微生物抗藥性的質(zhì)譜快速檢測的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于測定微生物對抗生素的抗藥性的方法和儀器，所述微生物特別是產(chǎn)生β?內(nèi)酰胺酶的微生物。通過在質(zhì)譜樣品載板上培養(yǎng)與一定劑量的合適的抗生素(例如β?內(nèi)酰胺抗生素亞胺培南)混合的少量微生物，然后以質(zhì)譜法直接測量微生物酶對抗生素的分解，所述方法在一個小時內(nèi)即可測定微生物的抗藥性。
【專利說明】
微生物抗藥性的質(zhì)譜快速檢測
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及微生物對抗生素的抗藥性的測定，所述微生物特別是產(chǎn)生內(nèi)酰胺酶 的那些微生物。
【背景技術】
[0002] 出版物冊 2011154517厶1(]\1.1(〇81^26￥&、1(.]\1;[(311611]1&1111和1(.3卩&1'13161')及同族出版 物DE 102010023452B4和US 20130095511A1介紹了一種微生物內(nèi)酰胺酶抗藥性測定方 法，其基于質(zhì)譜測量微生物內(nèi)酰胺酶對內(nèi)酰胺抗生素(或具有相似結構的底物)的酶催 化改變。為此，向含有內(nèi)酰胺抗生素(或具有相似結構的底物)的溶液中引入細菌，并進行 培養(yǎng)例如大約三小時。然后優(yōu)選通過離心或過濾分離細菌。之后將一至兩微升不含細菌的 溶液施加至質(zhì)譜樣品載板上，干燥并包被基質(zhì)溶液以進行基質(zhì)輔助激光解吸電離(MALDI)。 在具有MALDI離子源的飛行時間質(zhì)譜儀中測量生成質(zhì)譜，可通過它來確定是否存在經(jīng)酶催 化改變的抗生素或底物，特別是內(nèi)酰胺環(huán)的水解分裂，這表示微生物具有抗藥性。
[0003] 在出版物WO 2012/023845Al(Luider等人）中介紹了一種類似方法，其大體上通過 質(zhì)譜測定微生物酶導致的抗生素的改變。
[0004] 這些文件所述的方法都有較多的單獨步驟，特別是離心或過濾，這既需要很長時 間，通常又涉及人工操作過程。已知方法通常需要三個小時左右。對于工作量更小、更易于 自動化且速度更快、能夠以較少樣品數(shù)量產(chǎn)生高樣品通量的微生物抗藥性測定方法，始終 存在需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的
[0006] 本發(fā)明目的是提供這樣的方法和儀器，通過該方法和儀器，可以通過質(zhì)譜，只使用 很少的單獨步驟，優(yōu)選在一個小時內(nèi)，測定基于抗生素的酶催化改變的微生物抗藥性。
[0007] 發(fā)明簡述
[0008] 本發(fā)明提供一種用于測定微生物樣品對抗生素的抗藥性方法，其中在樣品載板的 測試點上在一定體積的液體中將所述微生物樣品和所述抗生素混合，并且在所述測試點上 通過質(zhì)譜測量分析所述抗生素是否經(jīng)酶催化改變。質(zhì)譜測量的質(zhì)量范圍優(yōu)選小于1000道爾 頓，特別是介于250至750道爾頓。
[0009] 抗生素可以是選自青霉素類(芐青霉素、口服青霉素(oral penicillins)、氨基青 霉素、異惡?；嗝顾兀?8〇13〇丫1?611；[0；[11；[118)、酰氨基青霉素）、頭孢菌素類、單環(huán)0-內(nèi)酰 胺類或碳青霉烯類的組中的內(nèi)酰胺抗生素。微生物樣品還可以與包含內(nèi)酰胺抗生素和 內(nèi)酰胺酶抑制劑的復方藥品混合，所述復方藥品例如克拉維酸與阿莫西林的組合、他佐 巴坦與哌拉西林的組合、或舒巴坦與內(nèi)酰胺抗生素的組合。微生物樣品還可以在測試點 上與多于一種抗生素混合。
[0010] 例如可通過由相應的質(zhì)量信號所顯示出的抗生素減少或一種或多種分解產(chǎn)物的 增多，或二者，來測定抗生素的酶催化改變。特別地，可通過與參考物質(zhì)的質(zhì)量信號進行比 較來確定抗生素的減少。在這種情況中，在微生物樣品與抗生素混合之前，測試點可以已經(jīng) 包被有參考物質(zhì)。還可以在它們混合之后或在制備適合質(zhì)譜測量的樣品（例如MALDI樣品） 期間添加參考物質(zhì)。
[0011] 在優(yōu)選實施方案中，在具有MALDI離子源的質(zhì)譜儀(特別是飛行時間質(zhì)譜儀）中進 行質(zhì)譜測量，其中質(zhì)譜樣品載板是平的并具有多個測試點。
[0012] 在另一實施方案中，微生物樣品優(yōu)選具有完整的微生物細胞。在根據(jù)本發(fā)明的方 法中，微生物細胞在一定體積的液體中的培養(yǎng)期小于一小時，例如優(yōu)選僅約半小時。在一定 體積的液體中的培養(yǎng)優(yōu)選在室溫下進行。施加至測試點上的微生物細胞的數(shù)目優(yōu)選介于 10 3至107。當使用完整的微生物細胞時，在制備用于質(zhì)譜測量的樣品期間，特別是制備MALDI 樣品期間，微生物細胞仍保持完整(即未被消化)是有利的。
[0013] 微生物樣品可包括取自平板培養(yǎng)基(例如瓊脂平板)的菌落的完整微生物細胞，或 通過離心或過濾從液體培養(yǎng)基分離出的完整微生物細胞。特別地，液體營養(yǎng)基可以是陽性 血液營養(yǎng)基，其中血細胞優(yōu)選在離心或過濾前被破壞。微生物樣品還可以是未經(jīng)培養(yǎng)的體 液樣品，例如血液樣品、尿液樣品、或脊髓液樣品或涂片樣品。涂片樣品是取自傷口或粘膜 (口、鼻、尿道、陰道、肛門）表面的用于分析的內(nèi)源物質(zhì)。
[0014] 在另一實施方案中，微生物樣品包括被消化的微生物細胞(細胞裂解產(chǎn)物），在這 種情況中，也可在測試點進行微生物消化。如果通過在測試點制備MALDI樣品來消化微生物 樣品中的完整微生物細胞，或者如果微生物樣品是細胞裂解產(chǎn)物，那么在質(zhì)譜測量中還可 采集微生物蛋白質(zhì)的質(zhì)量信號。這些信號還可用于微生物分類學鑒定和/或在其抗藥性方 面對其進行進一步表征。微生物樣品還可通過以下方法獲得，使用不含任何抗生素的液體 對平板培養(yǎng)基上的菌落進行微生物細胞采樣，然后將樣品液體(作為微生物樣品）與樣品載 板上的抗生素混合。
[0015] 在另一實施方案中，測試點上的所述一定體積的液體小于10微升，優(yōu)選小于5微 升，特別是介于1至3微升。在樣品載板的測試點上混合微生物樣品和抗生素之后，樣品載板 優(yōu)選保持在潮濕環(huán)境中，或向測試點添加額外的液體，以防止所述一定體積的液體在指定 培養(yǎng)期或反應時間內(nèi)干燥殆盡。
[0016] 此外，本發(fā)明還提供了用于微生物樣品的抗藥性質(zhì)譜測定的樣品載板，其中所述 樣品載板具有多個測試點，并且至少一個測試點包被有一定劑量的一種或多種抗生素。不 同的測試點可以包被有不同的抗生素。此外，每個測試點還可包被有一種或多種參考物質(zhì)。
[0017] 原則上，可以使用任何質(zhì)譜儀進行質(zhì)譜測量，例如四極過濾器(特別是三重四極質(zhì) 譜儀）、正交離子注入飛行時間質(zhì)譜儀(0T0F)、離子回旋共振質(zhì)譜儀（ICR-MS)、靜電Kingdon 質(zhì)譜儀或離子阱質(zhì)譜儀。特別有利的是，使用目前常用于鑒定微生物(特別是細菌）、并且通 常在線性模式下運行且無反射器的相同MALDI飛行時間質(zhì)譜儀。
[0018] 本發(fā)明優(yōu)點在于，僅使用少量微生物和少量體積的液體，只需要很少的簡單的單 獨步驟，特別是非?？焖?。特別地，根據(jù)本發(fā)明的方法使得不需要通過離心或過濾從一定體 積的液體中分離出微生物細胞，即可實現(xiàn)抗藥性質(zhì)譜測定。
【附圖說明】
[0019]圖1上方的MALDI質(zhì)譜顯示亞胺培南的質(zhì)量信號，其在與e-內(nèi)酰胺酶陰性株系孵育 后尚未分解（由箭頭標出）。下方的MALDI質(zhì)譜示出在樣品載板上與內(nèi)酰胺酶陽性株系孵 育半小時后，亞胺培南的質(zhì)量信號消失。豎線示出參考物質(zhì)的位置。
[0020]圖2為示出六個e-內(nèi)酰胺酶陽性株系和兩個e-內(nèi)酰胺酶陰性株系的商logRQ的箱 線圖，各陽性株系的l〇gRQ>0.4，各陰性株系的logRQ〈0.2。示出了多次測量的中位數(shù)和跨度 (spread)〇
[0021 ]圖3示例性示出了微量滴定板大小的具有96個測試點（10)的樣品載板，其包被有 一定劑量的抗生素。對于其他類型的質(zhì)譜儀，也有不同的樣品載板(通常更小）。特別有利的 是其測試點（10)具有嵌入疏水環(huán)境中的親水表面的樣品載板。所加入的任何液體即會自動 流到測試點邊緣。
【具體實施方式】
[0022] 通過以下方法可以快速容易地對許多微生物種類，特別是細菌、古生菌和單細胞 真菌，進行質(zhì)譜鑒定，所述方法為從以普通方法培養(yǎng)的菌落或營養(yǎng)培養(yǎng)基中的菌落取少量 微生物，將其轉(zhuǎn)移到質(zhì)譜樣品載板上，在其上用基質(zhì)溶液消化，干燥，通過基質(zhì)輔助激光解 吸電離進行質(zhì)譜測量。使用在各情況中包含大約40至80種蛋白質(zhì)（質(zhì)量范圍通常介于3000 至20000道爾頓)的譜圖，通過與數(shù)千個參考譜進行近似度分析，來確定微生物種類。這里所 用術語"鑒定"視為表示系統(tǒng)分類，即確定其科、屬和種，可能還有亞種。同時還有在醫(yī)學和 法律上得到許的包含數(shù)千種微生物物種的參考譜庫，其包括幾乎所有的臨床相關物種。
[0023] 然而，在醫(yī)學領域不僅存在快速鑒定的問題，而且還存在檢測出對常用抗生素的 抗藥的問題。如不了解抗藥性，通常無法對感染進行快速防控。因此，不僅需要快速鑒定微 生物的方法，還需要快速確定并表征其抗藥性的方法。
[0024]自從首次使用青霉素(0-內(nèi)酰胺抗生素）后，細菌已逐漸發(fā)展出不同類型的抗藥 性。細菌抵抗內(nèi)酰胺的一種方式是形成酶(0-內(nèi)酰胺酶），這種酶通過水解作用催化破壞 打開內(nèi)酰胺環(huán)，并因此致使內(nèi)酰胺失效。這些酶的催化作用意味著少量的內(nèi)酰胺酶 就足夠破壞大量的內(nèi)酰胺抗生素。目前已知數(shù)百種由不同種類的細菌形成的內(nèi)酰胺酶 變體。最初通過突變而產(chǎn)生的酶合成遺傳信息通過染色體或質(zhì)粒遺傳。質(zhì)粒信息通過不同 的機制也可在細菌之間傳遞，甚至可在不同種類的細菌之間傳遞（"水平傳遞"），因此可以 使抗藥性細菌快速蔓延。
[0025]目前有大量內(nèi)酰胺抗生素的衍生物，其中包括若干種青霉素(節(jié)青霉素、口服青 霉素、氨基青霉素、異惡?；嗝顾?、酰氨基青霉素）、以及頭孢菌素、單環(huán)內(nèi)酰胺類和碳 青霉烯類，在此按照功效范圍以升序列出。最有效的內(nèi)酰胺抗生素通常以具有較大的化 學基團作為衍生物，以便對內(nèi)酰胺酶產(chǎn)生空間位阻作用。另一方面，新的更有效的內(nèi)酰 胺酶則通過細菌突變而不斷形成。令人生畏的"超廣譜內(nèi)酰胺酶(ESBL)"和"碳青霉烯酶" 可以分解大范圍的內(nèi)酰胺抗生素。ESBL最初由內(nèi)酰胺酶上的點突變形成。ESBL和碳青 霉烯酶的基因見于可從細菌到細菌水平傳遞的質(zhì)粒。
[0026]攜帶ESBL的細菌對青霉素、頭孢菌素（1-4代)及單環(huán)內(nèi)酰胺類有抗藥性。主要是 攜帶ESBL基因的大腸桿菌(E.coli)和克雷伯桿菌屬(Klebsiella)(革蘭氏陰性菌）。微生物 學家們憂心忡忡，因為這些ESBL抗藥性和碳青霉烯抗藥性快速蔓延。除了甲氧西林抗藥性 金黃色葡萄球菌(MRSA)外，這是感染研究中最令人擔心的問題之一，例如可以參見""Rapid Spread of Carbapenem-Re sis tant Klebsiella pneumoniae in New York City，a New Threat to Our Antibiotic Armamentarium"，S.Bratu et al，Arch Intern Med 2005， 165(12)，1430-1435"。
[0027] 內(nèi)酰胺酶抑制劑是對抗內(nèi)酰胺酶的一種手段。它們與內(nèi)酰胺類一起施用， 以減弱存在于細菌中的內(nèi)酰胺酶的作用。已確立的組合用藥為例如克拉維酸+阿莫西林、 舒巴坦+氨芐青霉素、他佐巴坦+哌拉西林。不是所有的組合都有最佳的效果。然而，這些治 療僅可在仔細鑒定細菌并謹慎確定其抗藥性后使用，因為可以預見這種手段也會非?？焖?地失效。
[0028] 本發(fā)明提供一種方法，其只需少量細菌，并且根據(jù)微生物酶對抗生素的催化效果， 可以特別簡單快速地測量微生物抗藥性。例如，微生物內(nèi)酰胺酶導致相應抗生素的內(nèi) 酰胺環(huán)水解分裂。本方法在一小時內(nèi)便可測定微生物抗藥性。優(yōu)選在質(zhì)譜樣品載板上使少 量完整微生物細胞與一定劑量的抗生素混合，并在其上進行培養(yǎng)。借助質(zhì)譜測量微生物酶 的催化作用所致的抗生素分解。出人意料的是，培育期可以短于一小時，通常半小時左右即 可。出人意料的是，優(yōu)選只在室溫和潮濕環(huán)境下進行培養(yǎng)即可，以防樣品干燥殆盡。
[0029] 此外，本發(fā)明還包括質(zhì)譜樣品支持物(樣品載板)及其制造方法。根據(jù)本發(fā)明的樣 品載板如圖3所示;其優(yōu)選是平的并有多個測試點（10)，每個測試點均制備有至少一層按計 量添加的抗生素。樣品載板可以包括具有不同抗生素的層的測試點，可用于同時測試微生 物樣品的不同抗藥性。還可包括具有多層抗生素和抑制劑的測試點，以用于微生物酶反應。 各層還可包含一定劑量的參考物質(zhì)，其既可用于重新校正質(zhì)量標度，又可用于測定抗生素 (包括其分解產(chǎn)物)質(zhì)量信號的量變。
[0030] 在根據(jù)本發(fā)明的方法中，優(yōu)選直接在質(zhì)譜樣品載板上混合少量微生物和定量的合 適的抗生素并在短時間內(nèi)進行培養(yǎng)，以此方式測定微生物抗藥性。在此方面出人意料的是， 在室溫下只經(jīng)過半小時的培養(yǎng)期，然后干燥并制備MALDI樣品后，即可檢測微生物酶對抗生 素的分解，如果在具有MALDI離子源的質(zhì)譜儀中直接檢測MALDI樣品，則不需要從樣品載板 移除微生物。
[0031]最優(yōu)選的方法如下所述(詳細地分解成單獨的方法步驟）：
[0032] (a)提供樣品載板，所述樣品載板至少在一個測試點上具有包含一定劑量的抗生 素的層；
[0033] (b)將微生物施加至所述抗生素的層上，然后將液體施加在此測試點上；
[0034] (c)在測試點上進行培養(yǎng)，特別是在潮濕環(huán)境及室溫條件下；
[0035] (d)干燥；
[0036] (e)制備用于基質(zhì)輔助激光解吸電離(MALDI)的樣品；
[0037] (f)在具有MALDI離子源的質(zhì)譜儀(特別是飛行時間質(zhì)譜儀)中進行質(zhì)譜的測量;和
[0038] (g)評估質(zhì)譜以鑒定抗藥性。
[0039] 測試點上的層包含例如大約0.1至2微克（優(yōu)選0.5微克）的抗生素。還可包含已知 量的參考物質(zhì)。與分類學鑒定類似，只將大約1〇3至1〇7個微生物涂到各測試點上。將一至三 微升(優(yōu)選約兩微升)液體施加到各測試點上以進行培養(yǎng)。同一樣品載板的不同測試點可以 包含具有不同抗生素的層。各層不僅可含抗生素，還可含其他抑制劑以降低微生物酶的效 力。
[0040] 微生物細胞既可人工涂抹，也可自動化施加（例如通過接種系統(tǒng)）。對營養(yǎng)培養(yǎng)基 表面上的微生物進行質(zhì)譜分析的方法已在文件DE 102012011647A1中披露，其中通過直接 接觸將微生物細胞從平板營養(yǎng)培養(yǎng)基的表面轉(zhuǎn)移到樣品載板的接觸表面上。本文所述樣品 載板既可以是表面積大的平板，也可以是端面與菌落的微生物細胞接觸的針狀樣品載板。 針狀樣品載板的接觸表面很小，只有單個菌落的微生物才能轉(zhuǎn)移到針狀樣品載板上。微生 物細胞轉(zhuǎn)移后，使針狀樣品載板的端面基本與轉(zhuǎn)接板的表面平齊，從而可將針狀樣品載板 插入轉(zhuǎn)接板。在本發(fā)明中，針狀樣品載板的末端可以包被一種或多種抗生素。
[0041] 下文以廣譜亞胺培南的一個例子(碳青霉烯），介紹根據(jù)本發(fā)明的方法：
[0042]質(zhì)譜MALDI樣品載板通常有很多（48-386)明確標記的測試點（直徑兩至四毫米）。 疏水環(huán)境下的親水測試點是特別有利的。圖3舉例說明有96個測試點（10)的此類樣品載板； 它為微量滴定板的大小，但更小型號的樣品載板也是市售可得的。為了制備根據(jù)本發(fā)明的 樣品載板，樣本載板的至少一些測試點可各自包被有兩微升的亞胺培南溶液(或相當?shù)目?生素)并干燥，以使樣本載板在各情況中每個測試點含有〇. 5微克的亞胺培南。干燥后，采取 防潮措施存放樣本載板，例如使用收縮包裝或提供干燥劑。以此方式制備的樣品載板市售 可得，所以不需要在實驗室完成這一制備步驟。
[0043]使用適當?shù)墓ぞ撸ɡ缧l(wèi)生清潔牙簽），以與微生物鑒定涂片制備相同的方式，將 在瓊脂板上以菌落方式生長的細菌人工涂到干亞胺培南層上。這可在同一步驟中完成，并 且可以使用用于制備微生物鑒定樣品的相同牙簽。用于鑒定測的試點沒有抗生素。當所研 究的所有細菌都施加到樣品載板的測試點后，將2微升10毫摩爾的碳酸氫銨緩沖液(pH 8) 移液到各測試點，由此亞胺培南與細菌彼此混合，并且細菌細胞大多未被消化。隨后在保持 潮濕的箱中在室溫下培養(yǎng)樣品載板30分鐘，以防測試點上的樣品過早干燥殆盡。培養(yǎng)期過 后，在樣品載板上干燥樣品，然后包被只含極少量三氟乙酸的基質(zhì)溶液，以使細菌細胞不被 消化。使用的基質(zhì)是在水的混合物中濃度為10毫克/毫升的氰基-4-羥基肉桂酸(HCCA)、 50%乙腈和0.2%三氟乙酸。再次干燥后，以普通的方法使用MALDI飛行時間質(zhì)譜儀獲得該 制備樣品的質(zhì)譜。
[0044]通常求出差異值LogRQn以評估質(zhì)譜：
[0045]
對于內(nèi)酰胺酶陽性微生物，結果通常為大 于零的值，對于內(nèi)酰胺酶陰性微生物，則為小于零的值。
[0046] 圖1上方示出使用根據(jù)本發(fā)明的方法和樣品載板，由對亞胺培南易感的微生物測 得的MALDI質(zhì)譜。圖中箭頭示出尚未分解的亞胺培南的質(zhì)量信號。圖1下方示出測得的抗藥 性微生物的MALDI質(zhì)譜，其酶在半小時內(nèi)便將亞胺培南定量水解，所以箭頭所示的亞胺培南 質(zhì)量信號已消失。酶的分解反應非常迅速，提是其未受到底物逐漸減少的影響，每個分子反 應的時間大約是1到100毫秒，不同e-內(nèi)酰胺酶的特征差異也有所不同。
[0047]所示出的亞胺培南的例子的不同尋常之處在于，酶水解的亞胺培南在MALDI質(zhì)譜 中沒有質(zhì)量信號，這使得在這種情況中需要檢測亞胺培南分子的分解。這需要內(nèi)部參考物 質(zhì)，其最好已被添加到樣品載板上的亞胺培南制備物中。例如，硫胺可用作內(nèi)部參考物質(zhì)。 圖1所示兩個質(zhì)譜中的豎線示出參考物質(zhì)的位置。在此應該注意，也可隨后將參考物質(zhì)添加 到例如基質(zhì)溶液中。
[0048] 在評估質(zhì)譜時，內(nèi)部參考物質(zhì)的質(zhì)量信號一方面可用于重新校準質(zhì)譜的質(zhì)量軸； 另一方面(特別是對亞胺培南來說），還可用于計算分解率(水解率）。如上所述，亞胺培南是 一種特殊情況，因為即使它們存在，在MALDI質(zhì)譜中也檢測不到水解產(chǎn)物(對于例如電噴霧 電離(ESI)等其他類型的電離，可以檢測到水解產(chǎn)物）。為了至少檢測到非水解的亞胺培南
峰的降低，使用內(nèi)部參考物質(zhì)計算水解率： 在將水解率歸 〇 一化至合適的負控和正控后，歸一化的水解率norm. logRQ>0.4表示抗藥性微生物，而對易 感微生物測得norm. logRQ的值〈0.2。圖2顯示兩種易感和六種抗藥性微生物的結果，其使用 包被在根據(jù)上述制備方法的樣品載板上的亞胺培南測得。
[0049] 原則上，在根據(jù)本發(fā)明的方法中，使用任何質(zhì)譜儀均可進行質(zhì)譜測量，但使用目前 常用于鑒定微生物(特別是細菌），并且通常在線性模式下運行的MALDI飛行時間質(zhì)譜儀特 別有利。圖1所示的質(zhì)譜是使用MALDI飛行時間質(zhì)譜儀在線性模式下獲得的。
[0050]通常，先以瓊脂營養(yǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)待分析的樣品微生物直至其形成菌落，以便隨后 使用工具將其施加到樣品載板的測試點，以供鑒定和測定抗藥性。對于鑒定，通常需要注 意，只對單一菌落的微生物取樣。然而，對于測定抗藥性，通常有利的是混合多個菌落的微 生物(至少五個左右），以便同時獲得混合抗藥性的有用結果。
[0051]另一種重要的培養(yǎng)基類型是血液培養(yǎng)基，其用于診斷的或疑似的膿毒血癥。通常 使用非常廣譜的亞胺培南立即治療患者，因為膿毒血癥極其危險，死亡率很高。培養(yǎng)數(shù)小時 后，血細胞通過適當方法破壞，并且膿毒血癥微生物可通過小心的離心或過濾進行沉淀，以 不破壞微生物。一些微生物細胞可用于分類學鑒定，另一些可根據(jù)本發(fā)明檢測對亞胺培南 的抗藥性。如果存在對亞胺培南的抗藥性，則可通過組合用藥繼續(xù)治療，藥物選擇可以更加 明確，因為通過同時進行的鑒定已經(jīng)知道微生物種類。
[0052] 一般來說，不只關注對單一抗生素的抗藥性。通過引入多種不同類型的抗生素(其 可沉積到同一樣品載板的不同測試點上，也可沉積到一個單一的測試點上），根據(jù)本發(fā)明的 方法還可開發(fā)出多重抗藥性測試。可制備含一系列不同抗生素的樣品載板，如果需要則使 用參考物質(zhì)。還可在其他測試點與抑制劑一起施加抗生素(組合用藥）。在在不同測試點采 用不同抗生素的抗藥性測試中，可使用相同的工具將待測微生物分布到各個測試點上。緩 沖液的移液操作、培養(yǎng)、制備和質(zhì)譜測量如在上例中說明的那樣進行。可使用這樣的程序完 成評估，該程序還控制質(zhì)譜儀的測量，并了解對于不同測試點的質(zhì)譜評估的略微不同的參 數(shù)。由此一次性測得對不同抗生素的抗藥性，所需時間只比測定對一種抗生素的抗藥性略 長。
[0053]還存在混合樣品的情況，其中關注點較少專注于鑒定，而是更多地專注于立即測 定抗藥性。例如，了解鼻粘膜拭子或鼻分泌物中是否存在抗藥性細菌是至關重要的。通常的 程序是，使用鼻或口腔黏膜拭子研究住院患者或醫(yī)院員工是否為微生物抗藥性的載體。此 類拭子或鼻分泌物可以作為微生物樣品直接施加在樣品載板的經(jīng)適當預制的測試點上，對 于此目的，鑒于醫(yī)院中此類抗藥性測定的數(shù)量大，測試點優(yōu)選有多于一種抗生素。對于其他 類型的感染(例如傷口化膿），情況與此類似。
[0054]本發(fā)明不限于此處所述實施方案或例子。例如，可由平的樣品載板借助DESI(解吸 電噴霧電離)進行電離，或者還可從平板培養(yǎng)基的表面（用作樣品載板，并且其上施加有含 有抗生素的液體)直接進行。除MALDI電離外，例如，還可由平的樣品載板進行激光解吸，然 后進行化學電離。
【主權項】
1. 一種用于測定微生物樣品對抗生素的抗藥性的方法，其中在樣品載板的測試點上在 一定體積的液體中將所述微生物樣品和所述抗生素混合，并且在所述測試點上通過質(zhì)譜測 量進行分析，從而確定所述抗生素是否經(jīng)酶催化改變。2. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述微生物樣品含有完整的微生物細胞。3. 根據(jù)權利要求2所述的方法，其中在所述一定體積的液體中的培養(yǎng)期小于一個小時。4. 根據(jù)權利要求2或3所述的方法，其中在室溫下進行在所述一定體積的液體中的培 養(yǎng)。5. 根據(jù)權利要求2至4所述的方法，其中對每個測試點施加103個至107個微生物細胞。6. 根據(jù)權利要求2至5所述的方法，其中在所述微生物不被消化的條件下，在所述測試 點上制備用于基質(zhì)輔助激光解吸電離的測量樣品。7. 根據(jù)權利要求2至6之一所述的方法，包括以下步驟： (a) 提供樣品載板，所述樣品載板至少在一個測試點上具有包含一定劑量的所述抗生 素的層； (b) 將所述完整的微生物細胞施加至所述抗生素的層上，并且施加所述液體； (c) 在所述測試點上進行培養(yǎng)； (d) 干燥； (e) 制備用于基質(zhì)輔助激光解吸電離(MALDI)的測量樣品； (f) 在具有MALDI離子源的質(zhì)譜儀中進行質(zhì)譜的測量;和 (g) 評估所述質(zhì)譜以鑒定抗藥性。8. 根據(jù)權利要求7所述的方法，其中所述測試點上的所述層包含大約0.1微克至2微克 的抗生素，優(yōu)選0.5微克的抗生素。9. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其中在所述測試點上制備用于基質(zhì)輔助激光解吸電離 的測量樣品，其中所述微生物樣品中的微生物被消化，在質(zhì)譜測量中同時采集微生物蛋白 質(zhì)的質(zhì)量信號，所述質(zhì)量信號使得可對微生物進行分類學鑒定和/或在其抗藥性方面進行 進一步表征。10. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述微生物樣品包含被消化的微生物。11. 根據(jù)權利要求1至10之一所述的方法，其中在所述混合之后將所述樣品載板保持在 潮濕環(huán)境中，或者在所述混合之后向所述測試點上的所述一定體積的液體中添加額外的液 體，從而防止所述一定體積的液體在指定的反應時間內(nèi)干燥殆盡。12. 根據(jù)權利要求1至11之一所述的方法，其中所述一定體積的液體小于10微升。13. 根據(jù)權利要求1至12之一所述的方法，其中在所述測試點上在所述一定體積的液體 中，將所述微生物樣品與多于一種抗生素混合。14. 用于微生物樣品的抗藥性質(zhì)譜測定的樣品載板，其中所述樣品載板具有多個測試 點，并且至少一個測試點包被有一定劑量的一種或多種抗生素。15. 根據(jù)權利要求14所述的樣品載板，其中不同的測試點包被有不同的抗生素。16. 根據(jù)權利要求14或15所述的樣品載板，其中所述至少一個測試點還包被有一種或 多種參考物質(zhì)。
【文檔編號】G01N27/62GK106053586SQ201610216917
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年4月8日 公開號201610216917.4, CN 106053586 A, CN 106053586A, CN 201610216917, CN-A-106053586, CN106053586 A, CN106053586A, CN201610216917, CN201610216917.4
【發(fā)明人】卡特里·斯帕比爾, 貝婭特麗克絲·韋格曼
【申請人】布魯克道爾頓有限公司