一種人乳鐵蛋白雙抗夾心酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及一種人乳鐵蛋白雙抗夾心酶聯(lián)免疫檢測 試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] "碩鼠"的問世（Palmiter et al.，1982)，加速了轉(zhuǎn)基因生物的研究?？寺【d羊"多 莉"的誕生（Wilmut et al.，1997)，促進了轉(zhuǎn)基因技術(shù)在哺乳動物方面的廣泛應(yīng)用。目前研 制成功多種用于生產(chǎn)藥用或食用蛋白、提高瘦肉率、改善營養(yǎng)、增強抗病力的轉(zhuǎn)基因豬、牛、 羊（Schnieke et al·，1997 !Toledo et al·，2006)，其潛在的經(jīng)濟效益和社會效益巨大，具 有良好的商品化前景。但是由于轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品存在風(fēng)險，轉(zhuǎn)基因生物及產(chǎn)品的管理 一直受到各國政府的高度重視。
[0003] 為了保護人類自身的健康和生存環(huán)境，包括我國在內(nèi)的許多國家相繼制定了轉(zhuǎn)基 因生物安全法規(guī)，對轉(zhuǎn)基因生物及產(chǎn)品采用標識制度，對轉(zhuǎn)基因食品進出境進行嚴格管理。 要使這些法規(guī)、制度得以順利實施，需要有效的檢測技術(shù)做支撐。目前轉(zhuǎn)基因生物及其加工 食品的檢測方法主要包括基因水平的檢測和蛋白水平的檢測，在蛋白檢測方面，目前人乳 鐵蛋白的檢測方法以ELISA檢測法為主，但是現(xiàn)有的抗人乳鐵蛋白的抗體因敏感性和特異 性較低，無法滿足雙抗夾心酶聯(lián)免疫檢測人乳鐵蛋白的要求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種敏感性和特異性更高的雙抗夾心酶聯(lián)免疫檢測人乳鐵 蛋白的技術(shù)方案。
[0005] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種人乳鐵蛋白雙抗夾心酶聯(lián)免疫檢測試劑 盒，其中，該試劑盒包括：酶聯(lián)板、包被緩沖液、第一單克隆抗體、封閉液、酶標記的第二單克 隆抗體、顯色底物和終止液；所述第一單克隆抗體由保藏編號為CGMCC NO. 10594的雜交瘤 細胞株分泌得到，所述第二單克隆抗體由保藏編號為CGMCC NO. 10595的雜交瘤細胞株分泌 得到。
[0006] 通過上述技術(shù)方案，本發(fā)明能夠通過雙抗夾心酶聯(lián)免疫檢測方法，對人乳鐵蛋白 的檢測取得Ing/mL的靈敏度，對牛乳鐵蛋白和羊乳鐵蛋白不呈現(xiàn)交叉反應(yīng)，并且對人溶菌 酶轉(zhuǎn)基因牛、人α-乳清白蛋白轉(zhuǎn)基因牛不呈現(xiàn)交叉反應(yīng)，具有較高的敏感度和特異性。
[0007] 本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點將在隨后的【具體實施方式】部分予以詳細說明。
[0008] 生物材料保藏
[0009] 本發(fā)明的一株雜交瘤細胞株是本發(fā)明的發(fā)明人自行融合篩選得到的，其保藏編號 為CGMCC NO. 10594,保藏日期為2015年5月8日，保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委 員會普通微生物中心，地址位于北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究 所，分類命名為雜交瘤細胞株。
[0010] 本發(fā)明的另一株雜交瘤細胞株是本發(fā)明的發(fā)明人自行融合篩選得到的，其保藏編 號為CGMCC NO. 10595,保藏日期為2015年5月8日，保藏單位為中國微生物菌種保藏管理 委員會普通微生物中心，地址位于北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研 究所，分類命名為雜交瘤細胞株。
【具體實施方式】
[0011] 以下對本發(fā)明的【具體實施方式】進行詳細說明。應(yīng)當理解的是，此處所描述的具體 實施方式僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。
[0012] 本發(fā)明提供了一種人乳鐵蛋白雙抗夾心酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其中，該試劑盒包 括：酶聯(lián)板、包被緩沖液、第一單克隆抗體、封閉液、酶標記的第二單克隆抗體、顯色底物和 終止液；所述第一單克隆抗體由保藏編號為CGMCC NO. 10594的雜交瘤細胞株分泌得到，所 述第二單克隆抗體由保藏編號為CGMCC NO. 10595的雜交瘤細胞株分泌得到。
[0013] 其中，為了提高定量檢測的準確性并提高試劑盒的易用性，優(yōu)選地，該試劑盒還含 有人乳鐵蛋白標準品。其中，所述人乳鐵蛋白標準品可以為從人乳純化出來的人乳鐵蛋白， 也可以是轉(zhuǎn)人乳鐵蛋白基因的牛乳中純化出來的重組人乳鐵蛋白，還可以是轉(zhuǎn)人乳鐵蛋白 基因的大米中純化出來的重組人乳鐵蛋白。
[0014] 其中，所述包被緩沖液可以為常規(guī)的ELISA包被緩沖液，例如為含有0. 05-0. 1體 積％吐溫-20的磷酸鹽緩沖液。
[0015] 其中，所述封閉液可以為常規(guī)的ELISA封閉液，例如為含有0. 05-0. 1體積％吐 溫-20和5-10重量％酪蛋白的磷酸鹽緩沖液。
[0016] 其中，對第二單克隆抗體的酶標記可以為本領(lǐng)域常規(guī)的酶標記方案，例如，可以按 照Pierce HRP標記試劑盒（Cat No31488)的說明書中的方法進行酶標記。優(yōu)選地，酶標記 的第二單克隆抗體的標記酶為辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶，當標記酶為辣根過氧化物酶 時，所述顯色底物包括顯色底物A和顯色底物B，所述顯色底物A為過氧化氫或過氧化脲，所 述顯色底物B為鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺，所述終止液為l-2mol/L的硫酸或鹽酸緩沖液； 當標記酶為堿性磷酸酶時，所述顯色底物為對硝基磷酸鹽緩沖液，所述終止液為l_2mol/L 氫氧化鈉。
[0017] 本發(fā)明的試劑盒的使用方法可以包括：將第一單克隆抗體（人乳鐵蛋白單克隆抗 體5C5,保藏編號為CGMCC NO. 10594)用包被緩沖液稀釋后包被于酶聯(lián)板上，然后用包被緩 沖液洗去多余的第一單克隆抗體；接著用封閉液封閉經(jīng)包被的酶聯(lián)板，然后用包被緩沖液 洗板以洗去多余的封閉液；接著加入待檢測樣品，然后用包被緩沖液洗板以洗去多余的待 檢測樣品；接著加入酶標記的第二單克隆抗體（人乳鐵蛋白單克隆抗體3B4,保藏編號為 CGMCC NO. 10595)，然后用包被緩沖液洗板以洗去多余的酶標記的第二單克隆抗體；接著加 顯色底物顯色，然后加終止液終止反應(yīng)；測定0D450值；若待測樣品中含有人乳鐵蛋白，則 會有顯色反應(yīng)，若不含人乳鐵蛋白，則呈陰性?？梢允褂锰荻认♂尯蟮娜巳殍F蛋白標準品替 代被檢測樣品，以獲得標準曲線，然后通過與標準曲線比對，定量檢測人乳鐵蛋白。
[0018] 本發(fā)明的試劑盒的可能原理包括：第一單克隆抗體首先結(jié)合至酶聯(lián)板上，而后 封閉液封閉酶聯(lián)板上的空白位點，接著待檢測樣品若含有人乳鐵蛋白，則人乳鐵蛋白與第 一單克隆抗體結(jié)合，然后酶標記的第二單克隆抗體與人乳鐵蛋白結(jié)合，形成第一單克隆抗 體-人乳鐵蛋白-酶標記的第二單克隆抗體復(fù)合體，而后通過顯色底物顯示出復(fù)合體中酶 的存在，從而顯示出人乳鐵蛋白的存在，由此進行人乳鐵蛋白的定性和定量分析。
[0019] 其中，用于構(gòu)建本發(fā)明的試劑盒的第一單克隆抗體和第二單克隆抗體需要分別針 對人乳鐵蛋白的不同抗原表位并且具有配對檢測效果。用于構(gòu)建本發(fā)明的試劑盒的第一單 克隆抗體和第二單克隆抗體可以通過免疫膠體金試紙法進行篩選。
[0020] 以下，通過實施例進一步詳細說明本發(fā)明。
[0021] 實施例1
[0022] 本實施例用于說明人乳鐵蛋白單克隆抗體對的篩選。
[0023] 人乳鐵蛋白（hLF)的蛋白序列如NCBI Genbank序列號：U95626所示。按照 文獻(Penghua Yang, et al. , Cattle Mammary Bioreactor Generated by a Novel Procedure of Transgenic Cloning for Large-Scale Production of Functional Human Lactoferrin.，PLoS 0NE，2008,3(10)，e3453)中的方法獲得人乳鐵蛋白（hLF)的轉(zhuǎn)基因乳 牛。
[0024] 向轉(zhuǎn)基因乳牛肌肉注射催乳針（購自西安草灘制藥廠生產(chǎn)的不孕牛催乳針，該產(chǎn) 品為盒裝，I號針10支，II號針3支）進行催乳，其中I號針連續(xù)肌肉注射10天，每日一 次。II號針在第13、15、17天各注射一支。從注射7天開始每天溫水按摩轉(zhuǎn)基因乳牛乳房， II號針注射完畢后開始人工擠乳兩周，每天兩次，得到奶樣。
[0025] 將奶樣于4°C、4500rpm離心15min后取出，可見上層為凝固的乳脂，將下層液體吸 出并轉(zhuǎn)移到另一個離心管。將脫脂乳用IM鹽酸調(diào)節(jié)pH值至3. 8-4. 6,使得酪蛋白沉淀出 來，其中脫脂乳與IM的HCl的體積比為25 :1 ;然后將調(diào)好pH值的奶樣于4°C、5000rpm離 心12min。取出，沉淀為酪蛋白，上清液為乳清蛋白，將上清液轉(zhuǎn)移到另一離心管。用IM的 NaOH水溶液將上清液的pH值調(diào)回至7. 5，其中上清液與IM的NaOH水溶液的體積比為25:1。 將調(diào)好PH值的奶樣于4°C、5000rpm離心15min，將離心后的上清收集，得到純化的乳清。
[0026] 使用 HiLoadTM 16/10SP Sepharose High performance 色譜柱，將其預(yù)先用 0· 4M 的NaCl、20mM的Na3PO4 (pH7. 5)平衡5個柱體積。15ml脫脂乳通過注射器上樣，進入上樣環(huán)。 用0. 4M的NaCl、20mM的Na3PO4 (pH7. 5)平衡5個柱體積，未結(jié)