一種人運動神經(jīng)元基因拷貝數(shù)相對定量檢測方法及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于人核酸體外檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種人運動神經(jīng)元基因拷貝數(shù)相 對定量檢測方法及檢測試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 位于人5號染色體上的運動神經(jīng)兀存活基因（Survival of Motor Neuron, SMN) 包括端粒端的運動神經(jīng)元存活基因1 (SMNl)和著絲粒端的運動神經(jīng)元存活基因2 (SMN2)， 二者均有8個外顯子，分別為外顯子1、外顯子2a、外顯子化W及外顯子3 - 8。SMN1與 SMN2高度同源，僅相差5個核巧酸（內(nèi)含子6;-45G - A，外顯子7;+6C - T，內(nèi)含子7: +100A - G和+214A - G，外顯子8;+245G - A)。SMN蛋白正常表達與人脊髓前角a運動 神經(jīng)元的功能密切相關(guān)。當(dāng)缺失S^1N蛋白或S^1N蛋白功能異常時，將導(dǎo)致脊髓前角a運動 神經(jīng)元功能退化，出現(xiàn)進行性、對稱性肢體近端和軀干肌肉無力、萎縮，進而死亡，該一疾病 被稱為脊髓性肌萎縮癥（Spinal Mus州lar Atrophy, SMA)。目前的研究已表明，導(dǎo)致SMA 的主要原因為SMN1基因缺陷，而SMN2基因與SMA臨床表現(xiàn)的輕重相關(guān)。原因是，SMN1基 因表達的蛋白是維持脊髓前角a運動神經(jīng)元功能的主要蛋白，而SMN2基因所表達蛋白的 功能僅相當(dāng)于SMN1基因所表達蛋白功能的約10%。SMA是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)常染色體隱 性遺傳病，群體發(fā)病率高達1:6 000 - 1:10 000,居神經(jīng)系統(tǒng)致死性常染色體隱性遺傳病 的第二位。最近的研究表明，S^1N的拷貝數(shù)可能還與散發(fā)性肌萎縮側(cè)索硬化癥的預(yù)后和表 型相關(guān)。因此，對人SMN基因拷貝數(shù)進行相對定量檢測，無論是對臨床相關(guān)疾病的輔助診斷 或是對新生兒SMA出生缺陷預(yù)防都是具有參考價值的指標(biāo)之一。
[0003] 人細(xì)胞為二倍體細(xì)胞，正常人細(xì)胞中2條染色體上各有一個正常的SMN1基因，即 每個正常細(xì)胞有2個拷貝的SMN1基因，攜帶者由于1條染色體上的SMN1基因突變導(dǎo)致功 能缺失則僅有1個拷貝的SMN1基因，SMA患者則無正常的SMN1基因，即為0拷貝。SMN2基 因的拷貝數(shù)對SMA的疾病表型有重要影響，SMN2拷貝數(shù)越多，SMA的臨床表現(xiàn)越輕，患者存 活時間也越長。研突變表明，正常人每細(xì)胞中的SMN2的拷貝數(shù)可W從0-3個拷貝不等，多 數(shù)為1個拷貝或2個拷貝。
[0004] 在導(dǎo)致SMA的SMN1基因突變中，最常見的是SMN1基因第7和/或第8外顯子的 缺失，該兩個位點的突變占SMN1基因突變譜的95% W上，其它的突變類型多為點突變或小 片段的缺失或重復(fù)，其中在歐美人群中發(fā)現(xiàn)S^1N1基因外顯子6的815 (A〉0錯意突變 (即 Y272CX768-778 dup[TGCTGATGCIT]移碼突變（即 Ubp-DUP)及外顯子 3 的 399-402 del [AGAG]移碼突變（即4bp-DEL)是最為常見的H個熱點突變。在不同人群中對SMN1基 因突變進行的研究發(fā)現(xiàn)，在全球范圍內(nèi)，SMN1基因攜帶者頻率為1 ;40 - 1 ;60。
[0005] 然而，目前臨床上尚無方便的可對SMN1和SMN2基因拷貝數(shù)相對定量的檢測方法。 臨床上對SM的輔助分子檢測，目前常用的是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)一限制性片段長度多態(tài)性 法，即PCR-RFLP法(李秀玲等，中國婦幼保健，2011,26:2220-2223)。該一方法僅可對S^1N1 基因第7外顯子、第8外顯子缺失純合（即0拷貝）的SMA病例進行定性檢測，無法對S^1N1 基因缺失突變攜帶者進行檢測。另一常用的方法是多重連接探針擴增技術(shù)，即MPLA法， (Passon N, et al. Mol Cell Probes. 2010，24(5) : 310-314)。目前，荷蘭 MRC 公司已推 出僅用于科學(xué)研究的基于MLPA技術(shù)的SMA檢測試劑。其它的方法還包括變性高效液相色 譜法，即 DHPLC 法（SuYN, etal. PLoSOne. 2011，6(2):el7067)〇 無論是 DHPLC 法還是 MLPA法，雖然可W對SMNl和SMN2基因第7外顯子和第8外顯子缺失攜帶者進行檢測，但該 些方法均需要在PCR反應(yīng)結(jié)束后，開管對PCR產(chǎn)物進行后處理，在操作過程中易發(fā)生實驗室 污染，且費時、費力，無法實現(xiàn)大通量的批量檢測。另外，無論是DHPLC法還是MLPA法，對于 SMN1和SMN2基因第7外顯子和第8外顯子的拷貝數(shù)定量只是在PCR反應(yīng)終點半定量，其 結(jié)果判斷更多的是依據(jù)經(jīng)驗而無法形成標(biāo)準(zhǔn)化的結(jié)果判定方法。近年來，已有學(xué)者在研究 基于實時英光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)的SMA檢測方法，即Real-Time PCR法（曾聽孟等， 發(fā)明專利申請；201310509147. 9 ;江雨等，中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志，2014,31(2) :180-184)。 Real-time PCR的方法可W有效地避免PCR-RFLP、DHPLC、MLPA等技術(shù)的缺陷。然而對目前 采用Real-Time PCR技術(shù)進行SMA檢測的一些文獻進行分析發(fā)現(xiàn)，該些技術(shù)均是基于S^1N1 與SMN2基因間的有限核巧酸差異(外顯子7與外顯子8各有一個核巧酸的差異)，采用傳統(tǒng) 的擴增阻抗原理設(shè)計相應(yīng)的引物與探針。W第7外顯子為例，即將SMN1基因與SMN2的差 異堿基置于PCR引物3'端最后一位（SMN1第7外顯子為C, SMN2第7外顯子為T),而檢測 探針采用SMN1與SMN2公用探針。然而，研究表明，該樣的設(shè)計并足W有效區(qū)別SMN1第7 外顯子和SMN2第7外顯子。從而使對SMN1或SMN2基因拷貝數(shù)的相對定量出現(xiàn)偏差，影響 其結(jié)果的臨床參考價值。Rea^Time PCR法的另一設(shè)計策略是，依據(jù)SMN1與SMN2的差異 堿基巧日第7外顯子的C和T、第8外顯子的G和A)，在差異堿基位置設(shè)計特異性的探針，但 該一設(shè)計無法避免的是SMN1與SMN2的PCR擴增引物將是公用的。大樣本的研究表明，在 攜帶者群體中，SMN2基因拷貝數(shù)可多達4個W上，對于只有1個拷貝SMN1的攜帶者而言， 當(dāng)SMN1與SMN2采用公用引物進行擴增時，將無法避免多拷貝SMN2基因優(yōu)勢擴增對單拷貝 SMN1基因的影響（因為此時二者的PCR引物相同)，同樣會導(dǎo)致相對定量結(jié)果的偏差。另外， 該些技術(shù)所關(guān)注的也僅是SMN1外顯子7和外顯子8的缺失突變，而未能對SMN1基因外顯 子6的Y272C、Ubp-DUP及外顯子3的4bp-呢L等常見熱點突變進行檢測。
[0006] 因此，現(xiàn)有技術(shù)方法的可靠性無法滿足對于人運動神經(jīng)元基因拷貝數(shù)相對定量的 需要，迫切需要一種可靠的、可對SMN1基因和SMN2基因第7、第8外顯子拷貝數(shù)進行相對定 量的檢測方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的就是針對目前人運動神經(jīng)元基因拷貝數(shù)定量檢測方法存在的問題 與不足，提供一種檢測快速、簡便，檢測結(jié)果可靠的人運動神經(jīng)元基因拷貝數(shù)相對定量檢測 方法及檢測試劑盒。
[0008] 本發(fā)明提供的人運動神經(jīng)元基因拷貝數(shù)相對定量檢測方法及試劑盒，是針對人運 動神經(jīng)元基因(包括SMN1和SMN2基因)第7、第8外顯子拷貝數(shù)進行相對定量檢測，并同時 對SMN1第6外顯子Y272C、Ubp-DUP和第3外顯子4bp-呢L H個熱點突變的基因型進行定 性檢測。本發(fā)明設(shè)計巧妙，采用閉管檢測，避免樣本污染，同時可有效避免現(xiàn)有擴增阻方法 中SMN1與SMN2高度同源性導(dǎo)致的相互干擾，檢測快速、簡便，相對定量檢測結(jié)果可靠，適于 大規(guī)模推廣應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明提供的人運動神經(jīng)元基因拷貝數(shù)相對定量檢測方法，是采用四個PCR反應(yīng) 分別對SMN1基因第7和第8外顯子、SMN2基因第7和第8外顯子進行拷貝數(shù)相對定量檢 巧1|，并采用第五PCR反應(yīng)對SMN1第6和第3外顯子上H個熱點突變進行定性檢測，其中： 1、第一 PCR反應(yīng)，是針對SMN1基因第7外顯子的相對定量檢測PCR反應(yīng)，采用如下引 物與探針： 公用上游引物P1 (為SEQ ID No. 1所示核巧酸序列)、公用引物P2 (為SEQ ID No. 2所 示核巧酸序列XRPP40上游引物P3 (為SEQ ID No. 3所示核巧酸序列XRPP40下游引物P4 (為569 10齡.4所示核巧酸序列)、3??40檢測探針？5(為569 10齡.5所示核巧酸序列)、 SMN1第7外顯子上游引物陽7-1F (為SEQ ID No. 6所示核巧酸序列)、SMN1第7外顯子下 游引物陽7-1R (為SEQ ID No. 7所示核巧酸序列）、SMN1第7外顯子檢測探針陽7-1D (為 SEQ ID No. 8所示核巧酸序列XSMN2第7外顯子封閉探針陽7-2A (為SEQ ID No. 9所示核 巧酸序列)。
[0010] 其中，P1、P2、P3、P4、P5、陽7-1F、PE7-1R、陽7-1D、陽7-2A 工作濃度范圍依次為： 300 - 600nmol/L、300 - 600nmol/L、20 - 60nmol/L、20 - 60nmol/L、100 - 200nmol/L、30 一 60nmol/L、30 - 60nmol/L、100 - 200nmol/L、100 - 400nmol/L。
[0011] 2、第二PCR反應(yīng)，