專利名稱：一種通過(guò)agt基因拷貝數(shù)預(yù)測(cè)高原肺水腫發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測(cè)用的試劑盒，具體涉及一種通過(guò)AGT基因拷貝數(shù)預(yù)測(cè)高原 肺水腫發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒，用于評(píng)定人體高原肺水腫的易感性。
背景技術(shù)：
高原肺水腫(high altitude pulmonary edema,縮寫HAPE)是一種特發(fā)于高 原低氧環(huán)境的肺水腫，起病急，先艮快，危害大，如果救治不及時(shí)，可在較短 的時(shí)間內(nèi)發(fā)展至呼吸衰竭，甚至死亡，是嚴(yán)重威脅i^v高原人群健康和生命的 急性重癥高原病。近年的調(diào)查表明，在從平原進(jìn)入海拔3000米以上高原的漢族 人群中，高原肺水腫的發(fā)病率高達(dá)0.4X-2X。高原肺水腫發(fā)病有明顯的家族和個(gè) 體易感傾向，環(huán)境因素和遺傳因素均可以影響高原肺水腫的發(fā)生。近年來(lái)，遺 傳因奮在高原肺水腫發(fā)病機(jī)制中的作用逐漸受到重視張雪峰，高原施工A^ 急性重型高原病患病率調(diào)查，《高原醫(yī)學(xué)雜志》，2005; 15(3): 7-8;陳有，高 原肺水腫發(fā)病機(jī)制研究逸艮，《高原醫(yī)學(xué)雜志》，2005， 15 ( 2 ): 62-64;高鈺琪， 高原肺水腫的發(fā)病機(jī)制及防治，《人民軍醫(yī)》，2005; 482 ( 2 ): 108-111。
腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin- angiotensin system,縮寫為RAS)在血壓調(diào) 節(jié)、電解質(zhì)平衡及高原肺水腫發(fā)病中具有非常重要的作用，它由一系列肽類激素 及相應(yīng)的酶組成，其中AGT經(jīng)腎素分解形成血管緊張素I ,再經(jīng)血管緊張素轉(zhuǎn)換 酶作用形成有生物活性的八肽血管緊張素n ，可引起血管收縮，刺激腎臟對(duì)鈉重 吸收，最終導(dǎo)致高原肺水腫。人類血管緊張素原(angiotensiiiogen，縮寫為AGT)基因位于l號(hào)染色體q42 43，全長(zhǎng)13kb，包括啟動(dòng)子的5'側(cè)翼序列、5個(gè)外顯 子和4個(gè)內(nèi)含子及第1外顯子前端的多個(gè)調(diào)節(jié)片段沈志霞，血管緊張素原基 因多態(tài)性與原發(fā)性高血壓之間的關(guān)系，《中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜 志》，2008, 18 (06): 722-725。目前有文獻(xiàn)報(bào)道， 一些基因的拷貝數(shù)與疾病的易 感性相關(guān)，并是一些疾病的遺傳標(biāo)記Braude I，Large scale copy number variation (CNV) at 14ql2 is associated with the presence of genomic abnormalities in neoplasia,《BMC Genomics》，20067: 138，關(guān)于AGT拷貝 數(shù)與高原肺水胂易感的相關(guān)性尚無(wú)報(bào)道。
通過(guò)SYBR (即SYBR GREEN染料，縮寫SYBR )定量PCR(聚合S^反應(yīng))的 方法檢測(cè)AGT拷貝數(shù)，發(fā)現(xiàn)AGT拷貝數(shù)與高原肺水腫易感性之間存在相關(guān)性， 具體做法是
(1 )健康對(duì)照組標(biāo)本(25例)在成都采集擬進(jìn)入高原人員靜脈血2ml (EDTA 抗凝)，然后與他們一起乘飛機(jī)達(dá)到拉薩(海拔3658米)，并觀察他們?cè)诶_一 周內(nèi)沒(méi)有發(fā)生高原肺水肺；
(2)高原肺水腫病例組標(biāo)本(25例)為與健康對(duì)照組標(biāo)本年齡匹配，按 高原病診斷標(biāo)準(zhǔn)我國(guó)高原病命名、分型及診斷標(biāo)準(zhǔn)，(《高原醫(yī)學(xué)雜 志》，1996: 2-4符合高原肺水腫診斷標(biāo)準(zhǔn)的病例。樣本收集過(guò)程中遵循"赫 爾辛基"宣言，^9f究得到了收集對(duì)象的知情同意，采集靜脈血2ml (EDTA抗凝)。
(3 )分別用上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司UNIQ-10柱式臨床樣品基因組 抽提試劑盒(貨號(hào)SK1342 )提取健康對(duì)照組標(biāo)本和高原肺水腫病例組標(biāo)本血液 白細(xì)胞DNA，然后采用定量PCR ( SYBR染料法)的方法分別擴(kuò)增^對(duì)照組標(biāo)本 和高原肺水腫病例組標(biāo)本的AGT基因和核基因編碼的看家基因Beta-act in;再分別計(jì)算每例標(biāo)本的AGT拷貝數(shù)與Beta-acUn的拷貝數(shù)的比值，結(jié)果經(jīng)SPSS 12. 0 ( —種統(tǒng)計(jì)軟件)中的獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)進(jìn)行檢驗(yàn)，以P<0. O5為相差顯著， 并通過(guò)該軟件計(jì)算出95%的可信區(qū)間，以分別得到健康對(duì)照組和高原肺水腫病 例組AGT/Beta-actin拷貝數(shù)的參考值，結(jié)杲發(fā)現(xiàn)在高原肺水腫病例組中 AGT/Beta-actin的拷貝數(shù)比值顯著升高(表1 ).
表l高原肺水腫病例組和健康對(duì)照組中AGT/Beta-actin拷貝數(shù)比值 健康對(duì)照組(n=25 )高原肺水腫病例組(n=25 ) AGT/Beta—actin 0. 0909 ± 0. 0227 0. 1107 ± 0. 0227A
95%可信區(qū)間 0. 0806-0.1012 0.1003—0.1210 '高原肺水鐘病例組vs健康對(duì)照組P=0. 007

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種通過(guò)AGT基因拷貝數(shù)預(yù)測(cè)高原肺水腫發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的
試劑盒，能用于平原人i4^高原前對(duì)高原肺水腫易感者的篩選，指導(dǎo)高原肺水
腫的預(yù)防和治療，減輕急性重癥高原病的威脅。
本發(fā)明所述的一種通過(guò)AGT基因拷貝數(shù)預(yù)測(cè)高原肺水胂發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒，
包括分離包裝的AGT引物混合液，Beta-act in引物混合液，PCR反應(yīng)液，無(wú)菌
去離子水，定值標(biāo)準(zhǔn)品，健康對(duì)照DNA,其特征是，
所述的AGT引物混合液中的上游引物(F)和下游引物U)的序列為 F: 5' -GCCGTTTCTCCTTGGTCT-3'和R: 5'~GCAAGACGTTTATTACTAACACAAG-3'; 所述的Beta-actin引物混合液中的上游引物和下游引物的序列為 F: 5，-CGGGAAATCGTGCGTGACAT-3，和R: 5，-GAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3，； 所述的PCR反應(yīng)液，含有PCR緩^液、MgCl2、 dNTPs(脫氧核苷三褲酸)、SYBR染料、Ex Taq酶；
所述的定值標(biāo)準(zhǔn)品是用Beta-actin的上下游引物在PTC-200 PCR儀中進(jìn)行目 的片段的擴(kuò)增，得到含有目的片段的PCR產(chǎn)物，然后將目的片段插入克隆栽體 pMD18-T中，并將陽(yáng)性克隆增菌后測(cè)序^;從證實(shí)含Beta-actin基因片段的菌 液中提取質(zhì)粒。
所述的一種通過(guò)AGT基因拷貝數(shù)預(yù)測(cè)高原肺水腫發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒，其所 述的健康對(duì)照DNA是采集擬進(jìn)入高原前的人員的靜脈血2ml (EDTA抗凝)，并且 到高原后在一周內(nèi)沒(méi)有發(fā)生高原肺水肺，然后，提取血液白細(xì)胞MA，再將DNA 濃度調(diào)為50ng/nl。
所述的通過(guò)AGT基因拷貝數(shù)預(yù)測(cè)高原肺水肺發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒，其所述的 AGT引物混合液為100p 1;其中上游引物和下游引物各50m l，濃度均為10pmo1/ "'
所述的一種通過(guò)AGT基因拷貝數(shù)預(yù)測(cè)高原肺水胂發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒，其所 迷的Beta-actin引物混合液為400m 1;其中上游引物和下游引物各200p 1， 濃度均為10pmol/^il。
所述的一種通過(guò)AGT基因拷貝數(shù)預(yù)測(cè)高原肺水肺發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒，其所 述的定值標(biāo)準(zhǔn)品用無(wú)菌去離子水倍比稀釋為5管，每管體積200Ml，濃度分別 為lx104、 lx105、 lx106、 lxl07、 lxl(T拷貝/微升。
所述的一種通過(guò)AGT基因拷貝數(shù)預(yù)測(cè)高原肺水胂發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒，其所 述的無(wú)菌去離子水為1500m 1。
本發(fā)明建立了利用定量PCR ( SYBR染料法)方法檢測(cè)來(lái)AGT拷貝數(shù)的方法， 能用于平原人進(jìn)入高原前對(duì)高原肺水腫易感者的篩選，指導(dǎo)高原肺水腫的預(yù)防和治療，減輕急性重癥高原病的威脅，有利于進(jìn)入高原A^健康；該試劑盒使
用簡(jiǎn)單，操作方便，檢測(cè)快速。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明所述的通過(guò)AGT基因拷貝數(shù)預(yù)測(cè)高原肺水腫發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒，包
括分離包裝的AGT引物混合液，Beta-actin引物混合液，PCR反應(yīng)液，無(wú)菌去
離子水，定值標(biāo)準(zhǔn)品，健康對(duì)照DNA;
試劑盒中的AGT引物混合液中的上游引物和下游引物的序列為 F: -GCCGTTTCTCCTTGGTCT-3'和R: 5'~GCAAGACGTTTATTACTAACAaAG-3, ， 試劑盒的Beta-actin引物混合液中的上游引物和下游引物的序列為 F: 5,-CGGGAAATCGTGCGTGACAT-3，和R: 5，-GAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3，； 試劑盒中的PCR反應(yīng)液，含有PCR援沖液、MgCl2、 dNTPs(脫氧核苷三磷酸)、
SYBR染料、ExTaq酶，均直接購(gòu)于寶生物工程(大連)有限公司，貨號(hào)DRR041S。 試劑盒中的定值標(biāo)準(zhǔn)品是用Beta-actin的上下游引物在PTC-200 PCR儀中
進(jìn)行目的片段的擴(kuò)增，得到含有目的片段的PCR產(chǎn)物，然后將目的片段插入克隆
栽體pMD18-T中，并將陽(yáng)性克隆增菌后測(cè)序驗(yàn)證；從證實(shí)含Beta-actin基因片段
的菌液中提取質(zhì)粒。
試劑盒中的^Li:對(duì)照DNA是采集擬進(jìn)入高原前的人員的靜脈血2ml (EDTA抗
凝)，并且到高原后在一周內(nèi)沒(méi)有發(fā)生高原肺水腫，然后，提取血液白細(xì)胞DM，
再將DM濃度調(diào)為50ng/nl。
試劑盒中的AGT引物混合液為100ji 1;其中上游引物和下游引物各50p 1，
濃度均為10Pmol/nla
試劑盒中的Beta-actin引物混合液為400p 1;其中上游引物和下游引物各200 ^1，濃度均為10pmol/p 1,
試劑盒中的定值標(biāo)準(zhǔn)品用無(wú)菌去離子水倍比稀釋為5管，每管體積200p 1， 濃度分別為lx104、 lx105、 lx106、 lx107、 lxi()8拷貝/ul。
試劑盒中的無(wú)菌去離子水為1500 ml,
試劑盒中的定值標(biāo)準(zhǔn)品用Beta-actin上下游引物，在PTC-200 PCR儀中進(jìn)行 擴(kuò)增，條件為94TC預(yù)變性5min， 94X:變性30s， 60C退火30s, 721C延伸45s, 94 t:變性30s， 601C退火30s， 72TC延伸45s……其中94"變性30s， 60"C退火30s， 72 1C延伸45s循環(huán)29次，721C終末延伸8fflin， PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)后用將目的片段 (擴(kuò)增產(chǎn)物)插入克隆栽體pMD18-T (購(gòu)于寶生物工程有限公司)中，并將陽(yáng)性 克隆增菌后測(cè)序發(fā)江；
從證實(shí)含有Beta-actin基因片段的菌液中提取質(zhì)粒，采用分光光度儀測(cè)得 質(zhì)粒濃度，再算出摩爾濃度Ct量除以堿基數(shù)+ 324. 5 + 10)，再乘以阿拂加的羅 常數(shù)(6. 02x1023)，得到質(zhì)粒的濃度為1 x 108拷貝/^ 1 將質(zhì)粒進(jìn)行倍比稀釋(共 稀釋五個(gè)梯度).稀^^將標(biāo)準(zhǔn)品(即上述質(zhì)粒)分別裝在200 m 1小管內(nèi)，于 -20TC的水箱內(nèi)^M!"，避免質(zhì)粒反復(fù)凍融導(dǎo)致降解；
健康對(duì)照DNA，在成都采集擬進(jìn)入高原人員靜脈血2ml，然后與他們一起乘 飛機(jī)達(dá)到拉薩，并觀察他們一周且在這周內(nèi)沒(méi)有發(fā)生高原肺水腫，抽取靜脈血 2ml (EPTA抗凝)并提^jk液白細(xì)胞DM。
該試劑盒的使用說(shuō)明
第一步,待測(cè)個(gè)體樣品準(zhǔn)備，采用上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司 ,臨床樣品基因組抽提試劑盒(貨號(hào)SK1342 )提取待講 胞基因組總DNA，然后用紫外分光M儀對(duì)DNA進(jìn)行定量；第二步，PCR反應(yīng)體系配制，共配制十管； 第一管到第五管為定值標(biāo)準(zhǔn)品，共5管，濃度分別為 取10 n 1濃度為1 x 108拷貝/ y 1的質(zhì)粒；
取10yl濃度為lxlO-拷貝/jiil的質(zhì)粒，加入90nl無(wú)菌去離子水，混勻
得到濃度為lxl(r拷貝/p 1的質(zhì)粒；
取IOH 1濃度為1 x 10'拷貝/jii 1的質(zhì)粒，加入90p 1無(wú)菌去離子水，混勻
得到濃度為lxl(^拷貝/M 1的質(zhì)粒;
取10pl濃度為lxl()6拷貝/yi的質(zhì)粒，加入90y l無(wú)菌去離子水，混勻
得到濃度為lxl()5拷貝/ial的質(zhì)粒；
取10pl濃度為1 x 105拷貝/^1 1的質(zhì)粒，加入90p 1無(wú)菌去離子水，混勻 得到濃度為lxl()4拷貝/y 1的質(zhì)粒；
各取0.5pl濃度從"104至lxl()8拷貝/iil的標(biāo)準(zhǔn)品，然后，每管, 次加入Beta-actin引物混合液lnl， PCR反應(yīng)液12. 5 n 1，無(wú)菌去離子水11 pl，混勻；
第六管為待測(cè)個(gè)體AGT的擴(kuò)增，取待測(cè)個(gè)體的DM 0. 5nl，然后依次加入 AGT引物混合液lpl, PCR反應(yīng)液12.5^1，無(wú)菌去離子水llnl,混勻；
第七管為待測(cè)個(gè)體看家基因Beta-act in的擴(kuò)增，取待測(cè)個(gè)體的DNA 0.5p 1，然后依次加入Beta-actin引物混合液lpl， PCR反應(yīng)液12. 5 ji 1，無(wú)菌去 離子水llMl，混勻；
第八管為空白對(duì)照，分別取Beta-acUn引物混合液lpl, PCR反應(yīng)液12. 5 Ul，無(wú)菌去離子水11.5nl，混勻；
第九管為M對(duì)照樣本AGT的擴(kuò)增，取對(duì)照DM 0. 5 ji 1，然后依次加入AGT引物混合液lMl, PCR反應(yīng)液12.5jil，無(wú)菌去離子水llpl，混勻；
第十管為健康對(duì)照樣本看家基因Beta-actin的擴(kuò)增，^照DM 0. 5pl， 然后依次加入Beta-act in引物混合液l卩l(xiāng)， PCR反應(yīng)液12. 5 y 1，無(wú)菌去離子 水llpl，混勻；
第三步，PCR擴(kuò)增條件，將第二步的十管已經(jīng)混勻的物質(zhì)分別放入Opt icon monitor 1定量PCR儀中，均按以下糾進(jìn)行PCR反應(yīng)95*0預(yù)變性10s; 95 1C變性5s，60X:退火延伸20s，讀板，重復(fù)39個(gè)循環(huán)；
其中，AGT引物擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為444bp，序列如下
gccgtttctccUggtctaagtgtgctgcatggagtgagcagtagaagcctgcagcggcacaaa
tcaagttgagaacaaaaattgggtUtaaaattaaagtatacatttttgcattgccttcggtttgtat Uagtgtcttgaatgtaagaacitgacctccgtgtagtgtctgtaataccttagttttttccacagat gcttgtgatuttgaacaatacgtgaaagatgcaagcacctgaatttctgtttgaatgcggaaccata gctggttatttctcccttgtgttagtaataaacgtcttgcj
Beta-actin引物擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為180bp，序列如下
ccatggtggccyccagctcctccctggagaagagctacaagctgctcgatggccaggtcatcaccatc ggcaacgagcggttccactgccccg8ggcgctcttccagccttccttc。
第四步，數(shù)據(jù)分析，PCR反應(yīng)結(jié)束后，定量PCR儀通過(guò)比較待測(cè)標(biāo)本的Ct 值與標(biāo)準(zhǔn)曲線Ct值，自動(dòng)生成每例樣本AGT和Beta-act in的拷貝數(shù)，然后， 用AGT拷貝數(shù)除以Beta-actin拷貝數(shù)，分別求得待測(cè)個(gè)體和對(duì)照的AGT/Beta-actin拷貝數(shù)比值，如果對(duì)照的AGT/Beta-actin (第九管/第十管) 拷貝數(shù)比值位于0. 0806-0. 1012之間時(shí)，提示我們實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性和靈敏度可信， 當(dāng)此時(shí)待測(cè)個(gè)體AGT/Beta-act in (第六管/第七管)的拷貝數(shù)比值位于高原肺水 腫易感者的該基因拷貝數(shù)(0. 1003-0. 1210)之間時(shí)，提示我們?cè)搨€(gè)體有可能就 是高原肺水腫的易感個(gè)體。
第一至第五管為定值標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增，以獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線；
第六、七管是為了獲得待測(cè)個(gè)體的AGT基因和Beta-actin基因的拷貝；
第八管為空白對(duì)照管，以檢測(cè)整個(gè)PCR過(guò)程中是否有污染；
第九、十管是為了獲得健康對(duì)照的AGT基因和Beta-actin基因的拷貝數(shù)。序列表
<110>中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)
<120> —種通過(guò)AGT基因拷貝數(shù)預(yù)測(cè)高原肺水肺發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒 <130〉
<140>200810232915.X <141>2008-10-24 <160> 6
<170> Patentln 3. 3
<210> 1 <211> 18 <212> DM <213>人工合成 <221> AGT上游引物 <糊> 1
gccgtttctc cttggtct 18
<210> 2 <21〗)25 <212> DM <213>人工合成 <221> AGT下游引物 <400> 2
gcaagacgtt tattactaac acaag 25
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213>人工合成
<221> Beta-actin上游引物
<400> 3
cgggaa"cg tgcgtgacat 20
<210> 4
<211> 20
<212>腿
<213>人工合成
<221> Beta-actin下游引物
<400> 4
gaaggaaggc tggaagagtg 20<210> 5
<211> 444
<212〉 DM
<213> AGT核酸序列
<221> AGT PCR擴(kuò)增產(chǎn)物
<400> 5
gccgtttctccttggtctaa gtgtgctgcatggagtgagc agt柳agcc tgcagcggca60
caaatgcacctccc汪gtttg ctgggttUttttagagaat gggggtgggg aggcaagaac120
cagtgtttagcgcgggacU ctgttccaaaa汪gaattcca accgaccagc ttgtttgtga180
tgttcccttt tcaagttgagaacaaaaatt gggttttaaa attaaagtat240
acatttttgcattgccttcg gtttgtatttagtgtcttga atgtaagaac atgacctccg300
tgtagtgtctgtaatacctt agttttttccacagatgctt gtgatttttg aacaatacgt360
gaaagatgcaagcacctgaa tttctgtttgaatgcggaac catagctggt tatttctccc420
ttgtgtUgtaataaacgtc ttgc444
<210> 6
<211> 180
<212> DM
<213> Beta-
<221〉 Beta-actin PCR擴(kuò)增片段
<400〉 6
cggg,tcgtgcgtgacat caagaagctgtgctacgtcg ccctggactt cgagcgggag60
atggccatggtggccyccag ctcctccctggagaagagct acaagctgct cgatggccag120
gtcatcaccatcggcaacga gcggttccactgccccgagg cgctcttcca gccttccttc180
權(quán)利要求
1、一種通過(guò)AGT基因拷貝數(shù)預(yù)測(cè)高原肺水腫發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒，包括分離包裝的AGT引物混合液，Beta-actin引物混合液，PCR反應(yīng)液，無(wú)菌去離子水，定值標(biāo)準(zhǔn)品，健康對(duì)照DNA，其特征是，所述的AGT引物混合液中的上游引物和下游引物的序列為F5’-ATACAACTACGCAAAGGCCCCA-3’和R5’-AATAGGAGGCCTAGGTTGAGGT-3’；所述的Beta-actin引物混合液中的上游引物和下游引物的序列為F5’-CGGGAAATCGTGCGTGACAT-3’和R5’-GAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3’；所述的PCR反應(yīng)液，含有PCR緩沖液、MgCl2、dNTPs、SYBR染料、Ex Taq酶；所述的定值標(biāo)準(zhǔn)品是用Beta-actin的上下游引物在PTC-200PCR儀中進(jìn)行目的片段的擴(kuò)增，得到含有目的片段的PCR產(chǎn)物，然后將目的片段插入克隆載體pMD18-T中，并將陽(yáng)性克隆增菌后測(cè)序驗(yàn)證；從證實(shí)含Beta-actin基因片段的菌液中提取質(zhì)粒。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種通過(guò)AGT基因拷貝數(shù)預(yù)測(cè)高原肺水腫發(fā)病風(fēng) 險(xiǎn)的試劑盒，其特征是，所述的健康對(duì)照DNA是釆集擬進(jìn)入高原前的人員的靜 脈血2ml)，并且到高原后在一周內(nèi)沒(méi)有發(fā)生高原肺水腫，然后，提取血液白細(xì) 胞DNA，再將DNA濃度調(diào)為50ng/n 1。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種通過(guò)AGT基因拷貝數(shù)預(yù)測(cè)高原肺水腫發(fā)病風(fēng) 險(xiǎn)的試劑盒，其特征是，所述的AGT引物混合液為100jLil;其中上游引物和下 游引物各50pl，濃度均為10pmol/y 1。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種通過(guò)AGT基因拷貝數(shù)預(yù)測(cè)高原肺水腫發(fā)病風(fēng) 險(xiǎn)的試劑盒，其特征是，所述的Beta-actin引物混合液為400 pl;其中上游 引物和下游引物各200 u 1,濃度均為10pmol/" 1。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種通過(guò)AGT基因拷貝數(shù)預(yù)測(cè)高原肺水腫發(fā)病風(fēng) 險(xiǎn)的試劑盒，其特征是，所述的定值標(biāo)準(zhǔn)品用無(wú)菌去離子水倍比稀釋為5管，每 管體積200 m 1，濃度分別為1 x 104、 1 x 105、 1 x 106、 1 x 107、 1 x 108拷貝/^ 1。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種通過(guò)AGT基因拷貝數(shù)預(yù)測(cè)高原肺水腫發(fā)病風(fēng) 險(xiǎn)的試劑盒，其特征是，所述的無(wú)菌去離子水為！500)i 1。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種通過(guò)AGT基因拷貝數(shù)預(yù)測(cè)高原肺水腫發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒，包括分離包裝的AGT引物混合液，Beta-actin引物混合液，PCR反應(yīng)液，無(wú)菌去離子水，定值標(biāo)準(zhǔn)品，健康對(duì)照DNA，其特征是，所述的AGT引物混合液中的上游引物和下游引物的序列為F5’-ATACAACTACGCAAAGGCCCCA-3’和R5’-AATAGGAGGCCTAGGTTGAGGT-3’；所述的Beta-actin引物混合液中的上游引物和下游引物的序列為F5’-CGGGAAATCGTGCGTGACAT-3’和R5’-GAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3’。本發(fā)明能用于平原人進(jìn)入高原前對(duì)高原肺水腫易感者的篩選，指導(dǎo)高原肺水腫的預(yù)防和治療，有利于進(jìn)入高原人群健康；該試劑盒使用簡(jiǎn)單，操作方便，檢測(cè)快速。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101418344SQ20081023291
公開日2009年4月29日 申請(qǐng)日期2008年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月24日
發(fā)明者劉福玉, 羅勇軍, 高文祥, 高鈺琪 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)