專利名稱：基于新型dna結合染料的實時熒光定量pcr檢測方法及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種PCR檢測方法及其應用，特別是涉及一種基于新型DNA結合染料 的實時熒光定量PCR檢測方法及其在制備實時熒光定量PCR檢測試劑盒中的應用。
背景技術：
1996年，實時熒光定量PCR技術由美國Applied Biosystems公司首先推出。所謂 實時熒光定量PCR (real-time quantitative PCR)是指在PCR指數(shù)擴增期間通過連續(xù)監(jiān)測 熒光信號出現(xiàn)的先后順序以及信號強弱的變化來即時分析目的基因的拷貝數(shù)目，通過與加 入已知量的標準品進行比較，可實現(xiàn)實時定量檢測。實時熒光定量PCR技術實現(xiàn)了 PCR從 定性到定量的飛躍，它以其特異性強、靈敏度高、重復性好、定量準確、速度快、全封閉反應 等優(yōu)點成為了分子生物學研究中的重要工具。 目前，根據(jù)實時熒光定量PCR所使用的熒光化學物質(zhì)的不同，熒光定量PCR技術主 要分兩類，熒光染料和熒光探針。其中熒光探針包括T叫man探針、分子信標、FRET探針、蝎 式探針等。熒光染料主要包括Y0-PR0-1、 SYBR Green 1、BEB0和LC Green等。熒光染料 定量PCR的優(yōu)勢在于它使用方便，不需要設計復雜的熒光，使檢測方法變得簡便，同時也降 低了檢測的成本。而且，它能監(jiān)測任何雙鏈DNA序列的擴增，沒有引物特異性，可以用于不 同的模板。然而，正是由于熒光染料能和任何雙鏈DNA結合，因此它也能與非特異的雙鏈 DNA(如引物二聚體)結合，使實驗容易產(chǎn)生假陽性信號。引物二聚體的問題目前可以用熔 解曲線(melting curve)加以解決，來區(qū)分特異性和非特異性擴增。因此，作為一種方便快 捷的定量PCR方法，熒光染料定量PCR應用非常廣泛。 SYBR Green I因為其毒性低、價格便宜，成為最常使用的一種定量PCR熒光染料。 但是，SYBR Green I也存在一些明顯的不足。例如，在未進行優(yōu)化之前不能用于普通PCR緩 沖液中，并且需要額外的試劑(如DMSO、 BSA等)來增加反應的效率。盡管通過提高MgCl2 的濃度可以在一定程度上減小其抑制效應，但SYBR Green I仍可以濃度依賴的方式抑制 PCR反應。這種抑制效應可能是由于染料的分解產(chǎn)物所致。目前，SYBRGreen I已被廣泛應 用于病原的檢測。但是，利用該染料所做的熔解曲線(Tm)可受到染料和DNA濃度的影響。 例如，3倍濃度的起始DNA的差異，就可能引起1度的Tm值的變化。SYBR Green I的另一 個缺點是在多重PCR中應用有限。研究發(fā)現(xiàn)，進行雙重PCR擴增時，熔解曲線只能檢測到一 個產(chǎn)物，而電泳分析可以明顯觀察到兩個產(chǎn)物。這個可能與擴增DNA和染料的相對濃度有 關。盡管SYBR Green I的應用范圍較廣，但是存在染料可用濃度范圍小、序列結合偏性大 等缺點。 SYTO家族的染料是一種比較常見的DNA結合染料，它具有很多特性，包括膜通透 性、低細胞毒性、結合DNA后熒光增強等，這些特性使得它們適合于標記活細胞。但是它們 對雙鏈與單鏈DNA的特異性結合能力不清，或者說它們作為定量PCR的染料是否合適仍不清楚。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種對PCR反應的抑制效應小、可用濃度范圍大、序列結合偏性小、敏感性高的新型DNA結合染料，并建立了基于該染料的實時熒光定量PCR檢測方法。
為解決上述技術問題，本發(fā)明采取以下技術方案一種基于新型DNA結合染料的實時熒光定量PCR檢測方法，是以SYTO為熒光染料進行的實時熒光定量PCR檢測方法。
所述SYTO熒光染料優(yōu)選為SYT082 。
所述SYTO熒光染料的濃度優(yōu)選為2 ii M。 所述PCR反應體系優(yōu)選為10XPCR緩沖液2. 5iU， dNTP(2. 5mM)2ii1，MgCl2(25mM)2iil，上游引物(lOyM) :0. 5iU，下游引物(10iiM) :0. 5iU， rTaq酶(5U/ii 1) :0. 125 ii 1，模板DNA :1 ill (含1. OX 101 109拷貝)，染料1 y 1，加水補齊至終體積25ii 1。所述實時熒光定量PCRPCR反應條件優(yōu)選為預變性94°C 3min ;擴增95°C 30s，
52°C 30s，72。C 30s，共40個循環(huán)；72。C lOmin。 所述實時熒光定量PCR檢測方法可包括以下步驟 1)將SYTO為熒光染料加入上述PCR反應體系中； 2)按上述反應條件進行PCR反應。 本發(fā)明的第二個目的是提供一種實時熒光定量PCR檢測試劑盒。
本發(fā)明所提供實時熒光定量PCR檢測試劑盒，包括10XPCR緩沖液2. 5iU、dNTP(2. 5mM)2ii 1、 MgCl2 (25mM) 2 ii 1、 rTaq酶(5U/ii 1)0. 125 ii 1和熒光染料，所述熒光染料為SYTO熒光染料。 所述SYTO熒光染料優(yōu)選為SYT082 。
所述SYTO熒光染料的濃度優(yōu)選為2 ii M。 本發(fā)明提供了一種基于新型DNA結合染料的實時熒光定量PCR檢測方法。以SYT082為例，探討了 SYTO染料結合DNA的特性及其在定量PCR中應用的可行性。結果顯示，SYTO家族的染料比SYBR Green I更適用于熒光染料實時定量PCR反應，染料可以在一個很寬的濃度范圍內(nèi)使用，DNA熔解曲線不受DNA濃度影響。這是因為l)SYTO染料的PCR抑制效應小。2)比較不同濃度的染料對熔解曲線的影響，結果SG染料只有3個濃度下的擴增產(chǎn)物有熔解曲線，而SYTO染料除了一個最低的濃度外，其余都能分析出熔解曲線。Tm值是分析擴增產(chǎn)物特異性的一個關鍵步驟，SG的結果顯示，在不同染料濃度下，產(chǎn)物的Tm值有1度的差別，而SYTO染料則保持不變，說明不同濃度的SYTO染料對Tm值沒有影響。另外，SG熔解曲線的寬度較SYTO的寬，說明SYTO結合到DNA隨溫度變化明顯，特別是在產(chǎn)物解鏈的過程中，染料可迅速從雙鏈中解離下來。3)選擇SG染料的濃度為0. 25 ii M， SYTO染料的濃度為2uM，在該條件下擴增系列稀釋模板，PCR結果顯示，隨著模板量的減少，擴增產(chǎn)物也減少，對應的熒光值也降低，表明SYTO的熒光值能夠反映產(chǎn)物量的變化。從結果中我們觀察到，在產(chǎn)物量的變化相同的情況下，SYTO熒光值的變化較SG大，這可能是因為SYTO結合DNA后熒光強度本身就要強一些，因此，相同的DNA變化程度將會導致產(chǎn)生更大的熒光值變化。從這一點可以推測，SYTO能夠更為準確的對起始模板進行定量。4)線性范圍是衡量定量PCR方法的一個指標。通過對系列稀釋的模板進行PCR擴增，結合擴增曲線和Ct值
4的變化，確定了 SG和SYTO的線性定量范圍，結果顯示，它們具有相同的定量范圍，即103 108拷貝，這與報道的其它熒光染料定量PCR的線性范圍一致。5)利用染料法定量PCR進行多重PCR擴增，需要通過最后的熔解曲線來鑒別多重PCR擴增的效果。結果顯示通過熔解曲線的分析可以區(qū)分多個PCR擴增產(chǎn)物，雖然SYTO染料也存在一定的偏性，但是這種偏性遠遠小于SG。據(jù)此推測，利用SYTO染料進行多重PCR將具有較好的效果。上述實驗結果表明本發(fā)明的實時熒光定量PCR檢測方法明顯優(yōu)于現(xiàn)有的實時熒光定量PCR檢測方法，具有對PCR反應的抑制效應小、可用濃度范圍大、序列結合偏性小、敏感性高等優(yōu)點，適合大面積推廣和應用。 下面結合具體實施例對本發(fā)明做進一步詳細說明。


圖1為染料濃度對實時熒光定量PCR反應的抑制效應的檢測結果 圖2為不同染料濃度下實時熒光定量PCR擴增產(chǎn)物的電泳圖 圖3為不同染料濃度擴增下的實時熒光定量PCR產(chǎn)物的熔解曲線 圖4為不同染料濃度擴增下的實時熒光定量PCR產(chǎn)物的熒光強度變化 圖5為不同DNA濃度對染料影響的檢測結果 圖6為低模板濃度時熒光值隨模板DNA量的變化 圖7為SG和S82的多重PCR擴增檢測結果 圖8為SG和S82的單重和多重PCR擴增產(chǎn)物的電泳圖
具體實施例方式
下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。 實施例1、 SYTO染料結合DNA的特性及其在實時熒光定量PCR中應用的可行性檢 以SYT082(S82)染料為例，檢測SYTO染料結合DNA的特性及其在實時熒光定量PCR中應用的可行性，以熒光染料SYBR Green I (SG)為對照，具體實驗方法如下
—、實時熒光定量PCR擴增
1、引物與質(zhì)粒 針對甲型H1N1流感特有的序列，人工合成一段序列(序列表中序列l(wèi))。根據(jù)該序列設計實時熒光定量PCR擴增的引物，引物序列如下
上游引物CCCAAAGTGAGGGATCAAGA
下游引物CCAGCATTTCTTTCCATTGC 。 將PCR擴增產(chǎn)物克隆到載體pMD-18T (購自TaKaRa)上，作為陽性質(zhì)粒。
2、實時熒光定量PCR擴增 目的基因的熒光定量PCR擴增采用Bio-Rad IQ5熒光定量PCR儀。熒光染料分別采用SYBR Green I和SYT082 (均購自Invitrogen公司)。PCR反應體系(25 ii 1) : 10 X PCR緩沖液2. 5iU， dNTP(2. 5mM)2ii1， MgCl2 (25mM) 2 yl，上游引物(10iiM) :0. 5iU，下游引物(10iiM) :0. 5ii l，rTaq酶(5U/ii l，TAKARA) :0. 125 ii l，模板DNA(陽性質(zhì)粒)ly l(含1. 0 X 101 109拷貝)，染料1 ii 1 (終濃度為20、 10、5、 1、0. 5、0. 25、0. 1、0. 05 ii M)，加水補齊至終體積25iU。反應條件預變性94。C 3min;擴增95。C 30s，52。C 30s，72。C 30s，共40個循環(huán)；72。C 10min。溶解曲線95。C lmin，55。C lmin，55。C 20s (溫度變化速率為0. 5°C /s)。 二、染料濃度對實時熒光定量PCR反應的抑制效應 染料濃度對實時熒光定量PCR反應的抑制效應的檢測結果如圖1所示(A :SG， B :S82) ， SYBR Green I (SG)染料對PCR反應具有很強的抑制效應，因此其可用濃度范圍很小。為了分析SG和SYT082(S82)對PCR反應的影B向，在反應體系中加入了不同濃度(0.05到20iiM)的染料，觀察其對PCR結果的影響。從結果可以看出，SG只有在濃度為0.05、0. 1、0. 25 ii M時才有擴增曲線，而S82在所有濃度下均顯示了較好的擴增曲線。從擴增曲線可以看出，兩種熒光染料均呈現(xiàn)隨染料濃度增加熒光值增加的趨勢。在相同染料濃度下，S82的熒光值大約是SG的6倍，遠遠高于SG。為進一步確定染料濃度對PCR反應的抑制效應，將PCR產(chǎn)物進行2X瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結果如圖2所示(A :SG，B :S82，M :DNA marker,1-8 :20、10、5、1、0. 5、0. 25、0. 1、0. 05 y M)，從電泳圖可以看出，S82在所有濃度下均有擴增產(chǎn)物，而SG只有能觀察到擴增曲線(圖l)的那三個濃度才有擴增產(chǎn)物。電泳結果顯示，這些染料濃度下的PCR擴增產(chǎn)物的量幾乎沒有差異。上述檢測結果表明SYTO染料對PCR反應基本上沒有抑制作用，SYTO家族的染料比SYBR Green I更適用于熒光染料實時定量PCR反應。 四、不同染料濃度對熔解曲線的影響 對不同染料濃度擴增下的PCR產(chǎn)物做熔解曲線，結果如圖3所示(A， B:SG;C， D:S82)，從圖3中可以看出，SG染料只有在最低的3個濃度下的擴增產(chǎn)物才能觀察到熔解曲線，與擴增產(chǎn)物的結果一致(圖3A和圖3B)。相反，對于S82染料來說，除最低一個濃度外，所有濃度下都可觀察到熔解曲線(圖3C和圖3D)。從熔解曲線上可以看出，SG在3個能夠擴增的濃度下的Tm值分別為81. 5和82. 5， S82在大部分濃度下的Tm值為82. 0，只有最高濃度(20 ii M)時的Tm值發(fā)生了偏移，為82. 5。由于SG的使用濃度低于S82，因此說明S82對產(chǎn)物Tm值的影響更小。從熔解曲線的寬度看，S82的溫度跨度為80 84，而SG的溫度跨度為79. 5 85. 0 (表1)。從溫度變化與熒光值的變化相關性看，S82隨溫度變化的強度遠遠高于SG(圖4)。上述檢測結果進一步證明SYTO家族的染料比SYBR Green I更適用于熒光染料實時定量PCR反應。 表1SG和S82不同濃度下熔解曲線的特性
6嫁度 Tm值 峰値 起始溫度 結束溫度 溫度跨度
(|iM)rc)rc)rc)rc)
S82-202082,54516,679,584.55.0
S82-101082.04293.776.084.08,0
S82-5582,02914.078,0歸6,0
S82-2282.01TO9.478.083.55,5
S 82-0,50,582.02肌478,584.05,5
S82-0.250,2582.0183.179,583.54.0
S82-0.10,182.047.979.583.54,0
S82-0,050,0582,010.981 ，583.01.5
SG-202062.046,755,063,08,0
SG-101059.078,056,079,523.5
SG-5556.5固56.080,024,0
SG-2255,562.455.076,521,5
SG-0.50.555.525 355,072.017,0
SG-0.250.2582.0220,479.085,56.5
SG-0,10,1§1.5126,179,585.56.0
SG-()-050.0581.561,779,084.05.0 五、檢測不同DNA濃度對染料的影響 為了分析DNA濃度對染料的影B向，選取兩種染料各自的最佳濃度。根據(jù)上面的 分析可以看出，SG在濃度為0. 25iiM時，擴增效率高，熒光信號強，因此，SG的最佳濃度為 0. 25iiM。 S82在所有濃度下均有較高的擴增效率，其熒光強度隨染料濃度增加。但是，在染 料濃度為2 ii M時，其熒光值從0. 5 ii M時的280. 4提高到1709. 4，是0. 5 y M時的6倍，盡管 繼續(xù)增加染料濃度熒光值還會增加，但考慮到染料的強度和濃度，2 M是一個較為合適的 濃度。然后，將模板系列稀釋(稀釋度依次為101 108拷貝)后分別以SG和S82最佳染 料濃度進行擴增，比較擴增效果的差異，反應體系和反應條件不變。 不同DNA濃度對染料影響的檢測結果如圖5所示(A， C， E :SG ;B， D， F :S82)，從圖 5中可以看出，SG和S82均能對系列稀釋模板進行擴增。從整體上看，隨著模板濃度的增 加，Ct值降低。熔解曲線分析結果顯示，兩個染料均顯示了單一的熔解曲線，表明擴增都是 特異的(圖5A和D)。將熔解曲線進行放大，結果顯示，SG的峰的寬度較S82大，并且不同 濃度模板擴增得到的峰型差異較大，而S82的除了最高的模板濃度發(fā)生了峰型的偏移外， 其它的都相對較整齊(B和E)。從擴增的熒光值可以看出(C和F)，相同濃度的模板在兩種 染料擴增時，Ct值相差不大，但是隨著擴增的進行，SG(C)的熒光值很快就達到了平臺，而 S82(F)則一直呈上升趨勢，沒有達到飽和，表明S82能夠結合的DNA濃度范圍更大。有趣的 是，如圖6所示(A:SG;B:S82)， SG在模板濃度較低時，沒有出現(xiàn)熒光值隨DNA量的增加而增加的趨勢，特別是在低濃度時，雖然也有一定的熒光值，但是基本沒有變化，相反，S82則
隨模板濃度的變化在變化。 六、線性擴增范圍 線性擴增范圍是定量PCR實用性的一個重要指標，是指能夠檢測到標本中病原的 濃度范圍。檢測方法為將模板進行系列稀釋后進行實時熒光定量PCR擴增，通過分析擴增 曲線和熔解曲線，決定SG和S82的線性范圍。線性擴增范圍的選取為，曲線呈現(xiàn)指數(shù)擴增， 并且具有隨著模板濃度降低，Ct值增大的趨勢。實驗結果顯示，SG和S82具有相同的線性 擴增范圍，均為6個數(shù)量級，即103 108拷貝，在這個線性范圍內(nèi)能夠對模板DNA進行準確 定量。低于上述線性范圍，則需要通過熔解曲線來觀察是否有擴增產(chǎn)物，判定標準為，擴增 產(chǎn)物的熔解曲線峰值高于二聚體的峰值。根據(jù)這個原則，這兩種染料擴增的敏感性均能達 到1 10個拷貝。
七、多重PCR擴增 有資料顯示，用SG染料進行多重PCR擴增，在進行熔解曲線分析時容易引起染料 的再結合。為了分析S82在多重擴增方面的表現(xiàn)，分別用SG和S82進行雙重PCR擴增并結 合溶解曲線和凝膠電泳分析其擴增差異。單重PCR反應時，分別以A型流感(FluA，序列表 中序列2，擴增引物序列為FluA的上游引物ATGGAGTGGCTAAAGACAAGAC，F(xiàn)luA的下游引物 AATGCTGATTCGGTGGTCAC)和B型流感(FluB，序列表中序列3，擴增引物序列為FluB的上游 引物TGATACCTAGTGCGGCTACTC， FluB的下游引物TCAATGAAGAAGGAACGGCATC)為模板進行 擴增。反應體系為:10XPCR緩沖液2. 5ii 1， dNTP(2. 5mM) 2 y 1， MgCl2 (25mM) 2 y l，上游引 物(lOiiM)O. 5ii l，下游引物(lOiiM)O. 5ii 1， rTaq酶(5U/ii 1)0. 125 ii 1，模板DNA(20ng/ y l)liil，染料(2iiM)liil，加水補齊至終體積25ii1。反應條件為94。C 3min ;95。C 30s， 52。C 30s，72。C 30s，共40個循環(huán)；72。C 10min。雙重PCR反應時，以FluA和FluB的混 合物為模板，反應體系為:10XPCR緩沖液2. 5iU， dNTP(2. 5mM)2ii1， MgCl2 (25mM) 2 yl， FluA的上游引物(lOiiM)l. 25iU， FluA的下游引物(lOiiM)l. 25iU， FluB的上游引 物(10iiM)0. 5iU， FluB的下游引物(10iiM)0. 5iU， rTaq酶(5U/iU)0. 125 iU，模板 DNA(20ng/iU)A和B各liil，染料(2 y M) 1 iU，加水補齊至終體積25 yl。反應條件不變。 結果如圖7(A，C，E :SG ;B，D，F(xiàn) :S82)和圖8(1， Marker ;2，3為SG單重PCR ;4， SG多重PCR ; 5， 6為S82單重PCR ;7， S82多重PCR)所示，從圖7中可以看出，單重擴增時兩個產(chǎn)物的熔解 曲線均較好，能夠觀察到兩個產(chǎn)物的Tm值差異，形成兩個獨立的峰，且峰值相近(A和B)。但 是，當在同一個反應體系中擴增兩個產(chǎn)物時，則出現(xiàn)了熔解曲線的差異。用SG作為染料時， 雖然也形成兩個峰，但是溫度低的峰顯著低于溫度高的峰(C);相反，以S82作為染料時，熔 解曲線形成兩個獨立的峰圖，兩個峰雖然有差異，但這種差異遠小于SG組，說明S82也存在 一定的偏性，但其偏性遠小于SG組。 在上述實施例中，分析了一類新型的熒光染料SYTO應用于實時定量PCR的可行 性，并與傳統(tǒng)的熒光染料SYBR Green I進行了比較。以SYT082為例，通過熒光染料對PCR 反應的抑制效應，染料濃度對熔解曲線的影響等的分析得出結論，SYTO家族的染料比SYBR Green I更適用于熒光染料實時定量PCR反應。 SG染料的一個嚴重缺點是可使用的濃度范圍低，因此，在利用該染料建立定量 PCR方法時，往往需要對染料的濃度進行摸索和優(yōu)化。此外，由于該染料穩(wěn)定性的原因，使用中往往因為染料分解而導致檢測信號的變化，從而影響定量PCR的定量特性。因此，在本 研究中，首先分析了 SYT0染料對PCR反應的抑制效應。將反應中染料的濃度調(diào)整為0. 05 到20uM的范圍，濃度相差了 400倍，結果顯示，這些不同濃度的染料加入到反應體系中，并 沒有抑制PCR反應。電泳結果顯示，這些染料濃度下的PCR擴增產(chǎn)物的量幾乎沒有差異，表 明SYTO染料對PCR基本上沒有抑制作用。SYTO的PCR抑制效應小，對于該染料用于定量 PCR方法的建立具有一個很大的優(yōu)勢，即不需要花時間摸索染料的使用濃度，只需要選擇其 中一個合適的濃度即可。相對于SG來說，SYTO的另一個優(yōu)點是，相同濃度下SYTO結合DNA 后的熒光值較SG高，這種結合DNA后熒光值增強是染料是否適合于定量PCR分析的一個要 求。 然后，本發(fā)明比較了不同濃度的染料對熔解曲線的影B向，SG染料只有3個濃度下 的擴增產(chǎn)物有熔解曲線，而SYTO染料除了一個最低的濃度外，其余都能分析出熔解曲線。 Tm值是分析擴增產(chǎn)物特異性的一個關鍵步驟，SG的結果顯示，在不同染料濃度下，產(chǎn)物的 Tm值有1度的差別，而SYTO染料則保持不變，說明不同濃度的SYTO染料對Tm值沒有影響。 另外，SG熔解曲線的寬度較SYTO的寬，說明SYTO結合到DNA隨溫度變化明顯，特別是在產(chǎn) 物解鏈的過程中，染料可迅速從雙鏈中解離下來。這種雙鏈DNA結合的特性，有利于熔解曲 線的分析，以及多重擴增時不同產(chǎn)物的解析，這在后面的多重PCR分析中也得到了證實。
要對產(chǎn)物進行定量，所用的染料必須要隨產(chǎn)物的量的增加熒光強度也增加。為了 比較分析SYTO染料這種特性，選擇了 SG染料的濃度為0. 25uM，SYT0染料的濃度為2uM，在 該條件下擴增系列稀釋模板，PCR結果顯示，隨著模板量的減少，擴增產(chǎn)物也減少，對應的熒 光值也降低，表明SYTO的熒光值能夠反映產(chǎn)物量的變化。從結果中我們觀察到，在產(chǎn)物量 的變化相同的情況下，SYTO熒光值的變化較SG大，這可能是因為SYTO結合DNA后熒光強 度本身就要強一些，因此，相同的DNA變化程度將會導致產(chǎn)生更大的熒光值變化。從這一點 可以推測，SYTO能夠更為準確的對起始模板進行定量。 線性范圍是衡量定量PCR方法的一個指標。通過對系列稀釋的模板進行PCR擴增， 結合擴增曲線和Ct值的變化，確定了SG和SYTO的線性定量范圍，結果顯示，它們具有相同 的定量范圍，即103 108拷貝，這與報道的其它熒光染料定量PCR的線性范圍一致。
利用染料法定量PCR進行多重PCR擴增，需要通過最后的熔解曲線來鑒別多重PCR 擴增的效果。過去的研究發(fā)現(xiàn)，以SG作為染料進行多重PCR反應，在做熔解曲線時會發(fā)生染 料結合偏移的情況，即染料從Tm值低的產(chǎn)物上解離下來之后，會再結合到Tm值高的產(chǎn)物， 導致Tm值高的產(chǎn)物的峰值很高，而Tm值低的很低，這樣，就無法準確得知兩個產(chǎn)物的量的 多少，甚至是有和無的判斷。從本實施例的比較結果看，SYTO染料也存在一定的偏性，但是 這種偏性遠遠小于SG。據(jù)此推測，利用SYTO染料進行多重PCR將具有較好的效果。
實施例2、實時熒光定量PCR檢測試劑盒的制備 將10 X PCR緩沖液2. 5 ii 1 、 dNTP (2. 5mM) 2 ii 1 、 MgCl2 (25mM) 2 ii 1 、 rTaq酶(5U/ iil)O. 125iU、SYT082染料(2 y M) 1 共同包裝，得到實時熒光定量PCR檢測試劑盒。使
用時用戶根據(jù)實驗需要加入引物及模板即可。
序列表
〈160>3
〈210>1
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一種基于新型DNA結合染料的實時熒光定量PCR檢測方法，是以SYTO為熒光染料進行的實時熒光定量PCR檢測方法。
2. 根據(jù)權利要求1所述的PCR檢測方法，其特征在于所述SYTO熒光染料為SYT082。
3. 根據(jù)權利要求1所述的PCR檢測方法，其特征在于所述SYTO熒光染料的濃度為 2iiM。
4. 根據(jù)權利要求1所述的PCR檢測方法，其特征在于所述PCR反應體系為IOXPCR 緩沖液2. 5iU， dNTP(2. 5mM)2ii1， MgCl2 (25mM) 2 yl，上游引物(10 y M) 0. 5 yl，下游引物 (10iiM)0. 5ii l，rTaq酶(5U/ii 1)0. 125 ii l，模板DNA(含1. 0X101 109拷貝)1 ii l，染料 1 iil ，加水補齊至終體積25 iil 。
5. 根據(jù)權利要求1至4任一項所述的PCR檢測方法，其特征在于所述PCR反應條件 為預變性94。C 3min ;擴增95°C 30s，52。C 30s，72。C 30s，共40個循環(huán)；72。C 10min。
6. 根據(jù)權利要求4或5所述的PCR檢測方法，其特征在于所述檢測方法包括以下步驟1) 將SYTO為熒光染料加入權利要求4所述的PCR反應體系中；2) 按權利要求5所述的反應條件進行PCR反應。
7. —種實時熒光定量PCR檢測試劑盒，包括10XPCR緩沖液2. 5iU、 dNTP(2. 5mM)2ii 1、 MgCl2 (25mM) 2 ii 1、rTaq酶(5U/ii 1)0. 125 ii 1和熒光染料，其特征在于， 所述熒光染料為SYTO熒光染料。
8. 根據(jù)權利要求7所述的試劑盒，其特征在于所述SYTO熒光染料為SYT082。
9. 根據(jù)權利要求7或8所述的試劑盒，其特征在于所述SYT0熒光染料的濃度為2iiM。
10. SYTO熒光染料作為實時熒光定量PCR檢測熒光染料的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于新型DNA結合染料的實時熒光定量PCR檢測方法及其應用。該方法是以SYTO為熒光染料進行的實時熒光定量PCR檢測方法。實驗結果顯示，SYTO家族的染料比SYBR Green I更適用于熒光染料實時定量PCR反應，染料可以在一個很寬的濃度范圍內(nèi)使用，DNA熔解曲線不受DNA濃度影響。表明本發(fā)明的實時熒光定量PCR檢測方法明顯優(yōu)于現(xiàn)有的實時熒光定量PCR檢測方法，具有對PCR反應的抑制效應小、可用濃度范圍大、序列結合偏性小、敏感性高等優(yōu)點，適合大面積推廣和應用。
文檔編號C12Q1/68GK101696451SQ20091023649
公開日2010年4月21日 申請日期2009年10月23日 優(yōu)先權日2009年10月23日
發(fā)明者孫巖松, 徐杰, 杜昕穎, 汪舟佳, 王玉飛, 鐘志軍, 陳澤良, 黃留玉 申請人:中國人民解放軍疾病預防控制所;