同步快速檢測(cè)配制酒中8種人工合成著色劑的lc-ms/ms方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種同步快速檢測(cè)配制酒中8種人工合成著色劑的LC?MS/MS方法。所述的8種人工合成著色劑為新紅、靛藍(lán)、酸性紫6B、羅丹明B、酸性紅、喹啉黃、萘酚黃和亮黑。本發(fā)明首先加熱除去乙醇、調(diào)酸后，采用自組裝的固相萃取凈化小柱(陽(yáng)離子交換填料+陰離子交換填料)對(duì)不同性質(zhì)的人工合成著色劑實(shí)現(xiàn)同步凈化、富集，采用LC?MS/MS一次色譜過(guò)程進(jìn)行配制酒中8種人工合成著色劑的同時(shí)定量測(cè)定。該方法操作簡(jiǎn)單，凈化效果好，靈敏度高，重現(xiàn)性好，可廣泛應(yīng)用于配制酒中上述8種人工合成著色劑的檢測(cè)。
【專利說(shuō)明】
同步快速檢測(cè)配制酒中8種人工合成著色劑的LC-MS/MS方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種同步快速檢測(cè)配制酒中多種人工合成著色劑的方法，具體設(shè)及一 種可同時(shí)對(duì)配制酒中8種人工合成著色劑進(jìn)行提取、凈化、定量測(cè)定的固相萃取/LC-MS/MS 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 人工合成著色劑是通過(guò)化學(xué)合成的方法生產(chǎn)的有機(jī)色素，主要W苯、甲苯、糞等芳 控類化工產(chǎn)品為原料，經(jīng)過(guò)橫化、面化、偶氮化等一系列有機(jī)反應(yīng)化合而成。其成本低廉、色 澤鮮艷、著色力強(qiáng)、性能穩(wěn)定，在食品生產(chǎn)加工行業(yè)中被廣泛應(yīng)用。但人工合成著色劑大多 為偶氮類化合物，過(guò)量食用可對(duì)人體有致崎致癌作用。近年來(lái)，為了加強(qiáng)對(duì)食用合成著色劑 的管理，許多國(guó)家對(duì)食用合成色素的理化性質(zhì)及安全性做了深入細(xì)致的研究，明確限定了 食用合成色素的使用品種、使用范圍及使用量。美國(guó)嚴(yán)禁在加工食品中使用偶氮玉紅、羅丹 明B、哇嘟黃、糞酪黃、酸性紫6B和亮黑等，允許使用說(shuō)藍(lán)、新紅;歐盟嚴(yán)禁使用新紅、羅丹明 B、糞酪黃和酸性紫6B，允許使用說(shuō)藍(lán)、偶氮玉紅、哇嘟黃、亮黑，但有限量要求;我國(guó)GB2760- 2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》對(duì)說(shuō)藍(lán)、新紅、偶氮玉紅、哇嘟黃的使用也有 嚴(yán)格的限量要求，羅丹明B、糞酪黃、亮黑和酸性6B紫則嚴(yán)禁使用。
[0003] 目前，國(guó)內(nèi)外用于食品中多種合成著色劑的檢測(cè)方法主要有分光光度法、高效液 相色譜法、高效液相串聯(lián)質(zhì)譜法等。分光光度法操作繁瑣、定性定量準(zhǔn)確度較差。液相色譜 法是目前應(yīng)用最廣泛的檢測(cè)方法，但是缺乏配套的確證技術(shù)，無(wú)法滿足復(fù)雜的食品基質(zhì)中 目標(biāo)物的定性確證要求。已報(bào)道的檢測(cè)食品中合成著色劑的LC-MS/MS方法，只設(shè)及單一系 列著色劑且無(wú)普適的前處理凈化手段。因此，建立一種同時(shí)提取、凈化、同步快速定量檢測(cè) 配制酒中新紅、說(shuō)藍(lán)、酸性紫6B、羅丹明B、酸性紅、哇嘟黃、糞酪黃和亮黑8種人工合成著色 劑的方法變得尤為重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種同步快速檢測(cè)配制酒中8種人 工合成著色劑的LC-MS/MS方法。該方法同步提取、一次過(guò)柱萃取凈化、一次色譜過(guò)程定量分 析配制酒中的8種人工合成著色劑，包括新紅、說(shuō)藍(lán)、酸性紫6B、羅丹明B、酸性紅、哇嘟黃、糞 酪黃和亮黑。該方法操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、重現(xiàn)性好、準(zhǔn)確率高。
[0005] 本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為:一種同步快速檢測(cè)配制酒中8種人工合成著色劑的 LC-MS/MS方法，其特征是，
[0006] 所述的8種人工合成著色劑為新紅、說(shuō)藍(lán)、酸性紫6B、羅丹明B、酸性紅、哇嘟黃、糞 酪黃和亮黑；
[0007] 具體包括W下步驟：
[000引（1)制備:取配制酒樣品，加熱除去乙醇，加入超純水，用巧樣酸水溶液調(diào)試pH值至 3-6,得待凈化溶液；
[0009] (2)凈化：
[0010] a、同時(shí)萃取8種人工合成著色劑的固相萃取小柱的組裝:取40-60WI1陽(yáng)離子交換填 料和40-60WI1陰離子交換填料，填充于底端為聚乙締篩板的聚丙締小柱內(nèi)，填料上端再W聚 乙締篩板固定；
[0011] b、柱活化:將上述固相萃取小柱依次用pH值6-7的水、甲醇活化；
[0012] C、加樣淋洗:轉(zhuǎn)移上述待凈化液至固相萃取小柱，依次用抑值3-6的水、甲醇淋洗 S陽(yáng)柱；
[0013] d、洗脫:低真空吹干SPE柱，用3%-6%的氨化甲醇洗脫待分析成分并接收，收集液 于50°C氮?dú)獯蹈?，加水溶解，滿流混合后過(guò)0.22皿濾膜，供LC-MS/MS分析；
[0014] (3)檢測(cè):步驟(2)得到的待測(cè)樣品用液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜進(jìn)行測(cè)定。
[0015] 優(yōu)選的，具體包括W下步驟：
[0016] (1)制備:取配制酒樣品于燒杯中緩緩加熱至70°C攬拌除去乙醇，密封標(biāo)識(shí)，待用； 稱取樣品IOg于25mL容量瓶中，加入IOmL超純水，用巧樣酸水溶液調(diào)試抑值至3-6，超純水定 容得待凈化溶液；
[0017] (2)凈化：
[0018] a、同時(shí)萃取8種人工合成著色劑的固相萃取小柱(6mL)的組裝：分別稱取40-80mg 40-60皿陽(yáng)離子交換填料和40-80mg 40-60WI1陰離子交換填料，填充于底端為聚乙締篩板的 聚丙締小柱內(nèi)，填料上端再W聚乙締篩板固定；
[0019] 所述的陽(yáng)離子交換填料為選自苯橫酸鍵合聚苯乙締二乙締苯共聚物(PCX)、苯橫 酸鍵合硅膠(SCX)、丙橫酸鍵合硅膠(PRS)中的至少一種，優(yōu)選PCX填料；
[0020] 所述的陰離子交換填料為選自聚酷胺(PA)、N此氨丙基鍵合硅膠、多胺化聚苯乙締 二乙締苯共聚物(PWAX)填料中的至少一種，優(yōu)選PWAX填料；
[0021] 所述的陽(yáng)離子交換填料和陰離子交換填料的比例為重量比1:0.5~1:2;優(yōu)選重量 比 1:1;
[0022] 優(yōu)選的，采用60m評(píng)巧+eOmgPWAX固相萃取小柱對(duì)樣品進(jìn)行凈化處理；
[0023] b、柱活化:將上述固相萃取小柱依次用4-8mL pH值6-7的水、4-8mL甲醇活化；
[0024] C、加樣淋洗:轉(zhuǎn)移上述待凈化液8-15血至固相萃取小柱，依次用4-8mL pH值3-6的 水、4-8mL甲醇淋洗SPE柱；
[0025] d、洗脫：低真空吹干STO柱，用4-8mL 3%-6%的氨化甲醇（優(yōu)選6ml的5%氨化甲 醇)洗脫待分析成分并接收，收集液于50°C氮?dú)獯蹈?，用水定容?. OmL，滿流混合后過(guò)0.22 皿濾膜，供LC-MS/MS分析。
[0026] (3)檢測(cè):步驟(2)得到的待測(cè)樣品用液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜進(jìn)行測(cè)定。
[0027] 優(yōu)選的，所述步驟(3)中液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜的儀器參數(shù)條件如下：
[00巧]液相色譜條件為：
[0029]
[0030]
[0031]
[0032] 選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)母離子、子離子和碰撞能量如表2所示。實(shí)際測(cè)試時(shí)保留時(shí)間可W在 表2基礎(chǔ)上±5%。
[0033] 本發(fā)明的有益效果：
[0034] 本發(fā)明對(duì)配制酒中8種人工合成著色劑的含量檢測(cè)進(jìn)行了研究，樣品用巧樣酸水 溶液調(diào)試pH值至3-6后，用自組裝固相萃取小柱凈化，采用LC-MS/MS定量測(cè)定。該方法可實(shí) 現(xiàn)性質(zhì)不同的人工合成著色劑一次過(guò)柱萃取凈化、一次色譜過(guò)程定量分析，操作簡(jiǎn)單、靈敏 度高、重現(xiàn)性好、準(zhǔn)確率較高?？蓮V泛應(yīng)用于配制酒中新紅、說(shuō)藍(lán)、酸性紫6B、羅丹明B、酸性 紅、哇嘟黃、糞酪黃和亮黑8種人工合成著色劑的檢測(cè)。
[0035] 本發(fā)明利用自組裝的固相萃取凈化小柱，且采用陰離子填料和陽(yáng)離子填料按一定 比例混裝的方式制成固相萃取小柱，對(duì)樣品提取液進(jìn)行凈化處理，可在有效除去干擾物的 同時(shí)實(shí)現(xiàn)對(duì)不同性質(zhì)人工合成著色劑的凈化、富集，方法靈敏度、準(zhǔn)確度和精確度均符合食 品添加劑分析標(biāo)準(zhǔn)，具有一定的新穎性和適用性。同時(shí)上述方式，相比采用兩根不同的固相 萃取柱分開(kāi)萃取的方式節(jié)省了時(shí)間和成本。且本發(fā)明自組裝小柱，可W根據(jù)樣品中色素含 量適當(dāng)調(diào)整填料的粒徑和用量，方便適用。本發(fā)明首次使用PWAX柱進(jìn)行固相萃取，它的吸附 容量大，萃取效果好。
[0036] 本發(fā)明的方法中，8種人工合成著色劑同時(shí)進(jìn)行提取、凈化等前處理(本發(fā)明的8種 物質(zhì)為非同系物，由于不同物質(zhì)的性質(zhì)不同，在提取的過(guò)程中，很難把所有目標(biāo)物都提取完 全，但是，本發(fā)明的方法，同時(shí)提取、凈化，并且8種目標(biāo)物提取比較完全，實(shí)施例中的回收率 就可W說(shuō)明運(yùn)點(diǎn)），并且一次上機(jī)檢測(cè)，節(jié)約時(shí)間和成本。
【附圖說(shuō)明】
[0037] 圖1為甲醇巧mmol乙酸錠水溶液8種人工合成著色劑MRM色譜圖；
[0038] 圖2 8種人工合成著色劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的MRM色譜圖；其中圖2a為正離子模式下酸 性紫和羅丹明B的MRM色譜圖；圖化為負(fù)離子模式下新紅、說(shuō)藍(lán)、偶氮玉紅、哇嘟黃、糞酪黃、 亮黑的MRM色譜圖；
[0039] 圖3葡萄酒樣品中8種人工合成著色劑的MRM色譜圖；
[0040] 圖4葡萄酒加標(biāo)樣品中8種人工合成著色劑的MRM色譜圖；
[0041] 圖5是實(shí)施例1加標(biāo)樣品的MRM色譜圖；
[0042] 圖6是實(shí)施例巧日標(biāo)樣品的MRM色譜圖；
【具體實(shí)施方式】
[0043] 為了更好地理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明的內(nèi)容，但本發(fā)明的 內(nèi)容不僅僅局限于下面的實(shí)施例，實(shí)施例不應(yīng)視作對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。
[0044] 1儀器與試劑
[0045] 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀：Aglientl200高效液相色譜儀，API4000質(zhì)譜儀（美國(guó)AB SCIEX);感量為O.lmg的分析天平（瑞±梅特勒公司純水器（美國(guó)Millipore公 司）；N-EVAP24氮吹儀(美國(guó)）；量程為10-100化、100-1000化移液槍化ppendof公司）。
[0046] 新紅、說(shuō)藍(lán)、酸性紫6B、羅丹明B、酸性紅、哇嘟黃、糞酪黃和亮黑標(biāo)準(zhǔn)品（自制）；甲 醇：色譜純(Merk公司）；乙臘：色譜純(Merk公司）；甲酸：色譜純(Merk公司）；乙酸錠：分析 純;巧樣酸:分析純;氨水:分析純;無(wú)水乙醇:分析純;PWAX填料:Agela Technologies公司； PCX填料：Agela Technologies公司；SCX填料:Agela Technologies公司；PRS填料:Agela Technologies公司；NH2氨丙基鍵合硅膠填料:Agela Technologies公司；C18SPE萃取柱： Agela Technologies公司；陽(yáng)離子交換(PCX)S陽(yáng)萃取柱:Agela I'echnologies公司；聚酷胺 (PA)S陽(yáng)萃取柱:Agela Technologies公司。
[0047] 2標(biāo)準(zhǔn)溶液配制
[004引分別稱取新紅、說(shuō)藍(lán)、酸性紅、哇嘟黃、糞酪黃、酸性紫6B、羅丹明B、亮黑8種著色劑 標(biāo)準(zhǔn)品各100.0 mg,用水溶解后，并分別定容于IOOmL棟色容量瓶中，即得lOOOmg/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備 液。棟色瓶?jī)?chǔ)存于-18°C備用。
[0049] 取空白樣品按上述提取和凈化方法進(jìn)行處理，得到空白基質(zhì)提取凈化液。用該基 質(zhì)溶液稀釋標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備制成系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，進(jìn)行LC-MS/MS分析。W標(biāo)準(zhǔn)工作液的濃度為 橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制相關(guān)線性方程。
[0050] 3樣品提取與凈化
[0化1] 3.1制備：
[0052]取SOOmL樣品于燒杯中緩緩加熱至70°C攬拌除去乙醇，密封標(biāo)識(shí)，待用；稱取樣品 IOg于25血容量瓶中，加入IO血超純水，用巧樣酸水溶液調(diào)試抑值至3-5，超純水定容得待凈 化溶液；
[0化3] 3.2凈化：
[0054] 3.2.1同時(shí)萃取8種人工合成著色劑的固相萃取小柱的組裝：分別稱取40-80mg 40-60皿陽(yáng)離子交換填料和40-80mg 40-60WI1陰離子交換填料，填充于底端為聚乙締篩板的 聚丙締小柱內(nèi)，填料上端再W聚乙締篩板固定；
[0055] 所述的陽(yáng)離子交換填料為選自苯橫酸鍵合聚苯乙締二乙締苯共聚物(PCX)、苯橫 酸鍵合硅膠(SCX)、丙橫酸鍵合硅膠(PRS)中的至少一種，所述的陰離子交換填料為選自丙 基乙二胺(PSA)、聚酷胺(PA)、多胺化聚苯乙締二乙締苯共聚物(PWAX)填料中的至少一種；
[0056] 所述的陽(yáng)離子交換填料和陰離子交換填料的比例為重量比1:0.5~1:2。
[0化7] 3.2.2柱活化:將上述固相萃取小柱依次用4-8mL pH值6-7的水、4-8mL甲醇活化。
[0化引 3.2.3加樣淋洗:轉(zhuǎn)移上述待凈化液8-15血至固相萃取小柱，依次用4-8mL pH值3- 6的水、4-8mL甲醇淋洗S陽(yáng)柱。
[0059] 3.2.4洗脫:低真空吹干S陽(yáng)柱，用4-8mL 3 %-6%的氨化甲醇洗脫待分析成分并接 收，收集液于50°C氮?dú)獯蹈?，用水定容?. OmL，滿流混合后過(guò)0.22皿濾膜，供LC-MS/MS分 析。4檢測(cè)
[0060] 待測(cè)樣品用液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜進(jìn)行測(cè)定，儀器參數(shù)條件見(jiàn)下表1，選擇反 應(yīng)監(jiān)測(cè)母離子、子離子和碰撞能量見(jiàn)表2。
[0061] 表1液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜的儀器參數(shù)條件
[0062]
[0063]表2 8種人工合成著色劑的LC-MS/MS分析參數(shù)
[0064]
[00化]5.結(jié)果與討論
[0066] 5.1色譜質(zhì)譜條件的優(yōu)化
[0067] 5.1.1流動(dòng)相的選擇
[006引比較了乙臘+0.1 %甲酸水溶液，甲醇巧mmol/L乙酸錠水溶液，甲醇+0.1 %甲酸水 溶液不同流動(dòng)相對(duì)色譜圖的影響。研究發(fā)現(xiàn)W乙臘+0.1 %甲酸水、甲醇+0.1 %甲酸水為流 動(dòng)相，有的目標(biāo)物峰形差，離子化響應(yīng)值低。甲醇巧mmol/L乙酸錠水溶液為流動(dòng)相，采用梯 度洗脫，8種色素能夠快速分離，且每種化合物色譜峰對(duì)稱尖銳，分離效果較好，MRM色譜圖 如附圖1所示。
[0069] 5.1.2質(zhì)譜測(cè)定條件的優(yōu)化
[0070] 首先分別采用濃度為50化g/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液W蠕動(dòng)累連續(xù)進(jìn)樣的方式進(jìn)行母離子全 掃描，確定每種農(nóng)藥的母離子質(zhì)量數(shù)，然后再W母離子進(jìn)行2級(jí)碰撞掃描，選擇兩個(gè)豐度比 較高的子離子作為定性和定量離子。同時(shí)優(yōu)化質(zhì)譜條件，確定質(zhì)譜最佳條件，建立多離子反 應(yīng)監(jiān)測(cè)模式。圖2a為正離子模式下酸性紫和羅丹明B的MRM色譜圖；圖化為負(fù)離子模式下新 紅、說(shuō)藍(lán)、偶氮玉紅、哇嘟黃、糞酪黃、亮黑的MRM色譜圖。
[0071] 5.2樣品基質(zhì)效應(yīng)的消除
[0072] 電噴霧離子源化SI)易受樣品基質(zhì)的影響。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)樣品基質(zhì)對(duì)離子化有抑制 作用，不同色素受樣品基質(zhì)抑制程度不同，不同樣品基質(zhì)對(duì)色素離子化抑制程度也存在差 異。糞酪黃，哇嘟黃受樣品基質(zhì)影響較大;新紅、說(shuō)藍(lán)、酸性紫6B、酸性紅、亮黑、羅丹明B影響 較小。為消除樣品基質(zhì)效應(yīng)，應(yīng)W空白樣品提取液作為標(biāo)注溶液的稀釋液來(lái)消除樣品基質(zhì) 效應(yīng)。
[0073] 5.化H值對(duì)回收率的影響
[0074] 羅丹明B、糞酪黃、哇嘟黃、新紅、說(shuō)藍(lán)、酸性紫6B、酸性紅、亮黑8種著色劑均為水溶 性，因此采用水作為溶劑提取。本研究比較了提取后直接過(guò)柱和調(diào)節(jié)抑再過(guò)柱凈化帶來(lái)的 影響，發(fā)現(xiàn):水樣直接上柱哇嘟黃、酸性紅附著能力弱，在甲醇凈化時(shí)會(huì)溶出，回收率變差。 改變抑為3,4,5時(shí)發(fā)現(xiàn)pH = 4時(shí)效果最好，因此本文選擇了水作為提取溶劑，提取后調(diào)節(jié)提 取液抑為4。
[00巧]5.4凈化S陽(yáng)柱的選擇
[0076]常用來(lái)做色素的SI^凈化萃取柱有陽(yáng)離子交換（如PCX)SI^柱、陰離子交換柱（如 PWAX、PA) S陽(yáng)柱及Cl 8粉制成的STO柱等，Cl 8粉具有疏水作用對(duì)非極性的組分有吸附作用， 常用來(lái)去除雜質(zhì)，對(duì)水溶性的著色劑幾乎沒(méi)有吸附能力。根據(jù)著色劑酸堿性的不同，填料有 選擇性的吸附目標(biāo)物，如PCX粉對(duì)目標(biāo)物羅丹明B有很好的吸附，但對(duì)其他酸性著色劑吸附 差;PA粉、PWAX粉對(duì)酸性著色劑有很好的選擇性吸附性。由于8種著色劑中既有酸性也有堿 性化合物，本課題主要研究采用一次過(guò)柱解決凈化問(wèn)題。優(yōu)選地，采用PCX粉:PWAX為填料時(shí) 吸附兩種性質(zhì)的化合物能力最佳，60m評(píng)CX:60mgPWAX/6mL自行填制凈化萃取柱對(duì)樣品進(jìn)行 凈化處理。
[0077] 5.5洗脫液的選擇
[0078] 本研究測(cè)試了純甲醇洗脫上樣后的SPE柱，發(fā)現(xiàn)目標(biāo)化合物幾乎洗脫不下來(lái)。比較 1%、2%、4%、5%、6%、10%氨化甲醇作為洗脫液的洗脫效果。發(fā)現(xiàn)同樣取6mL洗脫液時(shí)， 5 %氨化甲醇能洗脫完全，因此采用5 %氨化甲醇作為洗脫液。
[00巧]5.6方法驗(yàn)證
[0080] 5.6.1方法的線性和檢出限
[0081 ]將空白樣品按上述提取和凈化過(guò)程進(jìn)行處理，得到空白基質(zhì)提取凈化液。用該基 質(zhì)溶液將標(biāo)準(zhǔn)液稀釋成羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)系列：20iig/L，40iig/L，80iig/L，160iig/L，200iig/l;酸性 紫標(biāo)準(zhǔn)系列50]ig/L，lOOjig/L，200]ig/L，400]ig/L，500]ig/L;其余六種標(biāo)準(zhǔn)系列均為IOOjig/L， 200yg/L，400yg/L，800yg/L，1000yg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，LC/MS/MS進(jìn)行分析后，計(jì)算得到 標(biāo)準(zhǔn)曲線及相關(guān)系數(shù)，見(jiàn)表3。由此可見(jiàn)8種色素在線性范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系 數(shù)在0.9889-0.9991之間。
[0082] 方法的檢出限化OD) W空白樣品基質(zhì)稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線上的最低濃度出峰時(shí)，取信噪 比S/N = 3和樣品處理過(guò)程的稀釋倍數(shù)計(jì)算得出。定量限化OQ) W空白樣品基質(zhì)稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲 線上的最低濃度出峰時(shí)，取信噪比S/N=10和樣品處理過(guò)程的稀釋倍數(shù)計(jì)算得出。具體數(shù)據(jù) 見(jiàn)表3。
[0083] 表3 8種色素的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)和方法檢出限
[0084]
[00化]5.6.2回收率和精密度
[0086] 對(duì)陰性配制酒樣品進(jìn)行添加回收實(shí)驗(yàn)。由于酸性紫、羅丹明B響應(yīng)值高，分別添加 濃度酸性紫為20、50、10化肖/1^;羅丹明8為5、10、5化肖/1^;其余6種色素添加濃度分別為50、 100、200iig/kg。稱樣后加入標(biāo)準(zhǔn)溶液，滿旋混勻放置0.化后按上文進(jìn)行樣品處理。每個(gè)水平 重復(fù)6次，測(cè)精密度。結(jié)果見(jiàn)表4?？梢?jiàn)，8種色素在配制酒中添加平均回收率在78.6%-102% 之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均小于8.0%。
[0087] 表4樣品中8種色素回收率和精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[008引
[0089]
[0090] 5.7方法的應(yīng)用
[0091] 葡萄酒樣加入羅丹明B、糞酪黃，哇嘟黃、新紅、說(shuō)藍(lán)、酸性紫6B、酸性紅、亮黑標(biāo)準(zhǔn) 溶液的樣品，按"3樣品提取與凈化"的實(shí)驗(yàn)步驟操作完畢后上機(jī)，測(cè)得色譜圖分別如圖3和 圖4所示。從色譜圖中可W看出，葡萄酒樣品基質(zhì)不干擾8種人工著色劑的測(cè)定，加標(biāo)樣品回 收較好，但羅丹明B在空白中有本底，需要扣空白。
[0092] 實(shí)驗(yàn)表明，采用本法可同步凈化、同時(shí)檢測(cè)配制酒中8種人工合成著色劑，簡(jiǎn)便快 速，準(zhǔn)確靈敏、重現(xiàn)性好，完全滿足進(jìn)出口食品的產(chǎn)品質(zhì)量控制要求。
[0093] 實(shí)施例1:
[0094] 葡萄酒樣品中8種人工合成著色劑的測(cè)定。
[00M] 3樣品提取與凈化
[0096] 3.1 提取
[0097] 取SOOmL樣品于燒杯中緩緩加熱至70°C攬拌除去乙醇，密封標(biāo)識(shí)，待用。
[009引稱取樣品IOg于25mL容量瓶中，加入10血超純水，用巧樣酸水溶液調(diào)試抑值至4,超 純水定容得待凈化溶液；
[0099] 3.2 凈化
[0100] 3.2.1同時(shí)萃取8種人工合成著色劑的固相萃取小柱的組裝:分別稱取60mg 40-60 皿PCX陽(yáng)離子交換填料和60mg 40-60皿PWAX混合型弱陰離子交換填料，填充于底端為聚乙 締篩板的聚丙締小柱內(nèi)，填料上端再W聚乙締篩板固定；
[0101] 3.2.2柱活化:將上述固相萃取小柱依次用6mL pH值6-7的水、6mL甲醇活化；
[0102] 3.2.3加樣淋洗:轉(zhuǎn)移上述待凈化液IOmL至固相萃取小柱，依次用6mL pH 4的水、 6mL甲醇淋洗S陽(yáng)柱。
[0103] 3.2.4洗脫:低真空吹干SPE柱，用6mL 5 %的氨化甲醇洗脫待分析成分并接收，收 集液于50°C氮?dú)獯蹈桑盟ㄈ葜?. OmL，滿流混合后過(guò)0.22皿濾膜，供LC-MS/MS分析。
[0104] 4 檢測(cè)
[0105] 待測(cè)樣品用液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜進(jìn)行測(cè)定，儀器參數(shù)條件見(jiàn)表1，選擇反應(yīng) 監(jiān)測(cè)母離子、子離子和碰撞能量見(jiàn)表2;其加標(biāo)樣品的MRM色譜圖如圖5所示，該樣品回收率 和精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。
[0106] 實(shí)施例2
[0107] 黃酒樣品中8種人工合成著色劑的測(cè)定。
[0108] 3樣品提取與凈化
[0109] 3.1 提取
[0110] 取約SOOmL樣品于燒杯中緩緩加熱至70°C攬拌除去乙醇，密封標(biāo)識(shí)，待用。
[01川稱取樣品IOg于25mL容量瓶中，加入10血超純水，用巧樣酸水溶液調(diào)試抑值至4，超 純水定容得待凈化溶液；
[0112] 3.2 凈化
[0113] 3.2.1同時(shí)萃取8種人工合成著色劑的固相萃取小柱的組裝：分別稱取分別稱取 60mg 40-60皿PCX陽(yáng)離子交換填料和60mg 40-60皿PWAX混合型弱陰離子交換填料，填充于 底端為聚乙締篩板的聚丙締小柱內(nèi)，填料上端再W聚乙締篩板固定；
[0114] 3.2.2柱活化:將上述固相萃取小柱依次用6mL pH值6-7的水、6mL甲醇活化；
[011引 3.2.3加樣淋洗:轉(zhuǎn)移上述待凈化液IOmL至固相萃取小柱，依次用6mL pH值4的水、 6mL甲醇淋洗SPE柱。
[0116] 3.2.4洗脫:低真空吹干SPE柱，用6mL 5 %的氨化甲醇洗脫待分析成分并接收，收 集液于50°C氮?dú)獯蹈?，用水定容?. OmL，滿流混合后過(guò)0.22皿濾膜，供LC-MS/MS分析。
[0117] 4 檢測(cè)
[0118] 待測(cè)樣品用液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜進(jìn)行測(cè)定，儀器參數(shù)條件見(jiàn)表1，選擇反應(yīng) 監(jiān)測(cè)母離子、子離子和碰撞能量見(jiàn)表2;其加標(biāo)樣品的MRM色譜圖如圖6所示，該樣品回收率 和精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種同步快速檢測(cè)配制酒中8種人工合成著色劑的LC-MS/MS方法，其特征是， 所述的8種人工合成著色劑為新紅、靛藍(lán)、酸性紫6B、羅丹明B、酸性紅、喹啉黃、萘酚黃 和亮黑； 具體包括以下步驟： (1) 制備：取配制酒樣品，加熱除去乙醇，加入超純水，用檸檬酸水溶液調(diào)試pH值至3-6， 得待凈化溶液； (2) 凈化： a、 同時(shí)萃取8種人工合成著色劑的固相萃取小柱的組裝:取40-60μπι陽(yáng)離子交換填料和 40-60μπι陰離子交換填料，填充于底端為聚乙烯篩板的聚丙烯小柱內(nèi)，填料上端再以聚乙烯 篩板固定； 所述的陽(yáng)離子交換填料和陰離子交換填料的比例為重量比1:0.5~1:2; b、 柱活化:將上述固相萃取小柱依次用pH值6-7的水、甲醇活化； c、 加樣淋洗:轉(zhuǎn)移步驟（1)的待凈化溶液至固相萃取小柱，依次用pH值3-6的水、甲醇淋 洗固相萃取小柱； d、 洗脫：吹干固相萃取小柱，用3%-6%的氨化甲醇洗脫待分析成分并接收，收集液氮 氣吹干，加水溶解，渦流混合后過(guò)0.22μπι濾膜，供LC-MS/MS分析； (3) 檢測(cè):步驟(2)得到的待測(cè)樣品用液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜進(jìn)行測(cè)定。2. 如權(quán)利要求1所述的一種同步快速檢測(cè)配制酒中8種人工合成著色劑的LC-MS/MS方 法，其特征是，所述步驟(3)中液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜的儀器參數(shù)條件如下： 液相色譜條件為： 色Thermo Syncronis C18 (??,Ι?Η?：. 3.0μι?ι, 150mmx2.1mm 流動(dòng)相 甲醇，5 mmol乙酸銨水溶液 流速 0.25 mL/min 進(jìn)樣量 丨ΟμL 柱溫 3〇'υ 梯度洗脫程序時(shí)間(mm) 甲醇(％) 5 mmol乙酸銨水溶液(％) 0.00 5 95 10.00 95 5 13.00 95 5 13*10 5 95 20 00 % 95 質(zhì)譜條件為： 離子源 電噴霧離子源 掃描方式 ESI源正負(fù)離子分段掃描模式 監(jiān)測(cè)方式 多反應(yīng)監(jiān)測(cè) 電噴霧電壓 4500 V 離子源溫度 500 ( 載氣流速 15 L/min 霧化器壓力 45psi。3. 如權(quán)利要求2所述的一種同步快速檢測(cè)配制酒中8種人工合成著色劑的LC-MS/MS方 法，其特征是，8種人工合成著色劑的LC-MS/MS分析參數(shù)如下表所示：4. 如權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)所述的一種同步快速檢測(cè)配制酒中8種人工合成著色劑 的LC-MS/MS方法，其特征是，所述陽(yáng)離子交換填料為選自苯磺酸鍵合聚苯乙烯二乙烯苯共 聚物PCX、苯磺酸鍵合硅膠SCX、丙磺酸鍵合硅膠PRS中的至少一種。5. 如權(quán)利要求4中所述的一種同步快速檢測(cè)配制酒中8種人工合成著色劑的LC-MS/MS 方法，其特征是，所述陽(yáng)離子交換填料為苯磺酸鍵合聚苯乙烯二乙烯苯共聚物PCX。6. 如權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)所述的一種同步快速檢測(cè)配制酒中8種人工合成著色劑 的LC-MS/MS方法，其特征是，所述的陰離子交換填料為選自聚酰胺PA、NH 2氨丙基鍵合硅膠、 多胺化聚苯乙烯二乙烯苯共聚物PWAX填料中的至少一種。7. 如權(quán)利要求6所述的一種同步快速檢測(cè)配制酒中8種人工合成著色劑的LC-MS/MS方 法，其特征是，所述的陰離子交換填料為多胺化聚苯乙烯二乙烯苯共聚物PWAX填料。8. 如權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)所述的一種同步快速檢測(cè)配制酒中8種人工合成著色劑 的LC-MS/MS方法，其特征是，具體包括以下步驟： (1) 制備:取配制酒樣品于燒杯中緩緩加熱至70°C攪拌除去乙醇，密封標(biāo)識(shí)，待用;稱取 樣品10g于25mL容量瓶中，加入10mL超純水，用檸檬酸水溶液調(diào)試pH值至3-6，超純水定容得 待凈化溶液； (2) 凈化： a、同時(shí)萃取8種人工合成著色劑的固相萃取小柱的組裝:分別稱取40_80mg 40-60μηι陽(yáng) 離子交換填料和40-80mg 40-60μπι陰離子交換填料，填充于底端為聚乙烯篩板的聚丙烯小 柱內(nèi)，填料上端再以聚乙烯篩板固定； b、 柱活化:將上述固相萃取小柱依次用4-8mL pH值6-7的水、4-8mL甲醇活化； c、 加樣淋洗:轉(zhuǎn)移步驟（1)的待凈化溶液8-15mL至固相萃取小柱，依次用4-8mL pH值3-6的水、4-8mL甲醇淋洗固相萃取小柱； d、 洗脫:低真空吹干固相萃取小柱，用4-8mL 3%-6%的氨化甲醇洗脫待分析成分并接 收，收集液于50°C氮?dú)獯蹈?，用水定容?. OmL，渦流混合后過(guò)0.22μπι濾膜，供LC-MS/MS分 析； (3)檢測(cè):步驟(2)得到的待測(cè)樣品用液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜進(jìn)行測(cè)定。9. 如權(quán)利要求8所述的一種同步快速檢測(cè)配制酒中8種人工合成著色劑的LC-MS/MS方 法，其特征是，分別稱取60mg 40-60μπι苯磺酸鍵合聚苯乙烯二乙烯苯共聚物PCX填料和60mg 40-60μπι多胺化聚苯乙烯二乙烯苯共聚物PWAX填料。10. 如權(quán)利要求8所述的一種同步快速檢測(cè)配制酒中8種人工合成著色劑的LC-MS/MS方 法，其特征是，所述洗脫步驟采用6ml的5 %氨化甲醇。
【文檔編號(hào)】G01N30/06GK105954413SQ201610309435
【公開(kāi)日】2016年9月21日
【申請(qǐng)日】2016年5月11日
【發(fā)明人】鄭新華, 王樂(lè), 韓煥美, 張景然
【申請(qǐng)人】濟(jì)南出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心