專利名稱：檢測蘋果邊腐病菌的引物和探針及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物檢測技術(shù)，具體地說涉及蘋果邊腐病菌檢測用引物和探針及其檢測方法。
背景技術(shù)：
蘋果邊腐病菌(尸/n'a/op/7orama/oram)是蘋果和梨上的一種重要的病害，該病菌曾對美國西北部儲藏期的蘋果和梨引致嚴(yán)重的損失，經(jīng)濟(jì)影響很大。目前病菌分布在美國、英國、加拿大、荷蘭、意大利等，中國無分布，為我國新頒布的檢疫性有害生物。戶w"/omm的寄主植物主要有蘋果、梨和蘆筍，對蘋果和梨的侵害主要發(fā)生在儲藏期，引起果實(shí)腐爛，在荷蘭還有侵染蘆筍的記載。病菌通過罹病果實(shí)、苗木和土壤進(jìn)行傳播擴(kuò)散， 一旦傳入我國，將會對我囯水果產(chǎn)業(yè)帶來嚴(yán)重威脅。
本發(fā)明應(yīng)用實(shí)時熒光PCR對蘋果邊腐病菌的分子檢測方法進(jìn)行研究，通過ITS序列設(shè)計一條熒光標(biāo)記探針和一對引物，建立了對蘋果邊腐病菌穩(wěn)定、高效的檢測方法，可根據(jù)擴(kuò)增曲線判定是否有蘋果邊腐病菌。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種蘋果邊腐病菌檢測用引物及一種蘋果
邊腐病菌檢測用探針。
本發(fā)明另一目的在于提供一種蘋果邊腐病菌的檢測方法。根據(jù)發(fā)明目的，本發(fā)明提供一種蘋果邊腐病菌檢測用引物，其核
苷酸序列為
PMA-P1 : 5'-ATAACCACTCAAGCTCTCG畫3'PMA匿P2 : 5，-GTTGCTGGCAAGTAGACTAC陽3,。本發(fā)明還提供一種含有前述引物的試劑盒。
本發(fā)明還提供 一種與前述引物配合使用的探針，其核苷酸序列
為5 ， -FAM-TTCGCGGTTCCGCAGGCC-TAMRA-3 ，，該探針 一 端標(biāo)
記有報告熒光染料，另一端釆用了熒光性的淬滅基團(tuán)。
前述的探針，其5，端標(biāo)記有FAM熒光染料，3'端釆用了熒光性的淬滅基團(tuán)TAMRA?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明給出的引物對或者其擴(kuò)增產(chǎn)物序列設(shè)計其他類型的探針，以適用不同方法的熒光PCR檢測。本發(fā)明還提供一種含有前述引物及探針的試劑盒。本發(fā)明另外提供 一種檢測蘋果邊腐病菌的方法，其是以樣品總DNA為模板，利用前述的引物及探針進(jìn)行實(shí)時熒光PCR擴(kuò)增，每個循環(huán)結(jié)束釆集數(shù)據(jù)，反應(yīng)結(jié)東后根據(jù)擴(kuò)增曲線判定結(jié)果。
前述的方法，其中實(shí)時熒光PCR的反應(yīng)過程中的退火和延伸溫度為56°C。
本發(fā)明通過分析已報道蘋果邊腐病菌ITS序列的基礎(chǔ)上，分別設(shè)計引物和熒光探針。根據(jù)P wa/owm的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)設(shè)計特異引物和TaqMan探針，能夠快速、準(zhǔn)確地對P wa/on/w進(jìn)行定性檢測，同時也可檢測感染了 P ma/on/m的蘋果和梨。目前國內(nèi)外對于尸m"/owm的識別僅限于形態(tài)上，未見分子檢測方法的研究。
普通Taqman探針技術(shù)，即將報告熒光染料標(biāo)記在探針的5'端，而3，端釆用了熒光性的淬滅基因，當(dāng)探針完整的時候，報告基團(tuán)所發(fā)射的熒光能量被淬滅基因吸收，儀器檢測不到信號。隨著PCR的進(jìn)行，由于Taq酶具有5，端到3，端的外切酶活性，在擴(kuò)增延伸階段將與模板結(jié)合的探針切斷，淬滅基團(tuán)的抑制作用消失，報告熒光染料產(chǎn)生熒光信號，從而實(shí)現(xiàn)對蘋果邊腐病菌的檢測。
實(shí)時熒光PCR的25jiL反應(yīng)體系樣品DNA l|iiL (0.005-0.5ng),10X PCR buffer( Mg2+ free ) 2.5|iL, 25mM MgCL2 2pL， 2.5mM dNTPs2pL, lO(iM引物PMA-P1 lpL， 10pM引物PMA-P2 lpL， lOpM探
4針l單,5U/(iLTaqDNA聚合酶0,3nL, ddH20 12.7pL。
反應(yīng)條件第一個循環(huán)為95。C 10min;隨后40個循環(huán)，95。C 15s、56 °C 1 min。
本發(fā)明根據(jù)蘋果邊腐病菌ITS序列設(shè)計的引物及探針，該探針特異性好，用于熒光PCR檢測靈敏性高。此外，本發(fā)明建立了適合口岸應(yīng)用的簡便的檢測方法，即直接從進(jìn)境的水果果實(shí)上檢測邊腐病菌，操作快捷、結(jié)果準(zhǔn)確，避免了用傳統(tǒng)的分離和培養(yǎng)病菌方法所產(chǎn)生的耗費(fèi)時間和易疏漏的缺陷，順應(yīng)了當(dāng)今檢驗(yàn)檢疫工作的特點(diǎn)，為進(jìn)出口安全提供了保證。


圖1是本發(fā)明實(shí)施例4釆用實(shí)時熒光PCR檢測蘋果邊腐病菌的結(jié)果示意圖，1:尸.ma/onmr， 2:感染尸.ma/oram的鴨梨；3:感染卩應(yīng)/o謂的紅富士蘋果；4: ddH20; 5:空白對照；6: c/鮮ea;7: 戶ew/c/〃/wm expawsMw; 8: A/wcor/ /nybrm^; 9: ex/ a"SM/w; 10:ex戸;w訓(xùn)；11: j/te/77鎖'a a/妙"ato; 12: A /一ctor/a; 13: v4.te"M&w.ma; 14: /! expaMsw柳；15: B. c/werea; 16: C7a^icw/ on'wm sp.;17: 及"'"er關(guān) 18: ex/ (m 謂；19: J5o"o5p/zam'a 6erewgen'a"a;20: ^/zaera/w^pjT^i^mscera; 21:紅啤梨(RED D'ANJOU Pear);22:蛇果(Red delicious apple ); 23:鴨梨(YaPear); 24:紅富士蘋果(Fuji apple )。
具體實(shí)施例方式
以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例l引物及探針的設(shè)計和合成
根據(jù)蘋果邊腐病菌ITS序列，利用軟件DNAMAN 6.0和PrimerExpress 3.0設(shè)計引物及探針，引物序列為
PMA-P1 (正向)5，-ATAACCACTCAAGCTCTCG-3，
PMA-P2 (反向)5，-GTTGCTGGCAAGTAGACTAC-3所述探針的序列為5，-FAM-TTCGCGGTTCCGCAGGCC-TAMRA-3',該探針的5，端用報告熒光染料標(biāo)記，3'端釆用熒光性的淬滅基團(tuán)。
實(shí)施例2總DNA的提取
1) 采集適量真菌菌絲體或染病果實(shí)，用液氮研成粉末，取0.4g裝入1.5mL離心管中。
2) 預(yù)熱CTAB提取液到65°C，力口 600pL到裝有粉末的1.5mL離心管中，混勻。
3) 立即置于65。C水浴lh,后加入(500pL)氯仿/異戊醇(24:l)，上下顛倒數(shù)次，13200g離心IO分鐘。
4) 吸取上清液約400pL于一新2.0ml離心管，加入(500pL )氯仿/異戊醇(24:l)， 500pLCTAB提取液，輕輕混勻，13200g離心10分鐘。
5) 取800pL上清于一新1.5mL離心管，加入500pL異丙醇，輕輕混勻，室溫放置20min。
6) 13200g離心20min,去上清，用70%乙醇洗沉淀，室溫干燥。7 )加入50^iL 1 xTE Buffer (10mM Tris-HCl ; lmM EDTA;含
20昭Rnase; PH=8.0 ),置于4 "C過夜，待DNA溶解后，檢測DNA濃度及質(zhì)量。
實(shí)施例3實(shí)時PCR擴(kuò)增方法的建立
1、 實(shí)時熒光PCR反應(yīng)體系
以總DNA為模板，進(jìn)行實(shí)時熒光PCR反應(yīng)，25pL反應(yīng)體系中有樣品DNA lpL (0.005-0.5ng), 10X PCR buffer ( Mg2+ free ) 2.5jiL,25mM MgCL22^L， 2.5mM dNTPs 2pL， lO)iM引物PMA-P1 l|iL,10pM引物PMA-P2 l^L, 10pM探針1.5pL, 5U小L 丁aq DNA聚合酶0.3^L， ddH20 12.7pL。
2、 實(shí)時熒光PCR反應(yīng)條件
6將樣品管放入ABI PRISM 7700熒光PCR儀后，設(shè)置如下條件進(jìn)行反應(yīng)第一個循環(huán)為95。C 10min;隨后40個循環(huán)，95°C 15s、 56°C 60s。每個循環(huán)結(jié)束后釆集數(shù)據(jù)。反應(yīng)結(jié)東后根據(jù)擴(kuò)增曲線判定結(jié)果。
實(shí)施例4蘋果邊腐病菌實(shí)時PCR方法的特異性確定
以純培養(yǎng)的蘋果邊腐病菌、感染蘋果邊腐病菌的蘋果和梨、蘋果和梨上常見的病原真菌總DNA為模板，以健康的蘋果和梨果實(shí)為對照，通過實(shí)時熒光PCR檢測熒光強(qiáng)度變化。
試驗(yàn)結(jié)果
純培養(yǎng)的蘋果邊腐病菌、感染蘋果邊腐病菌的蘋果和梨的擴(kuò)增產(chǎn)物均出現(xiàn)強(qiáng)熒光信號(ARn)增加，表現(xiàn)為陽性擴(kuò)增，而蘋果或梨上其他常見真菌和健康的蘋果和沒有熒光信號增加表現(xiàn)為陰性，結(jié)果如圖l所示。序 歹IJ 表
<110>中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院
<120>檢測蘋果邊腐病菌的引物和探針及其檢測方法
<130> KHP09113179.1
<160〉 3
<170> Patentln version 3.3
<210> 1
<211〉 21
<212> DNA
<213〉 人工序列
<400> 1
at犯ccsctcaagctctcg
<210> 2<211> 24<212> DNA<213> 人工序列<400〉 2
gttgctggcaagtagactac
<210> 3<211> 23<212〉 DNA<213〉 人工序列<400> 3ttcgcggttccgcaggcc
權(quán)利要求
1、一種蘋果邊腐病菌檢測用引物，其特征在于其核苷酸序列為PMA-P15’-ATAACCACTCAAGCTCTCG-3’PMA-P25’-GTTGCTGGCAAGTAGACTAC-3’。
2、 含有權(quán)利要求1所述引物的試劑盒。
3、 一種與權(quán)利要求1所述引物配合使用的探針，其特征在于其核苷酸序列為5 ，-FAM-TTCGCGGTTCCGCAGGCC-TAMRA-3',該探針一端標(biāo)記有報告熒光染料，另一端釆用了熒光性的淬滅基團(tuán)。
4、 如權(quán)利要求3所述的探針，其特征在于，該探針5，端標(biāo)記有FAM熒光染料，3'端采用了熒光性的淬滅基團(tuán)TAMRA。
5、 含有權(quán)利要求2所述引物以及權(quán)利要求3或4所述探針的試劑盒。
6、 一種檢測蘋果邊腐病菌的方法，其特征在于，以樣品總DNA為模板，利用權(quán)利要求1所述的引物以及權(quán)利要求3或4所述的探針進(jìn)行實(shí)時熒光PCR擴(kuò)增，每個循環(huán)結(jié)束釆集數(shù)據(jù)，反應(yīng)結(jié)東后根據(jù)擴(kuò)增曲線判定結(jié)果。
7、 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，實(shí)時熒光PCR的反應(yīng)過程中的退火溫度為56匸。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種蘋果邊腐病菌檢測用引物及探針，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1&2所示，所述探針的核苷酸序列如SEQ IDNo.3所示。本發(fā)明還進(jìn)一步提供了檢測蘋果邊腐病菌的方法，該方法以樣品總DNA為模板，利用上述引物和探針進(jìn)行實(shí)時熒光PCR擴(kuò)增，每個循環(huán)結(jié)束采集數(shù)據(jù)，反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)擴(kuò)增曲線判定結(jié)果。本發(fā)明探針特異性好，檢測方法快速簡單，準(zhǔn)確性高，靈敏度高，為進(jìn)出口安全提供了保證。
文檔編號C12R1/645GK101671741SQ20091023611
公開日2010年3月17日 申請日期2009年10月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月20日
發(fā)明者吳品珊, 杜洪忠 申請人:中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院