其特征在于所述的PCR反應緩沖液為1×PCR反應緩沖液包括10mmol/L Tris-HCl，pH8.9，50mmol/L KCl，5％甘油；所述的Mg2+溶液濃度為2.5mmol/L；所述的dNTP濃度為0.2mmol/L；所述的Taq DNA聚合酶為1U；所述的探針濃度為0.12μmol/L；所述的上、下游引物濃度各為0.6μmol/L；所述的PCR反應液中還含有尿嘧啶糖苷酶0.1U；所述的試劑盒還含有DNA提取試劑，包括A液6mol/L異硫氰酸胍，30mmol/L檸檬酸鈉，0.58％十二烷基磺酸鈉，1mmol/L乙二胺四乙酸二鈉，2％糖原；B液異丙醇；C液75％乙醇水溶液。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種乙型肝炎病毒(HBV)基因分型的熒光PCR檢測方法及其試劑盒。其方法特征在于，從GenBank中找出已作基因分型的HBV DNA全序列進行序列聯(lián)配；根據(jù)序列聯(lián)配結果找出HBV基因型的型特異性堿基的聚集區(qū)域；根據(jù)型特異性堿基的聚集區(qū)域設計探針和一對引物。在該探針和引物的存在下，在熒光PCR儀中，對從血清樣品提取的HBV DNA進行PCR擴增實現(xiàn)HBV基因分型檢測。本發(fā)明還提供了用于本發(fā)明方法的試劑盒和型別陽性標準品。本發(fā)明方法分型準確度達到98％，通過調整反應條件可達到100％；比全序列分析簡單快捷，實驗流程少，耗時短，費用低，又比常規(guī)的PCR及RFLP相關的方法快捷，準確，而且本發(fā)明方法封閉式的檢測能有效地避免污染。
文檔編號G01N33/52GK1588066SQ20041005123
公開日2005年3月2日 申請日期2004年8月27日 優(yōu)先權日2004年8月27日
發(fā)明者白培勝, 黃茜華, 周榮 申請人:廣州華銀基因科技有限公司