本發(fā)明涉及一種突變檢測試劑盒，特別涉及一種多點突變單管快速檢測試劑盒。

背景技術(shù)：

點突變與許多腫瘤有著密切的關(guān)系，已有研究表明，某些基團位點的點突變會使腫瘤的發(fā)生率大幅提高。以表皮生長因子受體(EGFR)為例，EGFR是一種人細胞膜表面的糖蛋白受體，該基因位于人類7號染色體，由28個外顯子組成。EGFR具有酪氨酸激酶活性，是原癌基因c-erbB1的表達產(chǎn)物，其酪氨酸激酶功能區(qū)由外顯子18-24編碼。EGFR主要通過RAS-RAF-MEK-ERK-MAPK信號通路和PI3K-PDK信號通路將胞外信號轉(zhuǎn)化為胞內(nèi)信號，從而對細胞的生長、增殖、分化和凋亡產(chǎn)生作用。

肺癌是我國發(fā)病率和死亡率最高的腫瘤，其中非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)約占所有肺癌的80％，而我國NSCLC患者中50％以上存在EGFR基因體細胞突變。現(xiàn)有研究表明EGFR基因突變存在多種形式，部分突變與EGFR酪氨酸激酶抑制劑如吉非替尼和厄洛替尼的有效相關(guān)，部分突變與EGFR酪氨酸激酶抑制劑的耐藥相關(guān)。因此，在使用酪氨酸激酶抑制劑進行靶向治療前，2011年NCCN《非小細胞肺癌臨床實踐指南(中國版)》推薦進行EGFR基因突變檢測，從而基于患者腫瘤DNA中EGFR基因的突變狀態(tài)來指導(dǎo)臨床制定合適的治療方案。

由于EGFR基因藥物敏感的突變點眾多，常見的如下表所示：

目前普遍認為需檢測28個突變位點?，F(xiàn)有市面上的熒光PCR檢測試劑盒普遍使用7個PCR管進行檢測，分析過程繁瑣而且沒有必要。同時整個檢測流程較慢，至少需要2天才能出結(jié)果。

有必要開發(fā)出一種更為快速高效的多點突變的檢測試劑盒，特別是一種更為快速高效的EGFR多點突變的檢測試劑盒。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種高效的多點突變單管快速檢測方法及EGFR多點突變單管快速檢測試劑盒。

本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

多點突變單管快速檢測方法，包括如下步驟：

1)設(shè)計針對不同點突變的ARMS引物及對應(yīng)的下游引物、中介連接引物、通用熒光探針及其淬滅探針；其中，中介連接引物由通用序列部分和特異序列部分構(gòu)成，通用序列部分與通用熒光探針部分序列互補，特異序列部分與點突變下游的部分序列互補；

2)將ARMS引物及對應(yīng)的下游引物、中介連接引物、通用熒光探針及其淬滅探針與熱啟動快速Taq酶系統(tǒng)混合，擴增；

3)檢測反應(yīng)體系的熒光變化，確定是否存在點突變。

ARMS引物對應(yīng)的下游引物、中介連接引物、通用熒光探針優(yōu)為簡并的，即一條下游引物、中介連接引物、通用熒光探針可以對應(yīng)于多條。

作為上述方法的進一步改進，通用熒光探針上連接熒光基團的核苷酸和淬滅探針上連接淬滅基團的核苷酸在互補配對后的間距不超過4個核苷酸，進一步的，不超過3個、2個、1個或連接在相互配對的兩個核苷酸上。

作為上述方法的進一步改進，中介連接引物中與突變位點下游的部分序列互補的核酸數(shù)量不少于5bp，不少于10bp，特別的，互補的核酸數(shù)量為15～30bp。

作為上述方法的進一步改進，中介連接引物中與通用熒光探針部分核酸互補配對的核酸數(shù)量不少于5bp，不少于10bp，特別的，互補的核酸數(shù)量為15～45bp。

作為上述方法的進一步改進，通用熒光探針的一端連接有保護核酸序列。

本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明的發(fā)明，操作簡單，可以定性檢測出多點突變的存在。本發(fā)明的檢測方法中使用的引物設(shè)計難度低，大幅降低了引物合成的成本。

本發(fā)明檢測方法克服了現(xiàn)有ARMS技術(shù)的局限性，大大提高了其檢測通量。

本發(fā)明的檢測方法實現(xiàn)了多管檢測反應(yīng)的簡易性，1管反應(yīng)取代了之前的多管檢測。節(jié)省人力物力。

附圖說明

圖1是本發(fā)明檢測方法的原理圖；

圖2是等濃度模板在不同Taq酶反應(yīng)條件下的PCR擴增曲線。

具體實施方式

多點突變單管快速檢測方法，包括如下步驟：

1)設(shè)計針對不同點突變的ARMS引物及對應(yīng)的下游引物、中介連接引物、通用熒光探針及其淬滅探針；其中，中介連接引物由通用序列部分和特異序列部分構(gòu)成，通用序列部分與通用熒光探針部分序列互補，特異序列部分與點突變下游的部分序列互補；

2)將ARMS引物及對應(yīng)的下游引物、中介連接引物、通用熒光探針及其淬滅探針與熱啟動快速Taq酶系統(tǒng)混合，擴增；

3)檢測反應(yīng)體系的熒光變化，確定是否存在點突變。

作為上述方法的進一步改進，通用熒光探針上連接熒光基團的核苷酸和淬滅探針上連接淬滅基團的核苷酸在互補配對后的間距不超過4個核苷酸，進一步的，不超過3個、2個、1個或連接在相互配對的兩個核苷酸上。通用熒光探針和淬滅探針也可以是在同一條具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的核酸序列。

作為上述方法的進一步改進，中介連接引物中與突變位點下游的部分序列互補的核酸數(shù)量不少于5bp，不少于10bp，特別的，互補的核酸數(shù)量為15～30bp。

作為上述方法的進一步改進，中介連接引物中與通用熒光探針部分核酸互補配對的核酸數(shù)量不少于5bp，不少于10bp，特別的，互補的核酸數(shù)量為15～45bp。

互補序列的存在，有利于保證引物間存在足夠的親和力，保證檢測結(jié)果的可靠性。

作為上述方法的進一步改進，通用熒光探針的一端連接有保護核酸序列。保護序列的作用在于防止探針的關(guān)鍵序列不被反應(yīng)體系中無意引入的核酸外切酶過早切除。保護序列不與待測序列、引物等互補配對，可以是簡單重復(fù)序列，如多個A、T、C、G等。

下面結(jié)合附圖，進一步說明本發(fā)明的檢測原理。

以EGFR突變點S768I為例，該點的野生型為G，突變型為T，在PCR過程中，首先使用1對引物，含1條針對突變點的ARMS引物(引物最后一個堿基為T)和下游引物。該引物在快速酶的作用下特異性的擴增出突變位點T。野生型位點G不被擴增，如圖1a所示；

當特異性擴增發(fā)生后，在ARMS引物的引導(dǎo)下，快速Taq酶沿著DNA模板，向5’-3’方向移動并水解中介連接引物的序列介導(dǎo)區(qū)域，而中介連接引物的探針互補區(qū)域則被釋放，如圖1b所示；

釋放出來的探針互補區(qū)域，基于堿基互補配對原則，與通用熒光探針發(fā)生互補，在淬滅基團的存在下，熒光基團的熒光被淬滅，如圖1c所示；

快速Taq酶通過中介連接引物的探針互補區(qū)域，向5’-3’方向移動，水解淬滅基團，從而淬滅基團遠離熒光基團，從而PCR反應(yīng)產(chǎn)生了熒光，如圖1d所示。

因此，只要多個個突變位點的ARMS引物、下游引物和中介連接引物，1組通用熒光探針與通用淬滅互補探針，可以置于一個PCR反應(yīng)管中，即可以檢測出樣本中是否存在點突變，顯著提高了ARMS法的檢測通量。

EGFR多點突變單管快速檢測試劑盒中使用的ARMS引物的序列如下：

ARMS引物1：TTCAAAAAGATCAAAGTGCTGA(SEQ ID NO：1)

ARMS引物2：TTCAAAAAGATCAAAGTGCTGT(SEQ ID NO：2)

ARMS引物3：CAAAAAGATCAAAGTGCTGGC(SEQ ID NO：3)

ARMS引物4：TTCCCGTCGCTATCAAAACATC(SEQ ID NO：4)

ARMS引物5：TTCCCGTCGCTATCAAAATATC(SEQ ID NO：5)

ARMS引物6：TTCCCGTCGCTATCAAGACATC(SEQ ID NO：6)

ARMS引物7：TCCCGTCGCTATCAAGTCT(SEQ ID NO：7)

ARMS引物8：CCGTCGCTATCAAGGTACA(SEQ ID NO：8)

ARMS引物9：CGTCGCTATCAAGGCATCTC(SEQ ID NO：9)

ARMS引物10：TCCCGTCGCTATCAAGTCT(SEQ ID NO：10)

ARMS引物11：CCGTCGCTATCAAGGAGCCAA(SEQ ID NO：11)

ARMS引物12：CCGTCGCTATCAAGGAGCAAT(SEQ ID NO：12)

ARMS引物13：CCGTCGCTATCAAGGATCC(SEQ ID NO：13)

ARMS引物14：CCGTCGCTATCAAGGAAGC(SEQ ID NO：14)

ARMS引物15：CCGTCGCTATCAAGGAACCAA(SEQ ID NO：15)

ARMS引物16：CCGTCGCTATCAAGGAACCAT(SEQ ID NO：16)

ARMS引物17：CGTCGCTATCAAGGAATCTC(SEQ ID NO：17)

ARMS引物18：CCGTCGCTATCAAGGAACCG(SEQ ID NO：18)

ARMS引物19：CCGTCGCTATCAAGGAACAG(SEQ ID NO：19)

ARMS引物20：GTCGCTATCAAGGAATCATC(SEQ ID NO：20)

ARMS引物21：CGTCGCTATCAAGGAATCTC(SEQ ID NO：21)

ARMS引物22：GTCGCTATCAAGGAATTCGA(SEQ ID NO：22)

ARMS引物23：AGCCTACGTGATGGCCAT(SEQ ID NO：23)

ARMS引物24：CCAGCGTGGCCAGCGT(SEQ ID NO：24)

ARMS引物25：CCAGCGTGGACGGTAAC(SEQ ID NO：25)

ARMS引物26：GACAATTCCCACCACGTGT(SEQ ID NO：26)

ARMS引物27：CACCGTGCAGCTCATCAT(SEQ ID NO：27)

ARMS引物28：AGATCACAGACTTTGGGCG(SEQ ID NO：28)

ARMS引物29：GTTGGGCTGGCCAAACA；(SEQ ID NO：29)

ARMS引物1和2對應(yīng)的下游引物為Y1：AGACCATGAGAGGCCCTG(SEQ ID NO：30)；

ARMS引物3對應(yīng)的下游引物為Y2：AGATGATGGAAATATACAGCTTGC(SEQ ID NO：31)；

ARMS引物4～22對應(yīng)的下游引物為Y3：TGTGGAGATGAGCAGGGT(SEQ ID NO：32)；

ARMS引物23～27對應(yīng)的下游引物為Y4：TTGTCTTTGTGTTCCCGGA(SEQ ID NO：33)；

ARMS引物28和29對應(yīng)的下游引物為Y5：GGCTGACCTAAAGCCACC(SEQ ID NO：34)；

ARMS引物1～3對應(yīng)的中介引物為Z1：ACCTCGTTCTGGGCTCTACTCCGGTGCGTTCGGCACGGTGTATA(SEQ ID NO：35)；

ARMS引物4～22對應(yīng)的中介引物為Z2：ACCTCGTTCTGGGCTCTACTCCATGGCTCTGAACCTCA(SEQ ID NO：36)；

ARMS引物23～27對應(yīng)的中介引物為Z3：ACCTCGTTCTGGGCTCTACCTGCCTCCTGGACTATG(SEQ ID NO：37)；

ARMS引物28和29對應(yīng)的中介引物為Z4：ACCTCGTTCTGGGCTCTACCCATGCAGAAGGAGGCAA(SEQ ID NO：38)。

特通用熒光探針的序列為：TC(dT-FAM)GCGGTGTTGGTGTAGAGCCCAGAACGAGGTTTTTTTTTTTTTTTTTT(SEQ ID NO：39)，對應(yīng)的淬滅序列為：5’-BHQ-CCGCAGA-3’。

實施例1

EGFR多點突變單管快速檢測試劑盒，主成分如下：

DNA提取液：

50mM NaOH、10mMTris-HCl(PH8.0)、1％NP-40、6％Chelex、0.1mM EDTA(PH8.0)組成

熱啟動快速Taq酶系統(tǒng)：

3U的熱啟動Taq，0.5ul的dNTPs(25mM)

引物：

EGFR多點突變單管快速檢測試劑盒使用的ARMS引物及對應(yīng)的下游引物如下表：

中介連接引物：

通用熒光探針對：

通用熒光探針：5’-TC(dT-FAM)GCGGTGTTGGTGTAGAGCCCAGAACGAGGTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’

通用淬滅探針：5’-BHQ-CCGCAGA-3’。

使用方法：

DNA提?。?/p>

取2片10μm的FFPE組織切片，刮取下來后放入到1.5ml離心管中，再加入120μl的DNA提取液，100℃煮沸10分鐘后，將離心管12000rpm離心5分鐘，取10μl的上清加入到PCR反應(yīng)管中；

快速PCR：

50μl熒光PCR體系中，3U的快速Taq酶，10mM Tris-HCL，50mM KCL，0.5U的UNG酶，0.2mM dNTPS(U)，3mM MgCl₂。通用熒光探針與通用淬滅互補探針各1μm，28個突變位點的ARMS引物、下游引物和中介連接引物各1μm。95度5min后，95℃5秒，58℃31秒，循環(huán)數(shù)為40循環(huán)。

監(jiān)測反應(yīng)體系的熒光變化，如存在點突變，則熒光信號會增長，如圖2所示。

<110> 廣州和實生物技術(shù)有限公司

<120> 一種多點突變單管快速檢測方法及試劑盒

<130>

<140> CN2014104295064

<141> 2014-08-28

<160> 39

<170> PatentIn version 3.5

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