專利名稱：異源基因在細菌細胞中的染色體表達的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及異源基因在細菌中的表達領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
遺傳工程通過重組表達系統(tǒng)，特別是通過在原核生物(如大腸桿菌(E.coli))中的表達使在細菌細胞中產(chǎn)生大量的異源蛋白或多肽成為可能。
表達的異源興趣蛋白質(zhì)可以是哺乳動物、其它真核生物、病毒、細菌、藍細菌、原細菌或者合成源的。
與天然細菌蛋白不同(其可以在細菌細胞內(nèi)有效地積累，甚至在由單拷貝的染色體基因編碼時)，目前沒有報道說明當由單一染色體基因位點編碼時異源蛋白可以在細菌細胞中成功地積累超過總細胞蛋白水平的0.1％。
選擇總細胞蛋白的0.1％作為蛋白成功積累的實踐測量指標是因為(a)此數(shù)值大約是由現(xiàn)代重組細菌產(chǎn)生標準確定的所需要的蛋白有經(jīng)濟價值的明顯積累的下限，和(b)此數(shù)值大約是考馬斯染色的全部細菌細胞抽提物的聚丙烯酰胺凝膠分析中的可見蛋白帶的下限。
當非細菌基因在細菌細胞中表達時甚至在已知最強的細菌啟動子控制之下表達時，其表現(xiàn)不好一般歸因于非細菌mRNA轉(zhuǎn)錄不良和新合成的細菌蛋白的迅速降解。廣泛接收的觀點是為了使非細菌或者異源蛋白在細菌細胞中成功地積累，必須將編碼異源蛋白的基因定位在多拷貝的質(zhì)粒載體中。
一個多拷貝的質(zhì)粒攜帶的用于在大腸桿菌中克隆和表達編碼異源蛋白的基因的拷貝數(shù)通常是每個細胞20個拷貝。甚至低拷貝數(shù)的質(zhì)粒(如pACYC177和pLG339)以每個細胞6-10個拷貝存在。質(zhì)?；騽┝康牟焕稽c是甚至一些外源蛋白少量的表達可能殺死宿主細胞(參見酶學方法，18563-65，D.Goeddel編輯，1990)。因此，在每個細胞的一個或少數(shù)幾個拷貝上，例如通過將所說的基因整合到細菌染色體上確實限制編碼這種有毒基因產(chǎn)物之基因的拷貝數(shù)將是有利的。例如，如果所說的文庫中高拷貝表達的一個或多個cDNA可能殺死細菌宿主或使之生長不良時，此系統(tǒng)可以使技術(shù)人員在細菌宿主中產(chǎn)生多個代表性的cDNA表達文庫。
編碼異源多肽之基因的染色體整合作為在細菌宿主細胞中表達異源蛋白的方法也是有利的。多拷貝的載體一般是不穩(wěn)定的，需要在生長培養(yǎng)基中使用抗生素來保持。目前使用的將外源基因整合到細菌染色體上的方法效率低、不能控制外源基因的整合位點和/或不能控制整合的基因的拷貝數(shù)。最重要的是，目前所有在細菌染色體上創(chuàng)造重組DNA構(gòu)建體(其中將細菌啟動子融合到異源基因時上)的嘗試都和創(chuàng)造攜帶此構(gòu)建體的病毒或質(zhì)粒中間體有關(guān)。因為這些中間體以高拷貝數(shù)復制，在所說的外源基因產(chǎn)物對這些細菌細胞有毒時它們很難或者不可能恢復。由于這些中間體的高拷貝數(shù)(它們使基因的表達水平成倍地增加)，所以編碼的基因的表達，甚至在很低的水平時，對宿主細胞也可能是有害的。
以前的把異源基因整合到細菌宿主的染色體上的方法包括使用噬菌體λ載體。在噬菌體附著位點(attP，240個堿基長)和細菌附著位點(attB，僅有25個堿基長)之間通過單一位點的特異重組將環(huán)形的噬菌體DNA線性插入到細菌染色體中。這兩個位點共有15個堿基對。此位點專一的重組由特殊的整合酶催化，此酶由噬菌體基因INT所限定(病毒學pp.56-57(Lippincott，第二版，R.Dulbecco和H.Ginsberg，編輯，Philadelphia，PA，1985))。
只要在轉(zhuǎn)化過程中提供整合酶，就可以以正常的融合方式，例如通過INT+輔助噬菌體將噬菌體載體INT整合到所說的染色體中(參見，例如Borck等(1976)分子基因遺傳學146199-207)。
同樣可以把噬菌體載體att-和INT-作為雙溶素原通過使用att+INT+輔助噬菌體整合到細菌染色體上。通過在細菌附著位點上連接原噬菌體形成雙溶素原，并通過在缺陷噬菌體和輔助噬菌體的同源序列間的正常細菌重組將其整合到所說的染色體上(例如參見Struhl等(1976)美國科學院學報211471-1475)。同樣，通過宿主染色體和質(zhì)粒載體攜帶的同源序列間的重組也可能將非復制的colE1復制子整合到大腸桿菌PolA菌株的基因組上(Greener和Hill(1980)細菌學雜志144312-321)。
最近，已經(jīng)特異構(gòu)建了由于將外源基因整合到細菌宿主染色體上的系統(tǒng)。例如，美國專利5,395,763(Weinberg等)公開了由于表達異源基因的染色體表達載體。通過使用多拷貝數(shù)的中間體(已經(jīng)將所說的興趣基因整合在此中間體中)，并通過將此基因可操作地連接到噬菌體中間啟動子(Pm)上而創(chuàng)造了此載體。將包含缺陷Mu基因組(缺乏形成噬菌體顆粒的必要基因)的此質(zhì)粒中間體引入到包裝菌株中，以便產(chǎn)生傳染性的Mu顆粒，然后使用此顆粒將所說的載體引入到宿主細胞中并將此載體整合到宿主細胞的基因組中。此載體系統(tǒng)一旦整合到宿主細胞基因組中，其就可以擴增，但是由于復制噬菌體整合到必要的宿主細胞基因中，這種擴增機制(復制轉(zhuǎn)座作用)通常對宿主細胞是有害的(Neidhardt等，大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌(salmonella typhimurium)分子和細胞生物學(美國微生物學會，Neidhardt等編輯，Washington，D.C.，1987)。由于整合的原噬菌體的擴增通常是有毒的，所以很難獲得和繁殖攜帶擴增的整合DNA的宿主細胞株。如果需要生產(chǎn)蛋白質(zhì)，則需要擴增所說的基因。
Diederich等((1992)″用于整合到大腸桿菌染色體1附著位點attB新質(zhì)粒載體″，質(zhì)粒2814-24)也公開了將基因引入到細菌宿主細胞的染色體室上的系統(tǒng)。此系統(tǒng)使用一套經(jīng)噬菌體λ附著位點能整合到細菌染色體上的多拷貝質(zhì)粒載體。將編碼可操作地與興趣基因連接的啟動子的DNA序列克隆到所描述的多拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體中，通過限制性內(nèi)切酶除去質(zhì)粒的復制起點，將所得的DNA重新環(huán)化，并轉(zhuǎn)移到宿主細胞中，在此DNA序列整合到所說的染色體中。
這些新的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)與早期的系統(tǒng)具有相同的缺點。USP5,395,763(Weinberg等)和Diedench等都要求在構(gòu)建所說的轉(zhuǎn)化DNA期間，當多拷貝數(shù)的質(zhì)粒處于可操作的構(gòu)型時將所說的興趣基因克隆到多拷貝數(shù)的質(zhì)粒中。所說的多拷貝數(shù)的質(zhì)粒構(gòu)型使毒性基因的表達困難(如果可能的化)，這是因為將表達成為多拷貝數(shù)質(zhì)粒的毒性興趣基因得到了繁殖。
因此，需要一種產(chǎn)生異源蛋白的方法，這種方法能產(chǎn)生大量的蛋白質(zhì)且在產(chǎn)生菌株的構(gòu)建期間使異源蛋白對宿主細胞的毒性最小。如圖2所示，申請人已驚人地顯示經(jīng)編碼異源蛋白的低拷貝(大約2個)基因的表達能產(chǎn)生極高的蛋白積累(大約為總細胞蛋白的20％)。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了用于通過將染色體轉(zhuǎn)化DNA(環(huán)形的非自我復制的DNA)整合到宿主細胞的染色體中以在宿主細胞(如大腸桿菌)中產(chǎn)生異源蛋白的組合體和方法。所說的轉(zhuǎn)化DNA包含編碼異源興趣蛋白質(zhì)的基因的一個或多個拷貝。
因此，本發(fā)明提供了產(chǎn)生異源興趣蛋白質(zhì)的方法，該方法包括將染色體轉(zhuǎn)化DNA整合到細菌宿主細胞的染色體中，這有利于整合的DNA的擴增，其中所說的染色體轉(zhuǎn)化DNA包含至少編碼異源興趣蛋白質(zhì)的基因的一個拷貝和選擇標記；和表達編碼異源興趣蛋白質(zhì)的基因，在多拷貝質(zhì)粒載體中構(gòu)建轉(zhuǎn)化DNA的過程中，其中所說的基因決不可操作地連接到在宿主細胞有功能的啟動子上，和其中所說的異源興趣蛋白質(zhì)的積累水平超過總細胞蛋白的0.1％。
染色體轉(zhuǎn)化DNA可以包含可以不包含可操作連接到編碼異源興趣蛋白質(zhì)的基因上的啟動子，其中所說的可操作連接由染色體轉(zhuǎn)化DNA的環(huán)化產(chǎn)生。
所說的染色體轉(zhuǎn)化DNA還可以包含或不包含側(cè)翼于選擇標記的重復DNA。所說的重復DNA可以包含或不包含編碼異源興趣蛋白質(zhì)的可操作地連接到啟動子上的基因的拷貝。
所說的表達異源蛋白的方法可以包括或不包括選擇染色體擴增的步驟。
本發(fā)明也提供了產(chǎn)生染色體轉(zhuǎn)化DNA的方法，該方法包括將第一和第二質(zhì)粒載體的片段連接在一起。
第一質(zhì)粒載體包含第一復制起點和第一編碼異源興趣蛋白質(zhì)的基因，其中所說的基因沒有可操作地連接到啟動子和第一拷貝的復制DNA上。
第二質(zhì)粒載體包含第二復制起點和第一啟動子和第二復制DNA的拷貝。
其中所說的復制起點、所說的宿主細胞的功能啟動子以及其中所說的第一質(zhì)?；蛩f的第二質(zhì)粒都包含選擇標記。
第一質(zhì)粒還可以包含或不包含沒有可操作地連接到編碼異源興趣蛋白質(zhì)之第一基因上的第二啟動子，并且第二質(zhì)粒還可以包含或不包含沒有可操作地連接到第一啟動子上的第二編碼異源興趣蛋白質(zhì)的基因的拷貝。
本發(fā)明也提供了用于產(chǎn)生異源興趣蛋白質(zhì)的染色體轉(zhuǎn)化DNA，該DNA包含可操作地連接到在宿主細胞中有功能的啟動子上的非細菌興趣基因；和側(cè)翼于重復DNA的選擇標記，在多拷貝質(zhì)粒載體中構(gòu)建轉(zhuǎn)化DNA的過程中，其中所說的基因決不可操作地連接到在宿主細胞有功能的啟動子上。
染色體轉(zhuǎn)化DNA還可以包含或不包含編碼非細菌興趣蛋白質(zhì)的基因的兩個或多個拷貝，其中所說的基因的拷貝側(cè)翼于選擇標記。
附圖的簡短說明

圖1顯示出體外形成染色體轉(zhuǎn)化DNA的步驟，其中的DNA環(huán)缺乏復制起點(這樣沒有自我復制的能力)并且用于將外源基因整合到細菌染色體上是合適的。直到所說的染色體轉(zhuǎn)化DNA形成時，待表達的外源基因(這里是IGF-I融合基因)與功能細菌啟動子(這里是T7啟動子)是分開的。
圖2顯示出經(jīng)兩個DNA片段連接形成的染色體轉(zhuǎn)化DNA。其中的一個片段包含融合基因，這種融合基因含有編碼大腸桿菌DsbA、酵母遍在蛋白(以蛋氨酸開始)和人類胰島素樣生長因子I(″dsbA-ubi-IGF″)的序列，這一點在共有(co-owed)未決美國專利申請08/100,744(1993年8月2日申請)中討論了。另一個DNA片段包含T7啟動子。染色體轉(zhuǎn)化DNA和細菌染色體都包含噬菌體λattP的重組位點。將染色體轉(zhuǎn)化DNA轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株B1384中，這樣整合酶(INT)就在trp啟動子(P-trp)的控制下。整合酶催化所說的染色體轉(zhuǎn)化DNA在細菌染色體的att位點上進行位點專一的整合。在轉(zhuǎn)化過程中通過向培養(yǎng)基中加入1mM吲哚-3-乙酸(IAA)可以誘導trp啟動子。帶有整合的染色體轉(zhuǎn)化DNA序列的細胞對氯霉素(CAM-γ，10Tg/ml)具有抗性。
圖3顯示由圖2描述的方法產(chǎn)生的B1384染色體整合體。由通過多套引物(例如UBUF×IGFR，1243(T7REV，或者TRPPF×1239)的PCR擴增宿主染色體DNA、用合適的限制性內(nèi)切酶(分別為SacII，HinCII或者BamHI)消化擴增片段、并通過凝膠電泳測定產(chǎn)物的大小來確認整合的發(fā)生。
圖4顯示出對氯霉素具有抗性的W3110DE3轉(zhuǎn)導體的總細胞裂解物的Western印跡。也包含蛋白質(zhì)大小的標記物(最左端道)和IGF融合蛋白(對照)。
圖5顯示出對卡那霉素具有抗性的轉(zhuǎn)導體的總細胞裂解物的Western印跡。
圖6-9以圖解的形式表示構(gòu)建染色體轉(zhuǎn)化DNA的一般策略。圖6顯示出染色體轉(zhuǎn)化DNA包含編碼異源興趣蛋白質(zhì)的基因的單一拷貝和側(cè)翼于選擇標記的第二基因的兩個拷貝，所說的選擇標記在染色體轉(zhuǎn)化DNA整合后有利于染色體的擴增。圖7顯示出在實施例2-6和實施例8中用于異源蛋白表達的“雙盒”系統(tǒng)。染色體轉(zhuǎn)化DNA的實施方案包含側(cè)翼于選擇標記的編碼異源興趣蛋白質(zhì)的基因的兩個拷貝，所說的選擇標記有利于整合的DNA的染色體擴增。圖8和9顯示出另外的“缺少啟動子”的染色體轉(zhuǎn)化DNAs的實施方案。這些實施方案使用了與宿主細胞染色體片段同源的DNA序列。缺少啟動子的染色體轉(zhuǎn)化DNAs的整合導致宿主細胞啟動子和編碼異源興趣蛋白質(zhì)之基因之間的可操作的連接的形成，及產(chǎn)生側(cè)翼于所說的選擇標記的重復DNA序列。
圖10-13顯示出染色體轉(zhuǎn)化DNA的質(zhì)粒系譜。
圖14顯示出構(gòu)建用于雙盒系統(tǒng)的兩個DNA源的策略。
圖15和16顯示出構(gòu)建用于整合和表達酵母遍在蛋白水解酶基因的染色體轉(zhuǎn)化DNA的策略。
圖17顯示出構(gòu)建用于整合和表達編碼DsbA∷遍在蛋白∷IGF-I融合蛋白之基因的染色體轉(zhuǎn)化DNA的策略。
圖18顯示出構(gòu)建用于整合和表達編碼DsbA∷2A∷IGFBP-3融合蛋白之基因的染色體轉(zhuǎn)化DNA的策略。
圖19和20顯示出構(gòu)建用于整合和表達編碼DsbA∷2A∷IGF-I(圖19)和DsbA∷3C∷IGF-I(圖20)融合蛋白之基因的染色體轉(zhuǎn)化DNA的策略。
圖21顯示出構(gòu)建用于整合和表達編碼DsbA∷遍在蛋白∷TGF-β2融合蛋白之基因的染色體轉(zhuǎn)化DNA的策略。
圖22顯示出構(gòu)建用于整合和表達編碼DsbA∷3C∷IGFBP-3融合蛋白之基因的染色體轉(zhuǎn)化DNA的策略。
圖23顯示出考馬斯藍染色的表達IGF-I融合蛋白的總細胞裂解物的分離物的SDS-PAGE凝膠。c49222、c49258#46和c53063表達DsbA∷遍在蛋白∷IGF-I融合蛋白(左箭頭表示)，只是一條很容易染色的帶。令人驚奇的是，在沒有擴增的c49222和c49258#46處(即沒有對整合的DNA的染色體擴增抗性選擇)有高水平的表達。c57264#5和c57264#28表達DsbA∷3C∷IGF-I融合蛋白，而c57265#44和c57265#54表達DsbA∷2A∷IGF-I融合蛋白。另外，表達的融合蛋白很容易顯色。光密度分析表明所有的分離物的蛋白的積累超過總細胞蛋白的19％(平均蛋白積累是總細胞蛋白的25.7％)。
圖24顯示從c49222，c49258#46，c53063，c57264#5，c57264#28，c57265#44，c57265#54分離的染色體DNA的Southern印跡。用編碼融合到IGF-I上的遍在蛋白的DNA片段檢測印跡。在每一個分離物中，每道中較高分子量的帶代表整合的IGF-I融合蛋白基因的單一拷貝。較低分子量的帶也代表整合的IGF-I融合蛋白基因，但此片段可以通過染色體擴增來擴增。分離物c53063，c57264#5，c57264#28，c57265#44，c57265#54已經(jīng)明顯地擴增，大約擴增了3-5倍。
圖25顯示出考馬斯藍染色的SDS-PAGE凝膠，表明在攜帶編碼IGFBP-3融合蛋白之整合的基因的分離物中有蛋白的積累。A)表示在表達DsbA∷2A∷IGFBP-3融合蛋白的分離物中的蛋白積累。右邊的帶表示在T7 RNA聚合酶誘導后(通過向培養(yǎng)基中加入IPTG)蛋白的表達。B)表示在表達DsbA∷3C∷IGFBP-3融合蛋白的分離物中的蛋白積累。如圖23所示，這些代表融合蛋白的帶很容易顯色。這些凝膠的光密度掃描發(fā)現(xiàn)在A凝膠板上積累的蛋白為總細胞蛋白的22.6％，在B凝膠板上的兩種分離物的積累為總細胞蛋白的33.％和28.2％(從左到右)。
圖26顯示出考馬斯藍染色的SDS-PAGE凝膠，顯示出表達編碼DsbA∷遍在蛋白∷TGF-β2之基因的宿主細胞的蛋白的積累。M為分子量標記，C為陽性對照。兩個質(zhì)粒道(1道和2道)用作標準物，右邊比較多拷貝數(shù)質(zhì)粒載體的蛋白積累和整合到染色體上的基因的蛋白積累。3道和4道是總細胞裂解物的分離物，當其與噬菌體4107劃線培養(yǎng)(streak)時，對T7 RNA聚合酶表現(xiàn)出陰性。該凝膠的光密度分析表明質(zhì)粒菌株積累的蛋白達總細胞蛋白的26.4％。測量了分離物48，56，59，65和66的蛋白積累，表明蛋白積累分別為36.7％，33.3％，32.1％，29.5％，26.7％。
實施發(fā)明的方法本發(fā)明有兩點(a)產(chǎn)生在啟動子和編碼異源興趣蛋白質(zhì)的基因間的可操作連接，這種連接在染色體轉(zhuǎn)化DNA的構(gòu)建過程中或在其整合到宿主細胞的染色體后形成，和(b)同時產(chǎn)生一種用于整合的興趣基因的合適染色體擴增的方法。
在優(yōu)選的實施方案中，染色體轉(zhuǎn)化DNA的產(chǎn)生同時產(chǎn)生兩種結(jié)果(1)啟動子和興趣基因的可操作連接，和(2)側(cè)翼于選擇標記(其是有利于染色體轉(zhuǎn)化DNA擴增的一種手段)的重復DNA序列的位點。另一種實施方案是在產(chǎn)生染色體轉(zhuǎn)化DNA期間在所說的基因和啟動子之間產(chǎn)生了可操作的連接，而整合的結(jié)果產(chǎn)生了染色體擴增的手段(重復DNA序列側(cè)翼于染色體轉(zhuǎn)化DNA)。
通過將染色體轉(zhuǎn)化DNA整合到合適的染色體位點上，也可以產(chǎn)生這兩種結(jié)果或其中之一。例如，可以用在細菌染色體的啟動子附近的基因整合來產(chǎn)生可操作的連接(如通過將染色體轉(zhuǎn)化DNA整合到宿主細胞染色體的操縱子上)。整合的位點或整合位點鄰近的序列可以有利于擴增(例如，在此位點所在的轉(zhuǎn)座因子處，通過提供重復DNA序列或甚至提供與部分染色體轉(zhuǎn)化DNA同源的DNA序列區(qū)，來提供重復DNA序列)。
本發(fā)明使用″染色體轉(zhuǎn)化DNA″，使用它可以簡單、有效和可靠地將異源基因的拷貝插入到宿主細胞(例如大腸桿菌)的染色體中。染色體轉(zhuǎn)化DNA是環(huán)形DNA，其包含一個或多個編碼異源興趣蛋白質(zhì)的基因、選擇標記(如抗生素抗性基因)、重組位點(例如位點專一性的重組位點(如λattP或者ttB)或與宿主細胞染色體上的片斷同源的DNA序列)、重組在宿主染色體上之后及在缺乏復制起點或自我復制序列(ARS)時有利于染色體轉(zhuǎn)化DNA擴增的手段。因此，當染色體轉(zhuǎn)化DNA導入到宿主細胞中時，其不能獨立復制。染色體轉(zhuǎn)化DNA可以任意攜帶可操作地連接到興趣基因上的啟動子。
當將攜帶位點專一性的重組位點的染色體轉(zhuǎn)化DNA導入到染色體上含有第二相似的重組位點(例如另一個attP或者attB位點)的宿主細胞中時，在宿主細胞中能夠催化重組位點的位點專一重組的酶(如整合酶)的表達使所說的載體在此重組位點上整合到宿主細胞的染色體上。這種位點專一重組過程與一般的在同源載體和宿主染色體序列上起作用的重組系統(tǒng)相比，具有更高的有效性，形成具有更高穩(wěn)定性的整合序列，特別是在整合酶的合成得到控制時。也可以通過在染色體轉(zhuǎn)化DNA導入時暫時或穩(wěn)定存在于宿主細胞中的質(zhì)?；蚱渌麯NA分子來提供整合酶。
本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的還有其它各種方法，所說的方法不同于使用attP、attB和INT(使用它可以將染色體轉(zhuǎn)化DNA整合到宿主細胞的染色體上)的優(yōu)選的方法。例如，可以使用非復制的colEl復制子，轉(zhuǎn)座因子、或者甚至攜帶與宿主染色體的序列同源的序列的裸露的DNA將染色體轉(zhuǎn)化DNA插入到宿主染色體中。多拷貝的大腸桿菌素質(zhì)粒ColE1，CloDF13，ColK和ColA都包含位點專一的重組系統(tǒng)(包含順式-反式-作用元件)。為了在本發(fā)明中使用，從這些質(zhì)粒的其中一個獲得的順式-作用元件可以包含在染色體轉(zhuǎn)化DNA中，而所說的反式-作用元件可以在染色體轉(zhuǎn)化DNA或由宿主細胞提供?？梢允褂棉D(zhuǎn)座子(插入序列(IS)和Tn3家族的轉(zhuǎn)座子)將DNA整合到宿主細胞的染色體上。如上所述的大腸桿菌素質(zhì)粒中的順式作用轉(zhuǎn)座子元件可以包含在染色體轉(zhuǎn)化DNA，而反式作用因子可以包含在染色體轉(zhuǎn)化DNA中或由宿主細胞提供。染色體轉(zhuǎn)化DNA也可以攜帶與宿主細胞染色體的序列同源的序列，其有利于染色體轉(zhuǎn)化DNA經(jīng)同源重組的整合。所有這些方法都在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
這一方法的主要特征是編碼異源興趣蛋白質(zhì)的基因在所說的轉(zhuǎn)化DNA構(gòu)建過程中，決不可操作地連接到多拷貝載體的功能啟動子上。在外源基因以低拷貝數(shù)導入到所說的細胞之前，通過使功能啟動子與此興趣基因分離，可以將此基因產(chǎn)物的潛在毒性或致死作用降至最小程度。如果所說的基因沒有可操作地連接到啟動子上，多拷貝數(shù)質(zhì)粒的毒性外源基因則不能表達。其它將興趣基因整合到宿主細胞染色體上的方法使用了攜帶可操作地連接到啟動子上的興趣基因的多拷貝數(shù)質(zhì)粒(如Diederich等和Weinberg等)；這些基因?qū)⒃诖速|(zhì)粒的復制過程中表達，如果所說的興趣基因?qū)|(zhì)粒復制所在的宿主細胞有毒，則產(chǎn)生足夠量的該質(zhì)粒將極其困難(如果可能產(chǎn)生)。
由于染色體轉(zhuǎn)化DNA的形成或由于整合到宿主細胞染色體上，可以在編碼異源興趣蛋白質(zhì)的基因和所說的啟動子之間產(chǎn)生可操作的連接。在由于染色體轉(zhuǎn)化DNA的形成而形成的可操作的連接時，所說的連接是通過染色體轉(zhuǎn)化DNA的環(huán)化而產(chǎn)生的。環(huán)化的完成是通過，例如連接一個或多個DNA片段以形成環(huán)形DNA，或者通過在環(huán)形DNA中的異源重組(這將導致插入物的環(huán)化)。優(yōu)選的是，通過連接一個或多個DNA片段完成環(huán)化。
另外，可以通過多整合或通過選擇整合基因的擴增來完成毒性較小的基因產(chǎn)物的高水平表達。重組DNA的方法和試劑例如在Sambrook等的分子克隆實驗手冊，1-3卷(冷泉港實驗室出版社，第2版，(1989)；或F.Ausubel等的現(xiàn)代分子生物學方案(GreenPublishing和Wiley-interscience紐約，1987))和最新期刊中一般性地描述了對實施所要求的發(fā)明有用的核酸操作的一般技術(shù)。從賣主(New England BioLabs；Boerhinger Mannheim；Amersham；PromegaBiotec，U.S.；Biochemicals和New England Nuclear)可以買到核酸操作中用到的試劑，如限制酶、T7 RNA聚合酶、DNA連接酶等等。定義″外源″或者″異源″或者″非細菌″；″天然″或者″同源″“外源”或者″異源″多肽是通常在特定物種的宿主細胞中不能發(fā)現(xiàn)的多肽。編碼這種多肽的核酸被稱為″外源″或者″異源″的。例如，胰島素樣生長因子(IGF)、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白(IGFBP)和轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)天然存在于哺乳動物細胞中，而人類鼻病毒3C蛋白酶天然存在于病毒和病毒感染的哺乳動物細胞中，但這些蛋白對大腸桿菌則是外源的?！宸羌毦鞍住逋ǔＪ羌毦毎袥]有的蛋白質(zhì)或多肽。非細菌蛋白、外源或異源蛋白可以融合在非細菌蛋白、外源或異源蛋白和其它蛋白或多肽之間。在本發(fā)明的實施方案中，″異源蛋白″和″非細菌蛋白″都可以使用。如本文所公開的，編碼異源或非細菌興趣蛋白質(zhì)的基因不包含在宿主細胞中有功能的啟動子。為了進行表達，所說的基因必須連接到分離的啟動子(該啟動子在宿主細胞中是有功能的)上。相反，″天然″或″同源″的多肽或DNA序列通常存在于所說的宿主細胞中。如果啟動子或其它作用于，例如基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯的序列在所說的宿主細胞中有功能，也可以認為是″同源″的。例如，如果T7 RNA聚合酶存在于所說的宿主細胞中，認為T7啟動子與大腸桿菌宿主細胞是″同源″的，這是因為T7啟動子能夠驅(qū)使與其可操作地連接的編碼多肽的序列的轉(zhuǎn)錄?！寰幋a異源、外源或非細菌蛋白的基因″除了在宿主細胞中有功能的啟動子外，″編碼異源、外源或非細菌蛋白的基因″還包含所有對表達異源、外源或非細菌蛋白必要的元件。這些基因涉及重組基因，所說的重組基因包含宿主細胞天然的基因元件。并且，可以任意優(yōu)化這些基因編碼區(qū)的宿主細胞密碼子的使用。″編碼″如果核酸序列可以轉(zhuǎn)錄和/或翻譯以產(chǎn)生所說的多肽，則核酸序列以其天然的狀態(tài)或經(jīng)重組DNA方法操作的狀態(tài)來″編碼″多肽?！蹇刹僮鞯剡B接″當將核酸序列置于與另一核酸序列的功能關(guān)系中時，其就被可操作地連接。例如，如果啟動子影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄或表達，則該啟動子就可操作地連接到此編碼序列上。一般來說，可操作地連接的DNA序列是鄰近的，并且如果必要，其在讀框中?！逯亟M″″重組″核酸是通過體外連接兩個不同的分離的核酸序列片段或通過化學合成而產(chǎn)生的?！迦旧w擴增″″染色體擴增″指DNA序列的拷貝數(shù)在所說的宿主染色體上的增加。染色體擴增不指染色體外的擴增(如多拷貝數(shù)質(zhì)粒的復制)或者體外擴增(如聚合酶鏈反應(PCR))。探針和引物核酸探針和引物是分離的核酸，一般是單鏈的，并且尤其是探針一般附著在標記或報道分子上。例如，探針用于鑒定組織或其它樣品中的雜交核酸序列或者文庫中的cDNA或者基因組克隆。例如，引物用于擴增核酸序列，如通過聚合酶鏈反應(PCR)。例如Sambrook等(上文)或Ausubel等(上文)描述了探針和引物的制備和用途。核酸的化學合成可以通過化學合成(如通過Beaucage和Carruthers(1981)描述的亞磷酰胺方法(Tetra.Letts.221859-1862)或者通過Matteucci等(1981)的三酯方法(美國化學學會雜志，1033185))產(chǎn)生核酸，特別是如擴增引物的短核酸，并且可以在自動寡核苷酸合成儀上進行。通過合成互補鏈并在合適的條件下使這兩條鏈一起退火或者使用DNA聚合酶及合適的引物序列通過加入互補鏈而從化學合成的單鏈產(chǎn)物中獲得雙鏈片段。染色體轉(zhuǎn)化DNA和它們構(gòu)建過程中所用質(zhì)粒的特征染色體轉(zhuǎn)化DNA包含編碼選擇標記的DNA片段和編碼所需異源多肽的序列。染色體轉(zhuǎn)化DNA也可以以可操作地與編碼所需異源多肽的序列連接的方式包含或不包含轉(zhuǎn)錄和翻譯起始調(diào)節(jié)序列和表達控制序列，所說的表達控制序列可以包含啟動子、增強子和必要的加工信息位點(如核糖體結(jié)合位點、mRNA穩(wěn)定序列以及必要的分泌序號，在合適的地方，分泌序號使所說的蛋白穿過和/或定居在細胞膜上，這樣保留了它的拓撲結(jié)構(gòu)或者從細胞中分泌出來)。
在染色體轉(zhuǎn)化DNA構(gòu)建中所用的質(zhì)粒一般也包含宿主能識別的復制系統(tǒng)，這種復制系統(tǒng)包括復制起點或自我復制序列(ARS)。在染色體轉(zhuǎn)化DNA構(gòu)建過程中所用的質(zhì)粒攜帶重復DNA序列時，這種質(zhì)?？梢栽趓ec宿主細胞中繁殖。優(yōu)選的是，在這些質(zhì)粒攜帶重復DNA序列時，使用rec宿主細胞繁殖所用的質(zhì)粒，以便產(chǎn)生染色體轉(zhuǎn)化DNA和攜帶染色體轉(zhuǎn)化DNA組件的質(zhì)粒，而一般不使用其作為整合染色體轉(zhuǎn)化DNA的宿主細胞。
可以通過本領(lǐng)域公知的標準重組技術(shù)(例如Sambrook等和Ausubel等的描述)從所說的載體中制備染色體轉(zhuǎn)化DNA。
選擇合適的啟動子和其它對有效轉(zhuǎn)錄和/或翻譯必要的序列，以便使之在宿主細胞中有功能。Sambrook等(上文)和Ausubel等(上文)描述了能夠使用的細胞系組合及表達載體的例子；也參見Metzger等(1988)自然33431-36。在原核宿主中這些啟動子是有用的，如trp、lac和λ噬菌體啟動子(例如T7，T3，SP6)、tRNA啟動子和糖酵解酶啟動子。有用的酵母啟動子包括金屬硫蛋白3-磷酸甘油酸激酶或者其它糖酵解酶(這些酶的作用是利用麥芽糖和半乳糖及其它)的啟動子區(qū)(例如參見Hitzeman等，EP73，657A)。合適的哺乳動物啟動子包括猿猴病毒40的早期和晚期啟動子(Fiers等(1978)自然273113)，或者來自鼠莫洛尼氏白血病病毒、小鼠乳房腫瘤病毒、鳥肉瘤病毒、腺病毒II、牛乳頭瘤病毒或者多瘤病毒的啟動子。此外，可以將所說的構(gòu)建體與擴增基因(如DHFR)連接，以便在需要的地方產(chǎn)生此基因的多個拷貝。合適的真核增強子和其它表達控制序列參見，例如增強子和真核基因表達(冷泉港出版社，紐約，1983)。
優(yōu)選的是，當整合到宿主染色體中，驅(qū)使異源基因表達的啟動子是可控制的。
染色體轉(zhuǎn)化DNA和構(gòu)建過程中所用的質(zhì)粒通常包含選擇標記、編碼蛋白的基因，所說的蛋白對染色體轉(zhuǎn)化DNA或質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的宿主細胞的存活和生長是必要的。典型的選擇標記(a)賦予對抗生素或者其它有毒物質(zhì)的抗性，如氨芐青霉素、新霉素、氨甲蝶呤等等；(b)彌補營養(yǎng)缺陷；或(c)供給不能從復合培養(yǎng)基得到的關(guān)鍵營養(yǎng)，如編碼桿菌(Bacilli)的D-丙氨酸消旋酶的基因。合適的選擇標記的選擇將取決于宿主細胞。
本發(fā)明的染色體轉(zhuǎn)化DNA可以包含位點專一性的重組位點，如噬菌體λattP位點。當其轉(zhuǎn)化到細菌宿主菌株(如大腸桿菌B1384)中，產(chǎn)生整合酶，這種整合酶識別染色體轉(zhuǎn)化DNA上的attP位點，并催化與att位點的重組(整合酶可以催化attP和attB或者兩個attP位點之間的重組)。以整合的DNA攜帶的選擇標記為基礎(chǔ)，選擇含有整合的DNA的細菌宿主細胞。
這樣，使用位點專一性的重組一般與酶(例如整合酶)的表達有關(guān)，這種酶催化位點專一重組，并且此酶能識別在染色體轉(zhuǎn)化DNA和細菌染色體上存在的位點。其它由″整合酶″或相似酶賦予特色的位點專一重組系統(tǒng)和由″整合酶″特異識別的位點也可以使用。
整合到多拷貝的宿主細胞染色體上的外源基因的高水平表達也是可能的，例如通過結(jié)合宿主細胞的多個att位點并將多個染色體轉(zhuǎn)化DNA導入到宿主細胞中。另外，可以通過選擇染色體的擴增來獲得含有多拷貝整合DNA的宿主細胞。當選擇標記的兩側(cè)是重復DNA序列時，有利于染色體的擴增。理想的是，重復DNA序列側(cè)翼于第一和第二選擇標記。第一選擇標記在低拷貝數(shù)時是有效的，并可以選擇整合的染色體轉(zhuǎn)化DNA。理想的是第二選擇標記僅在高拷貝數(shù)時是有效的。使用第一選擇標記對整合進行選擇后，然后使用第二選擇標記選擇包含整合的DNA的多拷貝的宿主細胞。
本發(fā)明的染色體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的主要特征是在整合前，編碼異源蛋白的基因不能表達；直到(a)體外構(gòu)建了轉(zhuǎn)化DNA或者(b)染色體轉(zhuǎn)化DNA整合到宿主細胞染色體上時，染色體轉(zhuǎn)化DNA才能可操作地連接到啟動子上。這一方法使技術(shù)人員能使用高拷貝數(shù)的質(zhì)粒作為DNA源來構(gòu)建染色體轉(zhuǎn)化DNA。當毒性基因可操作地連接到啟動子上時，攜帶毒性異源基因的高拷貝數(shù)的質(zhì)粒很難繁殖。例如，DNA的小量制備產(chǎn)生的DNA不足以用于體外操作。通過選擇的DNA片段的環(huán)化從有關(guān)或多個DNA源構(gòu)建染色體轉(zhuǎn)化DNA。
當使用單一DNA構(gòu)建染色體轉(zhuǎn)化DNA時，編碼異源興趣蛋白質(zhì)的基因和啟動子都定位在同一DNA上，然而所說的基因和啟動子不是可操作地連接的?？梢酝ㄟ^，例如將所說的啟動子和興趣基因置于阻止任何可操作地連接(如經(jīng)包含終止子序列)的間隔DNA序列的任何一側(cè)來完成這一過程。理想的是，間插DNA序列也包含源DNA的任何其它的部分(如復制起點或ARS)，這些部分在產(chǎn)生染色體轉(zhuǎn)化DNA時必須除去。通過使阻止所說的基因和啟動子間的可操作連接的DNA序列缺失，然后使剩下的DNA環(huán)化來構(gòu)建染色體轉(zhuǎn)化DNA。
如圖7，8和9所示，染色體轉(zhuǎn)化DNA可以任意包含或不包含表達大腸桿菌親環(huán)蛋白的DNA序列，美國專利5,459,051描述了這一點。
技術(shù)人員使用兩種或者更多DNA源構(gòu)建染色體轉(zhuǎn)化DNA的方法有幾種。如圖7所示，在一個優(yōu)選的實施方案中，使用了兩種DNA源。在此實施方案中，兩種DNA源的每一種都攜帶編碼異源興趣蛋白質(zhì)的基因的一個拷貝和啟動子，但是，所說的編碼異源興趣蛋白質(zhì)的基因和啟動子不是可操作地連接到任何DNA源上的。與前面描述的實施方案一樣，任何DNA源可以攜帶其它必需序列(另外，所說的其它必須序列可以由一個或多個副DNA源提供)。切割兩個DNA源，然后將它們彼此連接，形成環(huán)形染色體轉(zhuǎn)化DNA，這種染色體轉(zhuǎn)化DNA具有兩個拷貝的外源基因，每一個都可操作地連接到啟動子的一個拷貝上。將第一DNA源的啟動子可操作地連接到第二DNA源的編碼異源興趣蛋白質(zhì)的基因上，將第二DNA源的啟動子可操作地連接到第一DNA源的編碼異源興趣蛋白質(zhì)的基因上。
也可以把染色體轉(zhuǎn)化DNA設計成不含啟動子(圖8和9)。將這些沒有啟動子的染色體轉(zhuǎn)化DNA整合到細菌染色體的靶位點上，此位點使編碼異源興趣蛋白質(zhì)的基因與宿主細胞染色體上的啟動子可操作地連接。此實施方案的染色體轉(zhuǎn)化DNA包含符合讀框地連接到一部分與宿主細胞染色體的DNA同源的靶位點DNA片段上的編碼異源興趣蛋白質(zhì)的基因的一個拷貝和選擇標記。此靶位點DNA序列一般是定位在細菌染色體啟動子下游之基因的5’端。染色體轉(zhuǎn)化DNA在宿主細胞染色體上的整合使編碼異源興趣蛋白質(zhì)的基因可操作地與細菌啟動子連接。所說的宿主細胞染色體上的靶序列可以是天然存在的序列或者可以是導入到宿主細胞染色體上的位點。使用與宿主細胞染色體的片段同源的DNA序列可以將目標導入到宿主細胞染色體上，如上文有關(guān)染色體轉(zhuǎn)化DNA整合的描述。使用位點專一的重組(如上文描述的attB/attP系統(tǒng))也可以將靶位點導入。靶位點序列為至少大約10個堿基長，優(yōu)選的是至少大約30個堿基長，最優(yōu)選的是至少大約100分堿基長。染色體轉(zhuǎn)化DNA與靶位點具有至少大約80％的同源性，優(yōu)選的是至少大約90％的同源性，最優(yōu)選的是至少大約95％的同源性。理想的是宿主細胞染色體上的靶位點是稀少的，更理想的是其在宿主細胞染色體上是唯一的。使用與宿主細胞染色體的片段同源的序列整合染色體轉(zhuǎn)化DNA有利于整合的DNA的擴增(通過在整合DNA的側(cè)翼置于重復DNA序列來進行擴增)(參見圖8和9)。DNA導入到宿主細胞中將核酸導入到宿主細胞的各種方法在本領(lǐng)域是公知的，包括但不限于電穿孔；使用氯化鈣、氯化銣磷酸鈣的轉(zhuǎn)染；DEAE-葡聚糖或其它物質(zhì)；微粒轟擊；脂轉(zhuǎn)染；和感染(其中所說的載體是感染劑，如逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組)。一般參見Sambrook等(上文)和Ausubel等(上文)。宿主細胞盡管這些方法對真核宿主細胞也是適用的，但理想的是以原核宿主細胞使用本發(fā)明的方法。在原核宿主中，革蘭氏陰性細菌是理想的，特別是大腸桿菌。也可以使用其它原核生物，如枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)或假單胞菌屬(Pseudomonas)。
也可以使用哺乳動物或其它真核宿主細胞(如酵母、絲狀真菌、植物、昆蟲、兩棲或者鳥類物種)。參見組織培養(yǎng)(Kruse和Patterson等編輯，學院出版社，1973)。有用的哺乳動物宿主細胞系包括但不限于VERO和HeLa細胞系；中國倉鼠卵巢(CHO)細胞；W138，BHK和COS細胞系。整合DNA的擴增通過幾種方法的任何一種都可以有效地進行整合的基因的擴增，例如，染色體復制或復制轉(zhuǎn)座。包含或者其側(cè)翼是25或更多個堿基對的重復DNA序列的整合DNA將形成染色體復制(Normark等(1977)細菌學雜志132912-922；Edland等(1979)分子基因遺傳學173115-125；Tlsty等(1984)細胞37217-224；Stem等(1984)細胞371015-1026)。如果重復DNA包含選擇標記(如抗生素抗性基因或者彌補宿主細胞缺陷的基因)一般有利于對復制(擴增)進行選擇。優(yōu)選的是整合的DNA包括兩種選擇標記；第一種選擇標記在低拷貝數(shù)下操作，用于整合體的選擇；第二種選擇標記要求高拷貝數(shù)，用于選擇擴增整合DNA的宿主細胞?？梢酝ㄟ^復制轉(zhuǎn)座完成擴增，其中所說的染色體轉(zhuǎn)化DNA包含合適的轉(zhuǎn)座子序列或者將染色體轉(zhuǎn)化DNA整合到轉(zhuǎn)座子中。理想的是，通過染色體復制的選擇完成擴增。非細菌蛋白的產(chǎn)生在所說的染色體轉(zhuǎn)化DNA整合到宿主細胞染色體上及整合的DNA擴增后，就可以表達外源基因，結(jié)果產(chǎn)生非細菌興趣蛋白質(zhì)。理想的是控制此整合基因表達的啟動子是可以控制的(即可誘導的)，這樣可以使任何基因產(chǎn)物的毒性作用最小化。在外源基因表達后，可以純化得到的蛋白產(chǎn)物。純化的方法依賴于外源蛋白的特性，這一點對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。
參考下列實施例將更好地理解本發(fā)明，這些實施例的宗旨只是具體地說明本發(fā)明。本發(fā)明的范圍不受這些實施例的限制。
實施例實施例1包含外源基因的染色體轉(zhuǎn)化DNA在大腸桿菌菌株B1384染色體上的整合圖1系統(tǒng)地描述了包含外源基因的染色體轉(zhuǎn)化DNA整合到大腸桿菌染色體上的一般策略。構(gòu)建兩種質(zhì)粒pDM26432包含外源興趣基因(在此實施例中，為IGF-I融合基因)，缺乏可操作連接的細菌啟動子；pDM25423包含T7啟動子。通過連接從這些載體中的每一個中純化的限制性片段，產(chǎn)生了缺乏復制起點的DNA環(huán)(即染色體轉(zhuǎn)化DNA)。此染色體轉(zhuǎn)化DNA包含賦予氯霉素抗性的抗生素抗性基因(CAM-r)和λ噬菌體的位點專一重組位點attP。將此染色體轉(zhuǎn)化DNA轉(zhuǎn)化到細菌菌株(如大腸桿菌B1384)中(Mascarenhas等(1983)病毒學124100-108)(圖2)，此菌株使整合酶(INT)在typ啟動子的控制之下，在通過向培養(yǎng)基中加入1mM吲哚-3-乙酸(IAA)的轉(zhuǎn)化過程中可以誘導此酶的產(chǎn)生。B1384在其染色體上也可以包含att P。整合酶識別染色體轉(zhuǎn)化DNA和B1384染色體上的att P位點，并催化它們的重組，使染色體轉(zhuǎn)化DNA在att P位點上位點專一性地整合在細菌染色體上(WeisberE等廣義病毒學vol.8，pp.197-258(Plenum，F(xiàn)raenckel-Conrat和Wagner，編輯，New York，NY，1977)。以它們對氯霉素的抗性為基礎(chǔ)選擇含有整合的DNA的細菌宿主。
如圖3的概述，檢測具有氯霉素抗性的染色體整合體。經(jīng)采用下列引物系統(tǒng)(如UBUF x IGFR，1243 x T7REV或者TRPPF x 1239)的PCR通過擴增宿主染色體DNA確認整合的染色體轉(zhuǎn)化DNA的存在。
IGFR5’...CCC ATC GAT GCA TTA AGC GGA TTT AGCCGG TTT CAG...3’#1239 5’...GCC TGA CTG CGT TAG CAA TTT AAC TGTGAT...3’#1243 5；...CTG GGC TGC TTC CTA ATG CAG GAG TCGCAT...3’#1227 5’...TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA GA...3’TRPPF 5’...GAT CTG TTG ACA ATT AAT CAT CGA ACTAGT TAA CTA GTA CGC AAG TT...3’T7REV 5’...TGC TAG TTA TTG CTC AGC GG...3’CYCF1 5’...CAG GAT CCG ATC GTG GAG GAT GAT TAAATG GCG AAA GGG GAC CCG CAC...3’CYCR1 5’...CAG GAA GCT TAC GGC AGG ACT TTA GCGGAA AG...3’UBUF5’...GGG GCC GCG GTG GCA TGC AGA TTT TCGTCA AGA CTT TGA...3用適當?shù)南拗菩詢?nèi)切酶(分別為SacII，HinCII或者BamHI)消化擴增的片段。通過瓊脂糖凝膠電泳確定產(chǎn)物的大小。通過擴增下列物質(zhì)證實整合的序列的存在·染色體遍在蛋白和IGF序列，證實相關(guān)外源基因的存在；·染色體tet和T7序列，證實T7啟動子和所說的融合基因的并列；和
·鄰近的染色體trp和tet序列，證實染色體轉(zhuǎn)化DNA在期望位點的插入。通過下列證據(jù)也證實了染色體轉(zhuǎn)化DNA在染色體上的整合·細菌宿主對氯霉素的抗性；·在DNA小量制備時沒有質(zhì)粒DNA；·β-內(nèi)酰胺酶活性的缺乏，確認沒有親本質(zhì)粒(β-內(nèi)酰胺酶使用生色底物7-噻吩基-2-乙酰氨基-3-2-4n，n-二甲基野芝麻花堿苯基偶氮吡啶姆甲基-3-頭孢烯-4-羧酸(PADAC)測定，如酶抑制劑pp.169-177(Verlage Chemie，Broderick，V編輯)的描述)；和·分離分析37℃下將分離物在有或沒有1mM IAA的L肉湯中生長過夜，并接種在LB瓊脂平板上。檢測每一種培養(yǎng)物中單菌落氯霉素抗性的保持情況。在沒有IAA的培養(yǎng)物中觀察到了100％的保持；在有IAA的培養(yǎng)物中觀察到了11％的保持。7個檢測的分離物中有6個顯示出期望的表型。
B1383不包含T7 RNA聚合酶的基因。為了檢測染色體構(gòu)建體的表達，在6個攜帶整合DNA的菌株的每一個中制備P1裂解物，并將其用于轉(zhuǎn)導W3110DE3菌株以獲得氯霉素抗性(細菌遺傳學簡明教程實驗室手冊和大腸桿菌及相關(guān)細菌的操作指南(冷泉港實驗室出版社，Miller，J.H.編輯，1992))。W3110DE3菌株攜帶有在lac啟動子控制之下的T7 RNA聚合酶基因。其與B1384不同，也是Gal+。因此在含有20Tg/ml氯霉素的半乳糖基本平板上選擇轉(zhuǎn)導體。純化并進一步測定每個轉(zhuǎn)導體實驗(獨立的供體)中的單菌落。
在所有6個獨立實驗中所獲得的結(jié)果是一致的即已將染色體轉(zhuǎn)化DNA高效地轉(zhuǎn)移到細菌染色體的新位點att位點(位于W3110DE3中的原噬菌體的兩側(cè))上。下列事實證實了此結(jié)論·氯霉素抗性；·在DNA小量制備中沒有質(zhì)粒DNA；·i21免疫性(DE3溶素原；將噬菌體裂解物用標準技術(shù)接種在細菌菌苔上)；
·gal+(即在半乳糖基本平板上生長)；·在lac控制之下表達IGF蛋白(如實施例1或共有未決美國專利申請08/101,506(1993年8月2日申請)所述進行表達和分析)。
用BgIII和NcoI完全消化6個菌株(″整合體″)的染色體DNA，并用標記的0.6kb DsbADNA探針檢測消化的DNA的Southern印跡(Bardwell等(1991)細胞581-589；也參見Kamitani等(1992)EMBO J1157-62)。6個整合體的每一個都包含插入；印跡表明有幾個雙插入、一個單插入和一個(分離物WB3-6)明顯的重復雙(三個)插入存在。
在用異丙基-J-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)誘導后，檢測6個整合體的IGF融合蛋白的表達。用IPTG誘導這些細胞2小時，然后通過12％SDSPAGE、Western印跡分離誘導的整合體的總細胞提取物、以及不同大小的標記和IGF融合蛋白對照，并與多克隆抗IGF血清反應(參見共有的未決美國申請08/101,506(1993年8月2日)的實施例1)(圖4)。分離物WB3-6(圖4的6道)顯示出IGF融合蛋白的高水平表達。在考馬斯藍染色的凝膠上也可以見到同樣大小的誘導帶。
使用不同的二元系統(tǒng)產(chǎn)生攜帶卡那霉素抗性標記的染色體轉(zhuǎn)化DNA。附圖中描述了所使用的質(zhì)粒pDM25424和pDM25427。通過PCR確定插入物的構(gòu)型和位置，得出實質(zhì)上與上面描述相同的結(jié)果。在轉(zhuǎn)導W3110DE3后，得到了幾個個別的以由Western印跡很容易檢測出的水平表達IGF融合蛋白的分離物(圖5)。所用的方法與上文描述的用于氯霉素抗性分離物的方法相同，只是抗生素和抗性基因由卡那霉素代替了氯霉素。純化的融合蛋白作為對照。1道和2道包含兩個轉(zhuǎn)導分離物的總細胞裂解物。
圖10-13概述了用于這兩個二元系統(tǒng)的載體的構(gòu)建方法。所用的質(zhì)粒源是pBR322，pUC18，pUC19，pKK233-2，ptRC99A，pCH110，pNEO(Pharmacia，piscataway，NJ)；pLG339HLY(Dr.Barry Holland，Institute de Génétiques et Microbiologie，UniversitéParis-Sud)；pRcCMV(Inviuogen，San Diego，CA)；pACYC177和pACYC184(New Eneland BiaLabs，Beverly，MA)；pET3b(Studier和Moffat(1986)分子生物學雜志189113-130)；pYZ22070(在共有的未決美國申請08/101,744(1993年8月2日)的實施例1中描述過)。
從B.Bachmann，ECGSC，耶魯大學得到大腸桿菌K-12菌株W3110。將其用如Studier和Moffat(1986)(分子生物學雜志189113-130)描述的DE3缺陷噬菌體溶源化。W3110DE3是這樣的溶素原。使用引物CYCF1和CYCR1從W3110通過聚合酶鏈式反應(PCR)擴增所說的親環(huán)蛋白(參見上文)。
實施例2DsbA∷遍在蛋白∷IGF-I融合基因的染色體表達DsbA∷遍在蛋白∷IGF-I融合基因是可裝配的，將其整合到帶有使用雙盒二元系統(tǒng)產(chǎn)生的染色體轉(zhuǎn)化DNA的細菌宿主細胞的染色體上。構(gòu)建雙盒二元系統(tǒng)載體的策略如圖14所示。用雙盒系統(tǒng)構(gòu)建染色體轉(zhuǎn)化DNA(CTD)的一般策略如圖7所示。產(chǎn)生攜帶DsbA∷遍在蛋白∷IGF-I融合基因的染色體轉(zhuǎn)化DNA所用的策略如圖12所示。在染色體整合后，表達融合基因，結(jié)果此蛋白以極高的水平積累。
雙盒二元系統(tǒng)使用兩種質(zhì)粒pDM25470和pDM25465，如圖7和14所示。pDM25425是攜帶多拷貝的attP、T7啟動子和單拷貝的rrntl t2終止子的pUC19的衍生物，通過BglII/BamHI消化從pUC19中切除1.6kb的片段。將終止子和編碼DsbA的序列加入到EcoRI(fill)/NsiI消化的pDM25459中，經(jīng)連接形成pDM25470(雙盒二元系統(tǒng)之一)。另一個雙盒質(zhì)粒pDM25465攜帶終止子的兩個拷貝、卡那霉素抗性基因和親環(huán)蛋白基因(共有未決美國專利申請08/101,506描述了親環(huán)蛋白基因有助于蛋白產(chǎn)生的用途，其全部內(nèi)容本文一并參考)。將親環(huán)蛋白基因從pER15951(HinDIII(fill)/XbaI，0.6kb片段)克隆到pDM25424(BamHI(fill)/XbaI，5.2kb片段；攜帶兩個拷貝終止子和卡那霉素抗性基因的pUC19骨架)。pDM25430中卡那霉素抗性基因(來源于pDM25424)的有效性不夠，因此用pLG339hly(PvuII/EcoRI消化)的卡那霉素抗性基因代替，產(chǎn)生質(zhì)粒pDM35443。通過將寡T7F和T7R退火并將它們連接到EcoRI-消化的pDM25443中而將T7啟動子克隆到pDM25443中，產(chǎn)生pDM25465。
合成兩組寡核苷酸(1，2，1R，2R和3，4，3R，4R)，將其磷酸化，變性和退火。將編碼遍在蛋白的1，2，1R和2R的退火產(chǎn)物連接到pUC18(SphI-BamHI消化)上。將編碼IGF-I的3，4，3R和4R的退火產(chǎn)物連接到pUC18(EcoRI-BamHI消化)上。將所得的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到JM109中，并在氨芐青霉素平板上選擇轉(zhuǎn)化的宿主細胞。分析轉(zhuǎn)化體中遍在蛋白和IGF-I序列的存在情況，然后測序以鑒定正確形成的構(gòu)建體。從每一個中選擇一個分離物，分別命名為pPO39354和pPO39334。5’-CAG ATT TTC GTC AAG ACT TTG ACC GGT AAA ACC ATAACA TTG GAA GTT GAA CCT TCC GAT ACC ATC GAG AAC GTTAAG GCG AAA ATT CAA GAC AAG GAA GGT ATC CCT CCAGAT CA-3’25’-ACA AAG ATT GAT CTT TCC CGG CAA GCA GCT AGA AGACGG TAG AAC GCT GTC TGA TTA CAA CAT TCA GAA GGA GTCCAC CTT ACA TCT TGT GCT AAG GCT CCG CG-3’1R5’-ATA CCT TCC TTG TCT TGA ATT TTC GCC TTA ACG TTC TCGATG GTA TCG GAA GGT TCA ACT TCC AAT GTT ATG GTT TTACCG GTC AAA GTC TTG ACG AAA ATC TGC ATG-3’2R5’-GAT CCG CGG AGC CTT ACC ACA AGA TGT AAG GTG GACTCC TTC TGA ATG TTG TAA TCA GAC AGC GTT CTA CCG TCTTCT AGC TGC TTG CCG GCA AAG ATC AAT CTT TGT TGA TCTGGA GGG-3’35’-GAT CCC CGC GGT GGT GGT CCG GAA ACC CTG TGC GGTGCT GAA CTG GTT GAC GCT CTT CAG TTC GTT TGC GGT GACCGT GGT TTC TAC TTC AAC AAA CCG ACC GGT TAC GGT TCCTCC TCC CGT CGT GCT CCG CAG-3’5’-ACC GGT ATC GTT GAC GAA TGC TGC TTC CGG TCC TGCGAC CTG CGT CGT CTG GAA ATG TAC TGC GCT CCG CTG AAACCG GCT AAA TCC GCT TAA TGC ATC GAT CTC GAG-3’3R5’-AGC ACG ACG GGA GGA GGA ACC GTA ACC GGT CGG TTTGTT GAA GTA GAA ACC ACG GTC ACC GCA AAC GAA CTGAAG AGC GTC AAC CAG TTC AGC ACC GCA CAG GGT TTC CGGACC ACC ACC GCG GG-3’4R5’-AAT TCT CGA GAT CGA TGC ATT AAG CGG ATT TAG CCGGTT TCA GCG GAG CGC AGT ACA TTT CCA GAC GAC GCA GGTCGC AGG ACC GGA AGC AGC ATT CGT CAA CGA TAC CCG TCTGCG G-3’
從pPO39354和pPO39334中分離遍在蛋白和IGF-I序列(分別通過SphI-SacII和SacII-NsiI消化)，并將其克隆到SphI-NsiI消化的pDM25454(以pUC19為基礎(chǔ)的質(zhì)粒，攜帶編碼DsbA的序列)中，以產(chǎn)生命名為pPO39358的質(zhì)粒，此質(zhì)粒攜帶DsbA∷遍在蛋白∷IGF-I融合基因。
將pPO39358的融合基因連接到雙盒二元親本載體pDM25470和pDM25465中，以分別產(chǎn)生pPO39377和pPO41623。連接pPO39377和pPO41623的EcoRI-XbaI片段形成所說的染色體轉(zhuǎn)化DNA(圖7)。
將所說的染色體轉(zhuǎn)化DNA轉(zhuǎn)化到含有attP位點以及在Trp啟動子控制之下的編碼整合酶(INT)的序列的大腸桿菌菌株B1384。加入吲哚-3-乙酸(1mM)以便誘導INT的表達，結(jié)果使轉(zhuǎn)導的染色體轉(zhuǎn)化DNA整合。通過下列方法檢測細胞中染色體轉(zhuǎn)化DNA的整合用AmpScreen(BRL)通過藍/黃篩選檢測藍/黃篩選細胞的整合的DNA。進一步篩選帶有藍表型的克隆，棄掉黃色克隆。使用下列引物對通過宿主細胞染色體DNA的擴增來檢測PCR細胞正確整合的DNAT7F1 5’-AAT TGT CGA CAT TAA TAC GAC TCA CTA TAGGGA GAC CAC AAC GGT TTC CCT GAA TTG TCG ACA TTAATA CGA CTC ACT ATA GGG AGA CCA CAA CGG TTT CCC-3’IGFREV 5’-CCC ATC GAT GCA TTA AGC GGA TTT AGCCGG TTT CAG-3’這些引物確認了所說的帶有它的啟動子的完全融合基因的存在，而T7REV 5’-TGC TAG TTA TTG CTC AGC GG-3’TRPBR2 5’-AAG GGC TTC ATC ATC GGT AAT AGA GA-3’這些引物確認了所說的染色體轉(zhuǎn)化DNA整合到B1384的att位點上。
整合基因的蛋白的產(chǎn)生需要在B1384中沒有的T7 RNA聚合酶活性。為了檢測此整合基因的蛋白產(chǎn)生，使用B1384整合體產(chǎn)生P1裂解物。然后用這些裂解物轉(zhuǎn)導大腸桿菌菌株W3110DE3(如實施例1所述)，這種菌株是Gal+并攜帶一個拷貝的在lac啟動子控制之下T7 RNA聚合酶基因。通過在含有10lg/ml卡那霉素的半乳糖基本培養(yǎng)基平板上接種選擇轉(zhuǎn)化體。分離單一的kan+/Gal+菌落，并在帶有卡那霉素的半乳糖基本培養(yǎng)基平板上進行再選擇。使用下列引物對通過PCR進一步分析kan+/Gal+菌落ATT3 5’-GAG GTA CCA GCG CGG TTT GAT CAG-3′T7RNAP1 5’-CAG CGT TAT CCG CAA CCT CAC-3’所得的結(jié)果表明W3110DE3中在原噬菌體兩側(cè)的上游att位點沒有被占據(jù)；和T7F1 5’-AAT TGT CGA CAT TAA TAC GAC TCA CTA TAGGGA GAC CAC AAC GGT TTC CCT GAA TTG TCG ACA TTAATA CGA CTC ACT ATA GGG AGA CCA CAA CGG TIT CCCTG-3’IGFREV 5’-CCC ATC GAT GCA TTA AGC GGA TTT AGCCGG TTT CAG-3’所得的結(jié)果確認完整地轉(zhuǎn)移了融合基因表達盒。
通過將W3110DE3轉(zhuǎn)導中的各個分離物和需要T7 RNA聚合酶活性以裂解細菌的噬菌體4107(Novagen)劃線培養(yǎng)來檢測這些分離物的T7 RNA聚合酶活性。使用包含完整融合基因表達盒且T7 RNA聚合酶活性為陽性的命名為c49222的分離物檢測蛋白的產(chǎn)生。在12.5％的丙烯酰胺凝膠上通過總細胞裂解物的SDS-PAGE分析蛋白的產(chǎn)生。SDS-PAGE凝膠的光密度分析顯示出DsbA∷遍在蛋白∷IGF-I融合蛋白的積累達總細胞蛋白的22.3％。
也使用P1裂解物將所說的整合基因轉(zhuǎn)導到大腸桿菌菌株cDM46809(其是cam’，malE缺失，并包含導入到lac區(qū)的attB位點)中。通過在含有卡那霉素和氯霉素的平板上生長選擇轉(zhuǎn)導體。使用下列引物對通過PCR確認在lac區(qū)的整合UBI1 5’-CAG ATT TTC GTC AAG ACT TTG ACC GGT AAAACC ATA ACA TTG GAA GTT GAA CCT TCC GAT ACC ATCGAG AAC GTT AAG GCG AAA ATT CAA GAC AAG GAA GGTATC CCT CCA GAT CA-3′1224 5’-CGC CAG GGT TTT CCC AGT CAC GAC-3’從為kanr/camr且整合到lac區(qū)的分離物中產(chǎn)生P1裂解物。此P1用于轉(zhuǎn)導W3110DE3。通過在選擇培養(yǎng)基上生長選擇對卡那霉素和氯霉素抗性。通過與如上所述的噬菌體4107劃線培養(yǎng)來檢測kanr/camr分離物的T7 RNA聚合酶活性。經(jīng)IPTG誘導2個小時后，檢測T7 RNA聚合酶活性為陽性的命名為c49258#46和c49258#50的兩個分離物的蛋白積累情況。在12.5％的丙烯酰胺凝膠上通過SDS-PAGE分析總細胞裂解物。在c49222#46中DsbA∷遍在蛋白∷IGF-I融合蛋白的積累達總細胞蛋白的19.6％，這一點是通過SDS-PAGE凝膠的光密度分析確定的。
進行c49222和c49258#46的染色體DNA的Southern印跡分析以測定所說的整合的DNA的拷貝數(shù)。分離c49222和c49258#46的染色體DNA，用限制性核酸內(nèi)切酶消化，轉(zhuǎn)移到Hybond-N(Amersham)上，并用編碼所說的融合蛋白的遍在蛋白和IGF-I部分的DNA片段檢測。Southern印跡顯示出整合到染色體c49222和c49258#46上的每一個DsbA∷遍在蛋白∷IGF-I基因大約有2個拷貝(圖24)，即單拷貝的整合的DNA?？紤]到SDS-PAGE所示的DsbA∷遍在蛋白∷IGF-I蛋白的積累水平(分別為總細胞蛋白的22.3％和19.6％)，這一結(jié)果是令人驚奇的和出人意料的。一般來說，這種高水平的蛋白積累僅能通過高拷貝數(shù)的質(zhì)粒攜帶的異源基因的表達來完成。
通過整合除了攜帶卡那霉素抗性基因外還攜帶四環(huán)素抗性基因的染色體轉(zhuǎn)化DNA也能產(chǎn)生DsbA∷遍在蛋白∷IGF-I。使用由B1384整合體制備的P1裂解物轉(zhuǎn)導W3110DE3以產(chǎn)生卡那霉素抗性(參見實施例1)。使用如上所述的引物對T7F1×IGFREV和ATT3×T7RNAP1檢測Kanr分離物正確整合的DNA。通過與如上所述的噬菌體4107劃線培養(yǎng)來檢測分離物的T7 RNA聚合酶活性。然后通過在含有卡那霉素(10μg/ml)和四環(huán)素(30μg/ml)的培養(yǎng)基上生長來選擇T7 RNA聚合酶活性為陽性的分離物的整合的DNA的擴增。結(jié)合到此構(gòu)建體中的四環(huán)素等位基因在高拷貝數(shù)時是有效的，因此四環(huán)素抗性克隆可以擴增所說的整合的DNA。如上所述經(jīng)IPTG誘導，檢測Kanr/tetr克隆的蛋白積累情況。所有的Kanr/tetr克隆在誘導后都產(chǎn)生所說的融合蛋白。
實施例3遍在蛋白水解酶(UBP-1)的染色體表達圖10-16描述了在此實施例所用的質(zhì)粒的構(gòu)建方法。pJT70是遍在蛋白水解酶的來源。pDM25493是此構(gòu)建體中所用的trp啟動子的來源。從pDM46813、pDM25472或者pDM25448制備在trp啟動子控制之下的酵母UBP-1基因的染色體轉(zhuǎn)化DNA。在此實施例中使用pDM25472(即圖16的染色體轉(zhuǎn)化DNA#1)。經(jīng)此染色體轉(zhuǎn)化DNA形成的融合基因編碼在截斷的DsbA基因和失去氨基末端92個密碼子的UBP-1cDNA之間的符合讀框的融合。
如實施例2中的描述將所說的染色體轉(zhuǎn)化DNA轉(zhuǎn)入到B1384中。用卡那霉素(10μg/ml)選擇整合體。使用引物TRPPF和1239在診斷PCR反應中檢測分離的克隆(如實施例1所述)。通過此檢驗，所有的克隆都是陽性的。所有的分離物對氨芐青霉素也是敏感的。
選擇一個克隆進一步確定其性質(zhì)。制備此分離物的P1裂解物，并如實施例1所述用于轉(zhuǎn)導W3110DE3以獲得卡那霉素抗性。如實施例2所述使用引物ATT3和T7RNAP1通過PCR進一步檢測卡那霉素抗性克隆。所有的分離物都顯示出預料的位置在位于DE3溶素原兩側(cè)的attB/P或attP/B位點上。
通過檢測遍在蛋白水解酶活性檢測所說的分離物的蛋白的表達。將分離物培養(yǎng)在酪蛋氨基酸基本培養(yǎng)基中，收獲，并通過超聲處理裂解。通過在37℃下與DsbA∷遍在蛋白∷IGF-I融合蛋白底物溫育1小時分析可溶部分的活性。經(jīng)SDS-PAGE監(jiān)測切割情況。所有的分離物(WBD311，312，313，314，331和333)都顯示出很好的酶活性(即在測定條件下該底物完全切割)。
實施例4胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白-3(IGFBP-3)融合蛋白的表達使用雙盒方法產(chǎn)生攜帶融合蛋白的染色體轉(zhuǎn)化DNA，所說的融合蛋白包含DsbA、含有人類鼻病毒2A蛋白酶位點的接頭、IGFBP-3(DsbA∷2A∷IGFBP-3)。如如18所示構(gòu)建所說的融合蛋白和染色體轉(zhuǎn)化DNA。DsbA來自pDM46905，通過將引物2ATA和V2ATB退火產(chǎn)生2A蛋白酶位點，使用引物BP3RZ和NBP3F從pYZ42580 PCR擴增IGFBP-3。
通過將多個合成的寡核苷酸退火并連接而產(chǎn)生用于制備DsbA∷2A∷IGFBP-3融合物的IGFBP-3基因，當其完全裝配時編碼IGFBP-3蛋白。在三個部分(5’，3’和中部)裝配所說的寡核苷酸。使下列寡核苷酸退火并連接以形成IGFBP-3的5’部分F1-1 5’-AGC TTG GTG CTT CTT CTG CTG GTC TTG GAC CAGTTG TTC GTT GTG AAC CAT GTG ATG CAC GAG CTT TAG CTCAAT GTG CTC CAC CAC CAG CTG TT-3’，F(xiàn)1-2 5’-TGT GCT GAA TTA GTT CGA GAA CCA GGT TGT GGTTGT TGT TTA ACT TGT GCT TTA TCT GAA GGT CAA CCA TGTGGT ATT TAT ACT GAA CGT TGC GG-3’，F(xiàn)1-3 5’-TAG TGG TTT GCG TTG TCA ACC AAG CCC AGA TGAAGC TAG GCC TTT ACA AGC ATT ATT AGA TGG TCG AGG TCTGTG TGT TAA TGC GTC CGC TGT TTC TCG ATT GCG CGC G-3’，C1-1 5’-TCG ACG CGC GCA ATC GAG AAA CAG CGG ACG CATTAA CAC ACA GAC CTC GAC CAT CTA ATA ATG CTT GTA AAGGCC TAG CTT CAT CTG GGC TTG GTT G-3’，C1-2 5’-ACA ACG CAA ACC ACT ACC GCA ACG TTC AGT ATAAAT ACC ACA TGG TTG ACC TTC AGA TAA AGC ACA AGT TAAACA ACA ACC ACA ACC TGG TTC TC-3’，和C1-3 5’-GAA CTA ATT CAG CAC AAA CAG CTG GTG GTG GAGCAC ATT GAG CTA AAG CTC GTG CAT CAC ATG GTT CAC AACCAA CAA CTG GTC CAA GAC CAG CAG AAG AAG CAC C-3’然后將其克隆到pUC18(HinDIII-SalI消化)中；此構(gòu)建體命名為pYZ37437。通過使下列寡核苷酸退火并連接產(chǎn)生此基因的3’部分F-1 5’-TCG ACG TGA GAT GGA GGA TAC CTT AAA CCA TTTAAA ATT TTT GAA CGT TTT ATC CCC GCG TGG CGT TCA TATCCC GAA TTG CGA T-3’，
F-2 5’AAA AAA GGC TTC TAC AAA AAG AAA CAA TGC CGTCCG AGT AAG GGT CGT AAA CGA GGT TTT TGT TGG TGC GTTGAC AAA TAC GGT-3’，F(xiàn)-3 5’-CAA CCG TTG CCG GGT TAT ACT ACT AAA GGC AAAGAA GAT GTT CAT TGT TAT TCT ATG CAA TCT AAA TAA TGCATC TCG AG-3’，C-1 5’-AAT TCT CGA GAT GCA TTA TTT AGA TTG CAT AGAATA ACA ATG AAC ATC TTC TTT GCC TTT AGT AGT ATA ACCCGG C-3’，C-2 5’-AAC GGT TGA CCG TAT TTG TCA ACG CAC CAA CAAAAA CCT CGT TTA CGA CCC TTA CTC GGA CGG CAT TGT TTCTTT TTG TAG AAG-3’，和C-3 5’-CCT TTT TTA TCG CAA TTC GGG ATA TGA ACG CCACGC GGG GAT AAA ACG TTC AAA AAT TTT AAA TGG TTT AAGGTA TCC TCC ATC TCA CG-3’，之后將其克隆到SalI-EcoRI消化的pUC18(命名為pYZ37405)中。pYZ374100包含IGFBP-3基因的中間部分，其是通過下列過程產(chǎn)生的，即將下列寡核苷酸退火并連接。
MF1 5’-CGC GCT TAT TTA TTA CCT GCC CCA CCG GCA CCGGGT AAC GCC TCC GAA A-3’，MF2 5’-GCG AAG AGG ATC GTT CTG CGG GTT CCG TTG AATCTC CAA GTG TGA GTT CTA CCC ATC GAG TTA GCG ACC CGAAA-3’，MF3 5’-TTT CAT CCG TTG CAC TCT AAA ATC ATT ATT ATTAAA AAG GGT CAC GCA AAG GAT TCT CAA CGT TAT AAGGT-3’，MF4 5’-GGA TTA TGA AAG CCA ATC TAC CGA CAC TCA AAATTT TAG TAG TGA AAG TAA ACG TGA AAC CGA GTA CGG CCCGTG-3’，MB1 5’-TCG ACA CGG GCC GTA CTC GGT TTC ACG TTT ACTTTC ACT ACT AA-3’，MB2 5’-AAT TTT GAG TGT CGG TAG ATT GGC TTT CAT AATCCA CCT TAT AAC GTT GAG AAT CCT TTG CGT GAC CCT TTTT-3’，
MB3 5’-AAT AAT AAT GAT TTT AGA GTG CAA CGG ATG AAATTT CGG GTC GCT AAC TCG ATG GGT AGA ACT CAC ACT TGGAGA TT-3’和MB4 5’-CAA CGG AAC CCG CAG AAC GAT CCT CTT CGC TTTCGG AGG CGT TAC CCG GTG CCG GTG GGG CAG GTA ATAAAT AAG-3’，用BssHII和SalI消化連接的DNA，用Klenow填補，然后克隆到Klenow填補的XbaI消化的pUC18中使用pYZ37490片段的PCR擴增來加入SacII位點并修復克隆的人工產(chǎn)物。使用下列引物對引入限制性位點并修復錯誤pF1 5’-GGT TGT TGT TTA ACT TGT GCT TTA TCT GAA GGTCAA CCA TGT GGT ATT TAT ACT GAA CGT TGC GGT AGT GGTTTG CGT TGT CAA CCA AGC CCA GAT GAA GCT AGG-3’1233 5’-AGC GGA TAA CAA TTT CAC ACA GGA-3’和pR1 5’-TAA AGC ACA AGT TAA ACA ACA ACC ACA ACC TGGTTC TCG AAC TAA TTC AGC ACA AAC AGC TGG TGG TGG AGCACA TTG AGC TAA AGC TCG TGC ATC ACA TGG T-3’1224 5’-CGC CAG GGT TTT CCC AGT CAC GAC-3’然后將兩個PCR擴增的片段混合并使用引物對1233和1224擴增形成單一DNA。將所得的DNA片段克隆到HinDIII-SalI消化的pYZ37437中，產(chǎn)生pYZ37490。
也使用PCR擴增引入另外的SaclI位點，以便有利于下面的克隆步驟。使用下列引物擴增pYZ37490片段5pMP 5’-GAC TGC AAG CTT CCG CGG TGG TGG TGC TTCTTC TGCTGG TCT TGG A-3’和1233 5’-AGC GGA TAA CAA TTT CAC ACA GGA-3’然后將pYZ37490片段連接到HinDIII-SalI消化的pYZ37490上，形成pYZ42519。
在三種途徑的連接反應中從所說的三種片段裝配IGFBP-3基因。將pYZ42519(HinDIII-BssHII消化)、pYZ374100(BssHII-SalI消化)和pYZ37405(SalI-EcoRI消化)連接到HinDIII-EcoRI消化的pUC18上。通過作圖和測序反應確定正確裝配的克隆。
使用PCR修復克隆錯誤。使用下列引物通過擴增pYZ42509，并將得到的片段(BssHII-SalI消化)克隆到BssHII-SalI消化的pYZ42509中而產(chǎn)生BPFIX1YZMI 5’-CTC GAT TGC GCG CTT ATT TAT TAC-3’和YZM2 5’-TCT CAC GTC GAC ACG GGC CGT ACT CGG TTTCAC GTT TAC TCA GTA CTA AAA-3’將HinDIII-BssHII消化的BPFIX1與HinDIII-BssHII消化的pYZ42519連接，產(chǎn)生pYZ42529。使用下列引物對完成第二次修復715F1’5’-TGT TGG TGC GTC GAC AAA TAC GGT-3’1233 5’-AGC GGA TAA CAA TTT CAC ACA GGA-3’和715R’5’-GAC CGT ATT TGT CGA CGC ACC AAC A-3’1224 5’-CGC CAG GGT TTT CCC AGT CAC GAC-3’這樣修復了一個克隆的錯誤并加入一個SalI位點。使用引物對715F1’×1233和715R’×1224從pYZ42529擴增兩個DNA片段。將這兩個片段混合，并使用1233×1224通過PCR擴增成單一的DNA片段。用BssHI和SalI消化這一單一的片段，然后將其連接到BssHI-SalI消化的pYZ42529，產(chǎn)生pYZ50559。
通過連接pYZ50559和pDM25497的EcoRI-SacII片段產(chǎn)生IGFBP-3基因的供體構(gòu)建體pYZ42580。
將攜帶DsbA∷2A∷IGFBp-3融合基因的染色體轉(zhuǎn)化DNA轉(zhuǎn)染到大腸桿菌B1384中，將此菌株在含有100mM IAA的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以誘導INT的表達和所說的染色體轉(zhuǎn)化DNA的整合。用卡那霉素選擇整合體。所有的分離物對氨芐青霉素也是敏感的。
通過宿主細胞染色體的診斷PCR擴增進一步定性分離物。使用下列引物對的PCR擴增確認完整染色體轉(zhuǎn)化DNA在att位點上正確地整合到所說的染色體上1227 5’-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA GA-3’
BP3-607 5’-GGG ATA TGA ACG CCA CGC GGG GAT AA-3’，INT107 5’-GCG GAG AAA CCA TAA TTG CAT CTA CTC-3’BP3-559 5’-CGT GAA ACC GAG TAC GGC CCG TGT C-3’T7REV 5’-TGC TAG TTA TTG CTC AGC GG-3’TRPBR2 5’-AAG GGC TTC ATC ATC GGT AAT AGA CA-3’從單一分離物制備P1裂解物，并將其用于轉(zhuǎn)導W3110DE3以獲得卡那霉素抗性(如實施例1所述)。如實施例2所述通過與噬菌體4107劃線培養(yǎng)測定卡那霉素抗性分離物的T7 RNA聚合酶活性。通過IPTG誘導，檢測具有T7 RNA聚合酶活性的分離物此融合基因的表達情況，之后在12.5％聚丙烯酰胺凝膠上通過總細胞裂解物的SDS-PAGE分析蛋白的表達情況?？偧毎呀馕锏墓饷芏确治霰砻鱀sbA∷2A∷IGFBP-3融合蛋白的積累至22.6％(圖25A)。
實施例5IGF-I融合蛋白的產(chǎn)生使用雙盒二元系統(tǒng)產(chǎn)生包含由含有人類鼻病毒2A或3C蛋白酶之位點的序列連接的DsbA和IGF-I的融合蛋白。圖19和20以圖表的形式說明了二元質(zhì)粒和染色體轉(zhuǎn)化DNA的構(gòu)建。
為了表達DsbA∷2A∷IGF-I，連接EcoRI/Xbal消化的pPO53096和pPO57211片段以形成染色體轉(zhuǎn)化DNA(CTD-DsbA∷2A∷IGF-I)。連接pPO53097和pPO57210的EcoRI/XbaI片段以形成攜帶編碼DsbA∷3C∷IGF-I(CTD-DsbA∷3C∷IGF-I)的染色體轉(zhuǎn)化DNA。在吲哚-3-乙酸(誘導INT的表達)存在的情況下，將CTD-DsbA∷3C∷IGF-1和CTD-DsbA∷2A∷IGF-I分別轉(zhuǎn)化到B1384中。將轉(zhuǎn)化體培養(yǎng)在含有卡那霉素的培養(yǎng)基中以選擇整合體。檢測每個轉(zhuǎn)化體的9個單個的kanr菌落的氨芐青霉素敏感性。所有檢測的菌落對氨芐青霉素都是敏感的。
如實施例2所述，通過使用引物對T7F1×IGFREV和T7REV×TRPBR2的PCR擴增檢測正確整合之DNA的分離物，以確認完整融合基因的存在和B1384的att位點上的整合。
從每個轉(zhuǎn)化體的一個B1384整合體制備P1裂解物，并用于轉(zhuǎn)導W3110DE3以獲得卡那霉素抗性。如實施例2所述檢測Kanr/gal+分離物的T7 RNA聚合酶活性的存在情況。如實施例2所述使用引物對T7F1×IGFREV和ATT3×T7RNAP1通過PCR進一步檢測T7 RNA聚合酶活性，以確認所說的完整融合基因的合適整合。
然后在含有卡那霉素和四環(huán)素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)每次轉(zhuǎn)導的兩個分離物(DsbA∷2A∷IGF-I的c57265#44和c57265#54；DsbA∷3C∷IGF-I的c57264#5和c57264#28)。DsbA∷3C∷IGF-I和DsbA∷2A∷IGF-I都攜帶賦予抗性的四環(huán)素抗性等位基因(當所說的基因以高拷貝數(shù)存在時)。在四環(huán)素存在的情況下選擇所說的整合的DNA的擴增。每次轉(zhuǎn)化的兩個分離物都是Kanr/tetr。通過IPTG誘導后，檢測這些分離物的所說的融合蛋白的表達。通過總細胞裂解物的SDS-PAGE測定蛋白的表達。SDS-PAGE凝膠的光密度掃描顯示出表達DsbA∷3C∷IGF-I融合蛋白的兩個分離物積累所說的融合蛋白達總細胞蛋白的20％和20.1％，另外表達DsbA∷2A∷IGF-I的兩個分離物積累所說的融合蛋白達總細胞蛋白的25.7％和38％。
實施例6使用雙盒二元系統(tǒng)染色體表達TGF-β2使用雙盒方法產(chǎn)生編碼包含DsbA、遍在蛋白和人類TGF-J2的融合蛋白(DsbA∷遍在蛋白∷TGF-β2)的染色體轉(zhuǎn)化DNA。此融合基因和染色體轉(zhuǎn)化DNA的構(gòu)建如圖21所示。DsbA∷遍在蛋白來自于pDM25497，使用下列引物從pPC21(Madisen(1988)DNA71-8)等經(jīng)PCR擴增產(chǎn)生TGF-J2UBTGFJ2F 5’-GGG GCC GCG GTG GTG CTT TGG ATG CGGCCT ATT GCT TTA GA-3’和TGFJ2R 5’-GGG GAA TTC TTA GCT GCA TTT GCA AGACTT TAC A-3’。
用SacII-EcoRI消化pDM25497，并分離含有4.3kb片段的pUC18和DsbA∷遍在蛋白序列。純化由擴增編碼人類TGF-J2最后的112個氨基酸的pPC-21得到的0.35kb PCR產(chǎn)物，并用SacII-EcoRI消化。將這兩個片段連接產(chǎn)生pDP26，一種包含DsbA∷遍在蛋白∷TGF-J2融合基因的pUC18衍生物。pDP26是裝備用于產(chǎn)生所說的染色體轉(zhuǎn)化DNA的二元質(zhì)粒的供體構(gòu)建體。
將pDP26的融合基因連接到雙盒二元載體pDM25470和pDM25465，分別產(chǎn)生pC9DP和pA6DP。簡言之，用BamHI-SmaI消化PDM25470，并分離4.2kb片段。用EcoRI消化pDP26，以DNA聚合酶的Klenow片段補齊平端，然后用BamHI消化。連接此消化中得到的1.1kb片段。連接上述的兩個片段產(chǎn)生pC9DP。
用BamHI消化pDM25465，以Klenow補齊平端，用XbaI消化，并分離7.1kb的片段。用EcoRI消化pDP26。以Klenow片段補齊平端，用BamHI消化，分離所說的1.2kb片段。將此1.2kb片段連接到pDM25465的7.1kb片段上產(chǎn)生pA6DP。
使用從XbaI-XhoI消化的pDM4693中分離的7.2kb片段和pA6DP的融合基因(2.7kb的XbaI-XhoI片段)產(chǎn)生另一個包含四環(huán)素抗性選擇標記的二元質(zhì)粒。將這兩個片段連接產(chǎn)pA6DPIIT。連接pC9DP的XcoRI-XhaI片段(2.2kb)和pA6DPIIT的XcoRI-XhaI片段(6.4kb)以產(chǎn)生所說染色體轉(zhuǎn)化DNA(圖21)。
用所說的染色體轉(zhuǎn)化DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株B1384，將此菌株在500μm IAA存在的情況下培養(yǎng)以便誘導INT的表達和所說的染色體轉(zhuǎn)化DNA的整合。以10μg/ml卡那霉素選擇整合體。發(fā)現(xiàn)所有的分離物對卡那霉素都是敏感的。
通過宿主染色體DNA的診斷PCR擴增進一步定性分離物。使用下列引物對及前面描述過的引物T7REV和TRPBR2(參見實施例2)的PCR擴增確認所說的完整染色體轉(zhuǎn)化DNA在att位點上正確地整合到所說的染色體上1127 5’-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA GA-3’β21079 5’-GGA AAT GGA TAC ACG AAC CC-3’，和INT107 5’-GCG GAG AAA CCA TAA TTG CAT CTA CTC-3’
6HEβ2 5’-GGG GGA TCC GAT CGT GGA GGA TGA TTAAAT GCACCA CCA ccA ccA ccA CGA CGA CGA CAA AGC TTT GGATGC GGC CTA T-3’從單一分離物制備P1裂解物，并將其用于轉(zhuǎn)導W3110DE3以獲得卡那霉素抗性(如上所述)。通過在包含卡那霉素和四環(huán)素(30μg/ml)的培養(yǎng)基上培養(yǎng)卡那霉素抗性分離物而完成整合的融合基因的擴增。如實施例2所述通過與噬菌體4107劃線培養(yǎng)測定卡那霉素抗性分離物的T7RNA聚合酶活性。通過IPTG誘導就融合基因的表達檢測具有T7 RNA聚合酶活性的分離物，之后在10％聚丙烯酰胺凝膠上通過總細胞裂解物的SDS-PAGE分析蛋白的表達(圖26)。將染色體整合體的蛋白積累情況與包含多拷貝數(shù)質(zhì)粒(使用同樣的連接到編碼DsbA∷遍在蛋白∷TGF-P2融合蛋白的一個拷貝基因上的T7啟動子)的宿主細胞中所見到的蛋白積累水平比較。光密度分析表明染色體整合體的蛋白積累高達總細胞蛋白的36.7％。
實施例7使用無啟動子的CTD表達異源蛋白此實施例顯示出不攜帶啟動子的染色體轉(zhuǎn)化DNA的用途。所說的染色體轉(zhuǎn)化DNA攜帶與符合讀框地連接到編碼異源興趣蛋白質(zhì)(為實施例5的DsbA∷3C∷IGF-I融合蛋白)之DNA序列上的細菌基因(在此實施例中是lacZ或者DsbA)同源的DNA片段和選擇標記基因。所說的同源DNA編碼此細菌基因的5’區(qū)。用所說的染色體轉(zhuǎn)化DNA轉(zhuǎn)導該宿主細胞，該DNA整合到宿主細胞染色體的同源基因上，在此同源基因的啟動子和編碼異源興趣蛋白質(zhì)的DNA序列間形成可操作地連接。使用此染色體轉(zhuǎn)化DNA攜帶的選擇標記選擇整合體。經(jīng)此同源基因啟動子表達所說的異源興趣蛋白質(zhì)(圖8)。
如實施例5所述構(gòu)建編碼DNA∷3C∷IGF-I融合蛋白的DNA。然后將此融合基因符合讀框地插入到編碼lacZ基因氨基末端的前100個氨基酸的DNA片段中，形成lacZ/DsbA∷3C∷IGF-I基因。也將在實施例5中使用的親環(huán)蛋白、卡那霉素抗性和四環(huán)素抗性基因克隆到攜帶lacZ/DsbA∷3C∷IGF-I基因的質(zhì)粒中。然后用限制性核酸內(nèi)切酶切割此質(zhì)粒以除去此質(zhì)粒的復制起點、氨芐青霉素抗性基因和其它的非必需序列，然后再連接形成環(huán)形的染色體轉(zhuǎn)化DNA。用此染色體轉(zhuǎn)化DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌宿主細胞，并將轉(zhuǎn)化的宿主細胞在包含卡那霉素(10μg/ml)的培養(yǎng)基上培養(yǎng)。檢驗卡那霉素抗性分離物的氨芐青霉素活性，表明此宿主細胞攜帶整合的DNA，而不是質(zhì)粒DNA。使用PCR也檢測了Kanr分離物。使用lacZ啟動子和編碼DsbA之DNA序列的PCR引物確認完整染色體轉(zhuǎn)化DNA的整合。通過在含有卡那霉素和四環(huán)素(30μg/ml)的培養(yǎng)基上培養(yǎng)kanr分離物來選擇此整合的融合基因的擴增。通過在IPTG存在下培養(yǎng)kanr/tetr分離物來誘導所說的整合的融合基因的表達。通過SDS-PAGE測定蛋白的表達。
也可以將沒有啟動子的染色體轉(zhuǎn)化DNA整合到宿主細胞染色體的其它位點上(圖9)?？梢詷?gòu)建特定的攜帶連接到特定基因(這里所說的是DsbA)上的誘導型啟動子的一個染色體拷貝(這里所說的是T7啟動子)的宿主細胞。此宿主細胞是通過用變異的染色體轉(zhuǎn)化DNA(攜帶lacZ基因的一個拷貝、可操作地連接到DsbA基因的5’端的T7啟動子和氯霉素抗性基因)轉(zhuǎn)化所說的宿主細胞(這里所說的是也攜帶編碼T7 RNA聚合酶之基因的一個拷貝的W3110DE3)。通過在含有氯霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的W3110DE3選擇此染色體轉(zhuǎn)化DNA的整合。此染色體轉(zhuǎn)化DNA的整合產(chǎn)生包含連接到DsbA基因5’部分的T7啟動子的W3110DE3宿主細胞。然后此整合的DNA在攜帶編碼異源興趣蛋白質(zhì)之DNA序列的染色體轉(zhuǎn)化DNA的整合中成為靶。
構(gòu)建攜帶編碼異源興趣蛋白質(zhì)之DNA序列的染色體轉(zhuǎn)化DNA(這里所說的是上文及實施例5描述的DsbA∷3C∷IGF-I融合基因)。將親環(huán)蛋白、卡那霉素抗性和四環(huán)素抗性基因也克隆到此質(zhì)粒中。然后用合適的限制性酶切割此質(zhì)粒以便除去此質(zhì)粒的復制起點、氨芐青霉素抗性基因和其它非必需序列，再連接以形成環(huán)形的染色體轉(zhuǎn)化DNA。用此染色體轉(zhuǎn)化DNA轉(zhuǎn)化上述的T7-DsbA W3110DE3宿主細胞。通過在含有氯霉素和卡那霉素的培養(yǎng)基中生長選擇整合體。通過PCR檢測Kanr/camr分離物中完整的此染色體轉(zhuǎn)化DNA的整合。使用引物對T7F1×IGFREV的宿主細胞染色體DNA的PCR擴增確認了所說的完整染色體轉(zhuǎn)化DNA的整合。如實施例2所述通過與噬菌體4107劃線培養(yǎng)來檢測整合體的T7 RNA聚合酶活性。通過在含有卡那霉素、氯霉素和四環(huán)素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)T7 RNA聚合酶陽性菌落選擇整合的DNA的擴增。通過用IPTG誘導后，測定抗性分離物的蛋白質(zhì)表達。通過SDS-PAGE測定蛋白質(zhì)表達。
實施例8使用雙盒系統(tǒng)表達DsbA∷3C∷IGFBP-3融合蛋白如圖7所示使用雙盒系統(tǒng)表達編碼DsbA∷3C∷IGFBP-3融合蛋白的基因。DsbA序列最初是通過大腸桿菌染色體的DsbA基因的PCR擴增分離的；質(zhì)粒pDM25454用作此融合基因的DsbA序列源。通過合成下列兩個寡核苷酸產(chǎn)生3C蛋白酶的位點。
RV3CTA 5’-CCCGATTCTCTGGAAGTTCTGTTCCAA-3’和RV3CTB 5’-TTGGAACAGAACTTCCAGAGAATCGGGCATG-3’這兩個寡核苷酸退火形成編碼3C蛋白酶切割位點的雙鏈DNA片段。如實施例4所述通過退火和連接合成的寡核苷酸構(gòu)建IGFBP-3基因。用于構(gòu)建編碼DsbA∷3C∷IGFBP-3融合蛋白之基因的IGFBP-3序列是使用引物BP3RZ和NBP3F和模板pYZ42580產(chǎn)生的PCR擴增的DNA片段。用于產(chǎn)生攜帶編碼DsbA∷3C∷IGFBP-3融合蛋白之基因的染色體轉(zhuǎn)化DNA的兩個DNA源(pDM46947和pDM46948)的克隆如圖22所示。
使用EcoRI/XbaI片段從pDM46947和pDM46948構(gòu)建所說的染色體轉(zhuǎn)化DNA。用此染色體轉(zhuǎn)化DNA轉(zhuǎn)化生長在吲哚-3-乙酸(以便誘導INT的表達)中的B1384。通過在含有卡那霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體來選擇整合體。所有的卡那霉素抗性分離物對氨芐青霉素敏感也都是敏感的。如實施例4所述，通過使用引物對1227×BP3-607、INT107×BP3-559和T7REV×TRPBR2的PCR檢測卡那霉素抗性菌落。
從一個卡那霉素抗性菌落中制備P1裂解物，并用其轉(zhuǎn)導W3110DE3以獲得卡那霉素抗性。如實施例2所述通過與噬菌體4107劃線培養(yǎng)測定卡那霉素抗性轉(zhuǎn)化體的T7 RNA聚合酶活性的存在情況。通過在含有卡那霉素和四環(huán)素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)選擇卡那霉素抗性/T7 RNA聚合酶陽性分離物的染色體擴增。選擇一個kanr/tetr分離物并通過IPTG誘導檢測蛋白質(zhì)的表達。通過SDS-PAGE測定蛋白質(zhì)的積累情況(圖25B)。SDS-PAGE凝膠的光密度分析表明DsbA∷3C∷IGFBP-3融合蛋白的積累量平均為總細胞蛋白的27.4％。
此說明書引用的所有出版物、專利和專利申請本文以同樣的程度一并參考，好象本文所參考的每一個出版物、專利或?qū)＠暾埗继囟ê蛡€別指明的那樣。
很明顯，本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員應該能夠推測在上述描述范圍內(nèi)的此發(fā)明的等同部分。這些等同部分將包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求書按照條約第19條的修改1.一種產(chǎn)生異源興趣蛋白質(zhì)的方法，該方法包括下列步驟將染色體轉(zhuǎn)化DNA轉(zhuǎn)移到細菌宿主細胞中，其中所說的染色體轉(zhuǎn)化DNA包含至少編碼異源興趣蛋白質(zhì)基因的一個拷貝和選擇標記，其中所說的宿主細胞包含染色體；對所說的染色體轉(zhuǎn)化DNA整合到所說的宿主染色體進行選擇，形成的宿主細胞染色體包含編碼異源興趣蛋白質(zhì)的基因和側(cè)翼于重復DNA的選擇標記，所說的基因可操作地連接到在宿主細胞中有功能的啟動子上；和表達所說的基因，其中所說的基因在構(gòu)建轉(zhuǎn)化DNA的過程中，決不可操作地連接到宿主細胞的多拷貝質(zhì)粒載體的功能性啟動子上，其中所說的異源興趣蛋白質(zhì)在所說的宿主細胞中積累水平超過總細胞蛋白的0.1％。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所說的染色體轉(zhuǎn)化DNA還包含所說的在宿主細胞中有功能的啟動子，所說的啟動子可操作地連接到編碼異源興趣蛋白質(zhì)的基因上，并且其中所說的可操作的連接是由染色體轉(zhuǎn)化DNA的環(huán)化而產(chǎn)生的。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所說的宿主細胞染色體還包含宿主細胞啟動子，所說的染色體轉(zhuǎn)化DNA還包含與所說的宿主細胞啟動子下游的宿主細胞染色體片段同源的DNA序列，所說的DNA序列符合讀框地連接到所說的編碼異源興趣蛋白質(zhì)的基因上，其中所說的染色體轉(zhuǎn)化DNA的整合導致在所說的DNA序列與此宿主細胞的啟動子之間合適的連接的形成。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所說的異源興趣蛋白質(zhì)在所說的宿主細胞中的積累水平超過總細胞蛋白的1％。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所說的異源興趣蛋白質(zhì)是真核蛋白質(zhì)。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所說的異源興趣蛋白質(zhì)是哺乳動物蛋白質(zhì)。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所說的重復DNA包含所說的連接到所說的啟動子上的編碼異源興趣蛋白質(zhì)的基因。
8.權(quán)利要求1的方法，該方法還包括在所說的染色體轉(zhuǎn)化DNA整合到所說的宿主細胞的染色體上后，對所說的染色體轉(zhuǎn)化DNA的染色體擴增進行選擇。
9.一種產(chǎn)生染色體轉(zhuǎn)化DNA的方法，該方法包括將各個第一質(zhì)粒載體的限制性片段與第二質(zhì)粒載體連接，進而產(chǎn)生所說的染色體轉(zhuǎn)化DNA，所說的第一載體包含缺乏可操作連接的啟動子的編碼異源興趣蛋白質(zhì)的基因，所說的第二載體包含在宿主細胞中有功能的啟動子，其中所說的染色體轉(zhuǎn)化DNA包含選擇標記、所說的可操作地連接到所說的啟動子上的編碼異源興趣蛋白質(zhì)的基因、側(cè)翼于此基因的重復DNA，并在所說的宿主細胞中缺乏合適的復制起點。
10.一種產(chǎn)生染色體轉(zhuǎn)化DNA的方法，該方法包括將各個第一質(zhì)粒載體的限制性片段與第二質(zhì)粒載體連接，進而產(chǎn)生所說的染色體轉(zhuǎn)化DNA，所說的第一質(zhì)粒包含編碼異源興趣蛋白質(zhì)的第一基因和在宿主細胞中有功能的第一啟動子，并且其中所說的第一基因沒有與第一啟動子可操作地連接，所說的第二載體包含編碼異源興趣蛋白質(zhì)的缺乏可操作地連接的啟動子的第二基因和在宿主細胞中有功能的第二啟動子，其中所說的染色體轉(zhuǎn)化DNA包含選擇標記，但在所說的宿主細胞中沒有合適的復制起點，并且所說的第一基因與染色體轉(zhuǎn)化DNA的第二啟動子可操作地連接，所說的第二基因與染色體轉(zhuǎn)化DNA的第一啟動子可操作地連接。
11.一種染色體轉(zhuǎn)化DNA，該DNA包含可操作地連接到在宿主細胞中有功能的啟動子上的編碼異源興趣蛋白質(zhì)的基因和選擇標記，所說的選擇標記側(cè)翼于重復DNA；其中所說的編碼異源興趣蛋白質(zhì)的基因決不可操作地連接到在宿主細胞中有功能的多拷貝的質(zhì)粒載體的啟動子上。
12.一種染色體轉(zhuǎn)化DNA，該DNA包含編碼異源興趣蛋白質(zhì)的基因的兩個拷貝和選擇標記，其中的每一個拷貝都可操作地連接到在宿主細胞中有功能的啟動子上；所說的選擇標記側(cè)翼于所說的編碼異源興趣蛋白質(zhì)的基因的拷貝；所說的基因的每一個拷貝決不可操作地連接到在宿主細胞中有功能的多拷貝的質(zhì)粒載體的啟動子上。
權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)生異源興趣蛋白質(zhì)的方法，該方法包括下列步驟將染色體轉(zhuǎn)化DNA轉(zhuǎn)移到細菌宿主細胞中，其中所說的染色體轉(zhuǎn)化DNA包含至少編碼異源興趣蛋白質(zhì)基因的一個拷貝和選擇標記，其中所說的宿主細胞包含染色體；對所說的染色體轉(zhuǎn)化DNA整合到所說的宿主染色體進行選擇，形成的宿主細胞染色體包含編碼異源興趣蛋白質(zhì)的基因和側(cè)翼于重復DNA的選擇標記，所說的基因可操作地連接到在宿主細胞中有功能的啟動子上；和表達所說的基因，在多拷貝質(zhì)粒載體中構(gòu)建轉(zhuǎn)化DNA的過程中，其中所說的基因決不可操作地連接到在宿主細胞有功能的啟動子上，其中所說的非細菌興趣蛋白質(zhì)在所說的宿主細胞中積累水平超過總細胞蛋白的0.1％。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所說的染色體轉(zhuǎn)化DNA還包含所說的在宿主細胞中有功能的啟動子，所說的啟動子可操作地連接到編碼異源興趣蛋白質(zhì)的基因上，并且
3.權(quán)利要求1的方法，其中所說的宿主細胞染色體還包含宿主細胞啟動子，所說的染色體轉(zhuǎn)化DNA還包含與所說的宿主細胞啟動子下游的細菌染色體片段同源的DNA序列，所說的DNA序列符合讀框地連接到所說的編碼異源興趣蛋白質(zhì)的基因上，其中所說的染色體轉(zhuǎn)化DNA的整合導致在所說的DNA序列與此宿主細胞的啟動子之間可操作連接的形成。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所說的非細菌興趣蛋白質(zhì)在所說的宿主細胞中的積累水平超過總細胞蛋白的1％。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所說的異源興趣蛋白質(zhì)是真核蛋白質(zhì)。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所說的異源興趣蛋白質(zhì)是哺乳動物蛋白質(zhì)。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所說的重復DNA包含所說的連接到所說的啟動子上的編碼異源興趣蛋白質(zhì)的基因。
8.權(quán)利要求1的方法，該方法還包括在所說的染色體轉(zhuǎn)化DNA整合到所說的宿主細胞的染色體上后，對所說的染色體轉(zhuǎn)化DNA的染色體擴增進行選擇。
9.一種產(chǎn)生染色體轉(zhuǎn)化DNA的方法，該方法包括將各個第一質(zhì)粒載體的限制性片段與第二質(zhì)粒載體連接，進而產(chǎn)生所說的染色體轉(zhuǎn)化DNA，所說的第一載體包含缺乏可操作連接的啟動子的編碼異源興趣蛋白質(zhì)的基因，所說的第二載體包含在宿主細胞中有功能的啟動子，其中所說的染色體轉(zhuǎn)化DNA包含選擇標記、所說的可操作地連接到所說的啟動子上的編碼異源興趣蛋白質(zhì)的基因、側(cè)翼于此基因的重復DNA，并在所說的宿主細胞中缺乏合適的復制起點。
10.一種產(chǎn)生染色體轉(zhuǎn)化DNA的方法，該方法包括將各個第一質(zhì)粒載體的限制性片段與第二質(zhì)粒載體連接，進而產(chǎn)生所說的染色體轉(zhuǎn)化DNA，所說的第一質(zhì)粒包含編碼異源興趣蛋白質(zhì)的第一基因和在宿主細胞中有功能的第一啟動子，并且其中所說的第一基因與第一啟動子沒有可操作地連接，所說的第二載體包含編碼異源興趣蛋白質(zhì)的缺乏可操作地連接的啟動子的第二基因和在宿主細胞中有功能的第二啟動子，其中所說的染色體轉(zhuǎn)化DNA包含選擇標記，但在所說的宿主細胞中沒有合適的復制起點，并且所說的第一基因與染色體轉(zhuǎn)化DNA的第二啟動子可操作地連接，所說的第二基因與染色體轉(zhuǎn)化DNA的第一啟動子可操作地連接。
11.一種染色體轉(zhuǎn)化DNA，該DNA包含可操作地連接到在宿主細胞中有功能的啟動子上的編碼異源興趣蛋白質(zhì)的基因和選擇標記，所說的選擇標記側(cè)翼于重復DNA；其中所說的編碼異源興趣蛋白質(zhì)的基因決不可操作地連接到在宿主細胞中有功能的多拷貝的質(zhì)粒載體的啟動子上。
12.一種染色體轉(zhuǎn)化DNA，該DNA包含編碼異源興趣蛋白質(zhì)的基因的兩個拷貝和選擇標記，其中的每一個拷貝都可操作地連接到在宿主細胞中有功能的啟動子上；所說的選擇標記側(cè)翼于所說的編碼異源興趣蛋白質(zhì)的基因的拷貝；所說的基因的每一個拷貝決不可操作地連接到在宿主細胞中有功能的多拷貝的質(zhì)粒載體的啟動子上。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于通過將編碼興趣異源蛋白的基因的一個拷貝插入到宿主細胞(如大腸桿菌)的染色體中來產(chǎn)生興趣異源蛋白的組合體和方法。使用染色體轉(zhuǎn)化DNA(環(huán)形的非自我復制的DNA)將編碼興趣異源蛋白的基因整合到宿主細胞染色體。所說的染色體轉(zhuǎn)化DNA包含至少一個選擇標記,還可以包含或不包含側(cè)翼于選擇標記的重復DNA序列,其有利于整合的DNA的染色體擴增。所說的編碼興趣蛋白質(zhì)的基因可以在整合到宿主細胞的染色體之后表達;可以在所說的基因表達之前進行染色體擴增的選擇。
文檔編號C12R1/19GK1190403SQ96195423
公開日1998年8月12日 申請日期1996年6月5日 優(yōu)先權(quán)日1995年6月7日
發(fā)明者D·馬斯卡倫哈斯, P·S·奧爾桑 申請人:塞爾特里克斯藥物公司