專利名稱：用于檢測(cè)egfr基因拷貝數(shù)和7號(hào)染色體倍性的試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生命科學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是一種用于檢測(cè)表皮生長(zhǎng)因子受體 (epidermal growth factor receptor, EGFR)基因拷貝數(shù)和7號(hào)染色體倍性的試劑。
背景技術(shù)：
在我國(guó)，無論男性還是女性，肺癌均已成為癌癥死亡的主要原因。肺癌高死亡率的 主要原因有二個(gè)一是肺癌缺乏有效的早期診斷手段，70%以上的病人在確診時(shí)已屬晚期； 二是晚期肺癌(尤其是非小細(xì)胞肺癌，NSCLC)對(duì)化療的敏感性差，現(xiàn)有的各種化療方案對(duì) NSCLC的總體有效率僅為30%左右。Gefitinib (即易瑞沙)是一種苯胺喹唑啉化合物，是強(qiáng)有力的選擇性酪氨酸激酶 抑制劑(tyrosine kinase inhibitor, TKI)，可阻斷表皮生長(zhǎng)因子受體誘導(dǎo)的體外腫瘤細(xì) 胞的生長(zhǎng)。期臨床試驗(yàn)顯示，Gefitinib對(duì)標(biāo)準(zhǔn)治療失敗的部分NSCLC有良好療效。值得 注意的是，患者對(duì)Gefitinib的治療反應(yīng)差別很大，因此，研究肺癌患者不同治療反應(yīng)的機(jī) 制以及篩選能從治療中獲益的患者有重要的臨床意義。表皮生長(zhǎng)因子受體(印idermal growth factor儀(3印忉1~』6 1 )又稱昍1 -1，其基 因組定位于人類7號(hào)染色體，在多種上皮性腫瘤高表達(dá)，其過表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的增殖、活動(dòng) 性、粘連性、侵襲性、凋亡抑制和血管生成相關(guān)，最終導(dǎo)致細(xì)胞的轉(zhuǎn)化、增殖，抵抗細(xì)胞凋亡、 促進(jìn)細(xì)胞生存，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、臨床分期、生存期、預(yù)后和對(duì)治療反應(yīng)相關(guān)。馬薩諸塞總醫(yī)院癌癥中心(Massachusetts General Hospital Cancer Center, MGHCC)的 Lynch 等以及達(dá)納法伯癌癥研究所(Dana Farber Cancer Institute, DFCI)的 Paez等研究發(fā)現(xiàn)有變異EGFR基因的患者表現(xiàn)出對(duì)gefitinib更好的治療反應(yīng)。但是， Danafarber癌癥研究所的Bruce Johnson (首先報(bào)道EGFR突變的研究者之一)表示，在臨 床試驗(yàn)中，從抑制劑治療中獲益的患者超過了僅有EGFR突變的人數(shù)。這些新的結(jié)果提示， 測(cè)定EGFR基因拷貝數(shù)在選擇治療時(shí)可能起著一定的作用。另有研究顯示，EGFR基因突變和 拷貝數(shù)增加兩種改變同時(shí)存在的患者使用酪氨酸激酶抑制劑的療效顯著，說明對(duì)EGFR基 因拷貝數(shù)和基因突變進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)可能更有助于藥物敏感性和預(yù)后的判斷。因此，在臨床 上無論是檢測(cè)EGFR基因突變，還是檢測(cè)基因拷貝數(shù)增加，對(duì)于患者用藥的選擇及預(yù)后判斷 都有著重要的意義，即通過FISH方法檢測(cè)EGFR基因擴(kuò)增陽性患者選擇使用TKI類藥物可 取得較好的臨床療效。熒光原位雜交(Fluorescencein situ hybridization，F(xiàn)ISH)是在原有的放射性 原位雜交技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來分子細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)。其基本原理是通過熒光標(biāo)記的DNA探 針與待測(cè)樣本的DNA進(jìn)行原位雜交，在熒光顯微鏡下對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行辨別和計(jì)數(shù)，從而對(duì) 染色體和基因異常的細(xì)胞、組織樣本進(jìn)行檢測(cè)和診斷。FISH技術(shù)操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)快速，結(jié)果 直觀易于觀察；具有有效的靈敏度和特異性，能檢測(cè)到一些常規(guī)遺傳學(xué)分析不能發(fā)現(xiàn)基因 的變異，而且重復(fù)性好。因此，F(xiàn)ISH基因已廣泛應(yīng)用于基因組結(jié)構(gòu)研究、染色體精細(xì)結(jié)構(gòu)變 異分析、病毒感染分析、人類產(chǎn)前診斷、腫瘤遺傳學(xué)研究等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種用于檢測(cè)EGFR基因拷貝數(shù)和7號(hào)染色體倍性的試劑， 其特征在于，所述試劑包括用于檢測(cè)EGFR基因拷貝數(shù)的熒光探針RP11-339F13和用于檢測(cè) 7號(hào)染色體倍性的熒光探針RP11-144H20 ；其中，RP11-339F13為覆蓋EGFR基因全長(zhǎng)的BAC克隆，用羅丹明熒光素標(biāo)記，其末 端序列如下(1)RP11-339F13 正向序列(Forward sequence)cagagacaggagcggaggcttctcctggtgaccactctgcttaaaaacttcatcagatccgtagtttcagag cccccctgaaccccatcccttacctctaccagttgcaggtgggtctctggggtggggctgccctccccaccagcacccc aagggctaaaaggttgaggggagaacaccatcatttgtacagggggatcctggaagatgaggcctgagaaagccctgcgg ggcccctcaccttctccctagctgtggccaagagtgtctggccttgcctgcctcaggaccagcccaaagtggaggtgag aggtgagccccagcccccaggggaagggtgatggtggtcttggtctcagcatggttctggtagaggtgggttattttgaa gatgatgaaccttaagcctctttctgatcttgctttaaataaatacttctgaacaacagcaacaacagaatagtgttgatagg aaagccctccactccaccagaaccacgcggccttctcgtcctcccctcctccacttccttcctaagtcactgctccatgagctct tccacaggagatttacaaaatagaacacaaacaatccagttcccgcctctcactctgaactcctcccaagactcgtggggtgcg gcagcccctgggaacacccagcccttcaaggtcaaacacagcccccgcccctcactctggggtaccctgccagaataagcc ccgacagccatgtggagcagagccttc(2)RP11-339F13 反向序列ccgcccggccagccgccccgtccgggagggaggtgggggggtccaaggtaaggaaggccctagagtcta ggaagagactggccagtgcattaaccattgtagtgtaatggatttgatgttactttatgctcacaagttggacaca cacacagggacccagatcaaattggaggggaaggtcaaagtcagcttcccaaaggaactgaagcttagactgatttttaaaggc tgagttaaaataaactgggtaaaaataaagaaggaaagagaaaagcaaatgtaaaatatctgtgcagcatgaagtagcaaaa tatattcagagaatgtaagaagctgaaatgagggcctcaactaagcgtgggaatgcagatggtgacatagcaatgctgagg taggctccccaggaccgaggccggcttgttgcggggagaggggaggggcactctaggatgatctctggcgtaagcagcag gtaacgcgg
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圖1是EGFR基因(紅色)和7號(hào)染色體(綠色)著絲粒特異探針在中期分裂相 的定位圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 菌體培養(yǎng)1)原始菌液(人基因組細(xì)菌人工染色體(BAC)克隆，購(gòu)自invitrogen公司)涂平 板，37°C培養(yǎng)過夜。2)挑取單菌落，至5ml LB培養(yǎng)基(胰化蛋白胨10g/L，酵母提取物0. 05g/L，氯化 鈉 10g/L, ρΗ7· 0)，37°C，220 轉(zhuǎn) / 分搖菌過夜。3)將5ml菌液全部加入400ml LB培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，37°C，220轉(zhuǎn)/分搖菌過夜。實(shí)施例2 質(zhì)粒的提取1)將溫育的轉(zhuǎn)化細(xì)胞轉(zhuǎn)移至含抗生素氨芐(100 μ g/ml) LB平板上，當(dāng)液體被吸收 后，倒置平板，37°C培養(yǎng)12 16h。2)挑取單個(gè)菌落，37°C于IOml LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h。3)8000rpm 離心 10 15min，去上清。4) 200 μ 1 Solution I (50mM葡萄糖，IOmM EDTA pH8. 0, IOmM Tris ρΗ8· 0)振蕩混勻。5) 400 μ 1 Solution II (0· 2M NaOH，1 % SDS，現(xiàn)配現(xiàn)用)振蕩 7s，冰上靜置 lOmin。6) 300 μ 1 Solution III (3Μ 醋酸鉀，ρΗ4· 8)振蕩 5s，冰上靜置 10 15min。7) 13000轉(zhuǎn)/分離心lOmin，上清液轉(zhuǎn)入1. 5ml的離心管。8)加入等體積平衡酚，振蕩至乳濁狀，1000轉(zhuǎn)/分離心8min。9)吸上層水相，加等體積的異丙醇，振蕩30s，-20°C下沉淀DNA2h以上。10) 12000轉(zhuǎn)/分離心lOmin，去上清，室溫下充分干燥。11) 70%預(yù)冷酒精洗滌2 5min，10000轉(zhuǎn)/分離心lOmin，室溫下充分干燥。
13)加入 RNase 處理 lh。14)加入等體積的氯仿混勻，IOOOOrpm離心IOmin。16)吸上層水相至新的離心管中，2倍體積的無水乙醇沉淀過夜。17) 12000rpm離心15min，去上清液，室溫下充分干燥。18)加入適當(dāng)體積的TE buffer溶液，室溫下溶解30 60min。19)質(zhì)粒DNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。實(shí)例3 標(biāo)記探針采用切口平移(Nick translation)的方法標(biāo)記，過程如下20 μ 反應(yīng)體系中含有dATP、dCTP、dGTP、dTTP 禾 Π Fluorophore-Iabeled dUTP(EGFR基因用Cy3，7號(hào)染色體著絲粒用FITC)，各0. 2yM，DNase I 0. 5U、DNA聚合酶I 2U、0. 5 1. 0μ g質(zhì)粒 DNA0PCR儀中，15°C下標(biāo)記1. 5-3h后加1 μ 1 0. 5Μ EDTA (ρΗ8. 0)終止反應(yīng)。過程中需 取5 μ 1產(chǎn)物用2 %的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，若DNA片段大小在500-600bp，則停止反 應(yīng)；若片段大于該范圍，則需增加DNase I的量以及反應(yīng)的時(shí)間，直至符合目標(biāo)大小。制得 RP11-339F13 探針和 RP11-144H20 探針。實(shí)例4:FISH檢測(cè)1.預(yù)處理程序1)將載玻片浸入2 % 3-氨基丙基三乙氧基硅烷 (3-aminopropyltriethoxysi lane, Sigma Chemical Co.，St. Louis, MO)丙 溶液中 5 分 鐘，隨后在丙酮及蒸餾水中漂洗，自然干燥載玻片(或使用商業(yè)化防脫玻片)。2)從福爾馬林固定石蠟包埋的乳腺癌組織中獲取多塊2-4微米切片，分別置于以 上經(jīng)氨基烷基硅烷(aminoalkylsilane)處理過的載玻片上。3)將組織切片置于65°C下過夜烘烤或烘烤6小時(shí)。4)將組織切片浸于二甲苯中室溫脫蠟2次，每次10分鐘，隨后浸入100%乙醇中 5分鐘。5)將組織切片依次室溫置于100%乙醇、85%乙醇和70%醇中各兩分鐘復(fù)水。將 組織切片室溫浸入去離子水中3分鐘，用無絨紙巾吸取多余的水分。6)準(zhǔn)備一缸蒸餾水并將其置于電磁爐上燒開，將玻片浸入沸水中處理組織切片 15分鐘。7)取0. 4ml蛋白酶K儲(chǔ)存液(20mg/ml)溶于40ml 20XSSC(pH7. 0)得到蛋白酶K 工作液(200yg/ml)；將組織切片浸泡在蛋白酶K工作液中，37°C下孵育8分鐘(看消化情 況而定)。8)組織切片經(jīng)蛋白酶K消化后，將組織切片玻片依次置于70%乙醇、85%乙醇和 100%乙醇中各2分鐘脫水。9)自然干燥玻片。10)按照FISH操作步驟進(jìn)行FISH實(shí)驗(yàn)。2. FISH操作步驟2. 1探針混合物準(zhǔn)備
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2. 1. 1室溫下將如下液體加入到微量離心管中。7 μ 1 雜交緩沖液1 μ 1 去離子水2 μ 1 熒光探針2. 1. 2離心1-3秒(迷你離心機(jī))。2. 1. 3渦旋混勻后再次短暫離心。2. 2探針與樣本雜交2. 2. 1將10μ 1的探針混合物滴于玻片雜交區(qū)域，立即加蓋蓋玻片，避免蓋玻片與 玻片之間產(chǎn)生氣泡。2. 2. 2加好探針的載玻片在烤片機(jī)上83°C變性5分鐘。2. 2. 3從烤片機(jī)上拿下載玻片，立即用封片膠封邊。2. 2. 4將玻片置于預(yù)熱的濕盒中，42°C保溫箱中雜交過夜。2. 3玻片洗滌2.3. 1移去封片膠和蓋玻片，立即將玻片置于盛有2XSSC溶液的瓶中，晃動(dòng)玻片 1-3秒，10分鐘后取出玻片。2. 3. 2將玻片置于盛有2XSSC/0. 1% NP-40溶液的瓶中，晃動(dòng)玻片1_3秒，5分鐘 后取出玻片。2. 3. 3將玻片室溫浸泡在70%乙醇中，3分鐘后取出玻片。2. 4結(jié)果觀察2.4. 1暗處自然干燥玻片。2.4.2將154 1 DAPI復(fù)染劑滴加于雜交區(qū)域位置，立即蓋上蓋玻片。暗處放置 10-20分鐘。2. 4. 3在Olympus BX51熒光顯微鏡下選用合適的濾波片組觀察玻片。軟件拍攝和 分析圖片。實(shí)施例5:結(jié)果判讀熒光原位雜交信號(hào)在正常細(xì)胞內(nèi)顯示為2紅2綠(2R2G)，在異常細(xì)胞顯示紅色信 號(hào)數(shù)量大于2，綠色信號(hào)數(shù)量不少于2。1.正常結(jié)果熒光原位雜交信號(hào)在正常細(xì)胞內(nèi)顯示為2紅2綠(2R2G)。2. EGFR基因檢測(cè)的陽性判斷方法如下隨機(jī)觀察細(xì)胞(至少觀察100個(gè)細(xì)胞)，統(tǒng)計(jì)紅信號(hào)個(gè)數(shù)和綠信號(hào)個(gè)數(shù)。1)當(dāng)紅綠信號(hào)比值小于2，而有不少于40%的細(xì)胞中紅色信號(hào)個(gè)數(shù)大于或等于4 個(gè)時(shí)，表示EGFR基因高多體性擴(kuò)增，為陽性結(jié)果；2)當(dāng)出現(xiàn)以下三種情況之一時(shí)，表示EGFR基因擴(kuò)增，為陽性結(jié)果紅綠信號(hào)比值大于或等于2 ；不少于10%的細(xì)胞中有大于或等于15個(gè)紅色信號(hào)； 包含成簇的紅色信號(hào)。圖1所示為利用本發(fā)明試劑中的探針對(duì)對(duì)正常人外周血培養(yǎng)細(xì)胞的中期染色體進(jìn)行的 FISH, EGFR基因(紅色)和7號(hào)染色體(綠色)著絲粒特異探針在中期分裂相的定位如圖所示。
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權(quán)利要求
用于檢測(cè)EGFR基因拷貝數(shù)和7號(hào)染色體倍性的試劑，其特征在于，所述試劑包括用于檢測(cè)EGFR基因拷貝數(shù)的熒光探針RP11 339F13和用于檢測(cè)7號(hào)染色體倍性的熒光探針RP11 144H20；其中，RP11 339F13為覆蓋EGFR基因全長(zhǎng)的BAC克隆，用羅丹明熒光素標(biāo)記，其末端序列如下(1)RP11 339F13正向序列(Forward sequence)cagagacaggagcggaggcttctcctggtgaccactctgcttaaaaacttcatcagatccgtagtttcagagcccccctgaaccccatcccttacctctaccagttgcaggtgggtctctggggtggggctgccctccccaccagcaccccaagggctaaaaggttgaggggagaacaccatcatttgtacagggggatcctggaagatgaggcctgagaaagccctgcggggcccctcaccttctccctagctgtggccaagagtgtctggccttgcctgcctcaggaccagcccaaagtggaggtgagaggtgagccccagcccccaggggaagggtgatggtggtcttggtctcagcatggttctggtagaggtgggttattttgaagatgatgaaccttaagcctctttctgatcttgctttaaataaatacttctgaacaacagcaacaacagaatagtgttgataggaaagccctccactccaccagaaccacgcggccttctcgtcctcccctcctccacttccttcctaagtcactgctccatgagctcttccacaggagatttacaaaatagaacacaaacaatccagttcccgcctctcactctgaactcctcccaagactcgtggggtgcggcagcccctgggaacacccagcccttcaaggtcaaacacagcccccgcccctcactctggggtaccctgccagaataagccccgacagccatgtggagcagagccttc(2)RP11 339F13反向序列ccgcccggccagccgccccgtccgggagggaggtgggggggtccaaggtaaggaaggccctagagtctaggaagagactggccagtgcattaaccattgtagtgtaatggatttgatgttactttatgctcacaagttggacacacacacagggacccagatcaaattggaggggaaggtcaaagtcagcttcccaaaggaactgaagcttagactgatttttaaaggctgagttaaaataaactgggtaaaaataaagaaggaaagagaaaagcaaatgtaaaatatctgtgcagcatgaagtagcaaaatatattcagagaatgtaagaagctgaaatgagggcctcaactaagcgtgggaatgcagatggtgacatagcaatgctgaggtaggctccccaggaccgaggccggcttgttgcggggagaggggaggggcactctaggatgatctctggcgtaagcagcaggtaacgcggtgccaggacatggctgagttttacataaacatttgttcaagcaaatatgggatcattcactgaaacggagaattcaaagtgaggtctagatttggtggcaagatacaactgattcgaggttaggaaaggagagttggaggaacaggaggaagcggcctctcatctgcaaaccctgagttcctggaacacttgtttgttagggagggaagtgtggcccagccacaatcctttgaacatcttcctcttccatcctctgggttctgcatttc；RP11 144H20為7號(hào)染色體著絲粒特異的BAC克隆，用異硫氰酸熒光素標(biāo)記，其末端序列如下(3)RP11 144H20正向序列g(shù)aattcagcagtttggaaacactctttttgtcaattctgcaagtcgacatttgggaggtcattgagctcaaaggtgaaaaagtgaatatcccataataaaaagtagaagaaatctattgcattgaggcctatggtgaaagaggaaaaatattcagaaaaaatctagaaagaagctttctgagaaactgctttgtgatgtgtgcattcacctaacagagttaatcctttcagtgaaatcagcagtttgcaaacactgttttcatccattctgtaaaaggacatttgctagttcattaacaccaatggcaaaaaagcaaatatcactggagaaaaactagaaggaatctatctgagaaaccactttttgatgtgtgcattcacctcgcagagttaaacttttattttcatggagcaggttgtaaacactctttttgtagaaactgcaaagggatatttgggagcgcatttaggcttatggtaaaaaggaaatatcttaagttgaaaactagaaacaagctttctgagaaacttctttgtgatgtgcacattcatatcacagagtaaaacctttactttggattcagtagtttggaagccctgttgttgtagaatgtgtgaagggatacttgggagctcattgaggccatccggtaaaaagtgaatatcccaggataaaaactaaaaggaaacaatctgagaaaccactatgtcatgtgtgcattcacctcgcagaattaaaactttcttttc(4)RP11 144H20反向序列ctgagaattcttccgtctagcattcaatgaagaaatcccgtttccaacgaaggcctcaaacaggtccatatttccacttgcagactttacaaacagtgtgtttccaaactcctctatgaaaagaaaggttaaactctgtgagttgaacgcacacatcacaaagcactttctgagaatgattctgtctggttattatacgaagatatttccttttctgcaattgtcctcaaatcgcttgaaatctccacctgaaaatgccacagcaagagtgtttcaaatctgctctctctaaagcaaggttcaactctgtgagttgaatacacacaacacaaaaaagttcctgagaactcttcttagtctagcatgaaaggaagaaaccccgtttgcaacgaagccctcaaagaggtccaaatatccacttgcagacataacaagcagagtgtttctaaactgctctaagaaaagaaaggttaaactctgtgagttgaaggcacacatcacaaagtagtttctgagaatgattctgtctagtttttatttgaagatatttccttttctactgttggcatcaaatcgcttgaaatctccacttgcaaattccacaaaaagagtgtttcaaatctgctctgtgtaaagggacgttccactctgtgagttgaatacacacagcacaaagaagttactgagaattcttctgtctagcatgaaatgaagaaatcccgtttccaacgaaggcctcaatgcggtcca。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于檢測(cè)EGFR基因拷貝數(shù)和7號(hào)染色體倍性的試劑，所述試劑包括用于檢測(cè)EGFR基因拷貝數(shù)的熒光探針RP11-339F13和用于檢測(cè)7號(hào)染色體倍性的熒光探針RP11-144H20；其中，RP11-339F13為覆蓋EGFR基因全長(zhǎng)的BAC克隆，用羅丹明熒光素標(biāo)記；RP11-144H20為7號(hào)染色體著絲粒特異的BAC克隆，用異硫氰酸熒光素標(biāo)記。使用本發(fā)明試劑可以快速、簡(jiǎn)便地檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)EGFR基因拷貝數(shù)及7號(hào)染色體倍性，有助于藥物敏感性和預(yù)后的判斷，對(duì)指導(dǎo)于非小細(xì)胞肺癌等腫瘤分子靶向藥物酪氨酸激酶抑制劑(TKIs)的使用具有重要意義。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101899504SQ20101016886
公開日2010年12月1日 申請(qǐng)日期2010年5月11日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月11日
發(fā)明者方國(guó)偉, 董正偉, 郭興中, 郭堯 申請(qǐng)人:合肥艾迪康臨床檢驗(yàn)所有限公司