本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種肝癌患者接受切除術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險的預(yù)測標(biāo)志物及試劑盒。

背景技術(shù)：

肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是全球最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率分居第五和第二。據(jù)統(tǒng)計，我國每年肝癌的發(fā)病人數(shù)及肝癌導(dǎo)致的死亡人數(shù)均超過全球發(fā)病及死亡人數(shù)的50％。目前以肝切除術(shù)為代表的外科治療仍然是肝癌的首選治療方法，然而術(shù)后5年內(nèi)的復(fù)發(fā)率高達(dá)60％-70％，5年內(nèi)的死亡率高達(dá)30％-40％。術(shù)后的高復(fù)發(fā)率尤其是早期復(fù)發(fā)是導(dǎo)致患者遠(yuǎn)期療效差的主要原因。尋找能夠準(zhǔn)確預(yù)測患者術(shù)后復(fù)發(fā)的標(biāo)記物，對患者復(fù)發(fā)風(fēng)險進行評估，有助于篩選出高復(fù)發(fā)風(fēng)險患者，重點監(jiān)督并采取積極治療措施，延長患者生存時間。雖然目前已有很多研究致力于尋找能良好預(yù)測患者預(yù)后的方法，包括蛋白質(zhì)、核酸分子及現(xiàn)有臨床參數(shù)(瘤大小、數(shù)目、TNM分期及BCLC分期等)等，其中一些預(yù)后標(biāo)記物的預(yù)測功效已在臨床應(yīng)用中得到證實，但這些預(yù)后預(yù)測因子的預(yù)測效果仍然有待提升。因而仍迫切的需要篩選預(yù)測效果更加優(yōu)良的預(yù)后標(biāo)志物。

長非編碼RNAs(long noncoding RNA,LncRNAs)是一類核苷酸數(shù)超過200nt的非編碼RNA，在結(jié)構(gòu)上類似于mRNAs，但其不存在開放閱讀框(open reading frame，ORF)。LncRNAs可參與到表觀遺傳的調(diào)控，轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控，小RNA的加工過程以及其它的調(diào)控過程。已知曉的LncRNAs的功能可概括為調(diào)控信號通路、引導(dǎo)作用以及作為腳手架。越來越多的證據(jù)表明LncRNAs表達(dá)水平的失調(diào)與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。LncRNAs在正常組織和腫瘤組織中的差異性表達(dá)，可以作為預(yù)防和治療以及衡量腫瘤預(yù)后的指標(biāo)。

近年來已有大量報道證明了LncRNAs在HCC的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，從而影響患者的預(yù)后。H19是由H19基因編碼的長度為2.3kb的LncRNAs，對生長發(fā)育中的基因組印跡發(fā)揮重要作用。近期的研究表明H19在肝癌組織中的表達(dá)異常，H19的表達(dá)水平腫瘤/癌旁比值越低，預(yù)后越差。此外，還有研究表明H19促進細(xì)胞增殖，抑制肝癌發(fā)展和轉(zhuǎn)移。HOTAIR(HOX antisense intergenic RNA)轉(zhuǎn)錄自HOXC基因，在肝癌組織和肝癌細(xì)胞系中顯著高表達(dá)。下調(diào)HOTAIR可以抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)和血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)，從而影響細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。因此，HOTAIR的上調(diào)可能作為肝癌的轉(zhuǎn)移潛在標(biāo)志物。MALAT1(metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1)首先在非小細(xì)胞肺癌中發(fā)現(xiàn)， 其在肝癌中的高表達(dá)與肝癌的高轉(zhuǎn)移風(fēng)險和不良預(yù)后密切相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)MALAT1高表達(dá)的患者，接受肝移植后更易復(fù)發(fā)，MALAT1可作為監(jiān)測肝移植后腫瘤復(fù)發(fā)的生物標(biāo)記。HULC(highly up-regulated in liver cancer)是肝癌中升高最顯著的基因并且特異的在肝癌組織和肝癌病人的血液中高表達(dá)。HULC可抑制抑癌基因p18表達(dá)而促進肝癌細(xì)胞增殖。在肝癌病人的血清中也可以檢測出HULC，這為肝癌的預(yù)后判斷提供了新途徑。HEIH(High Expression in HCC)在肝癌組織中表達(dá)水平較高，而在合并肝硬化的肝癌中表達(dá)更高，其表達(dá)水平與HBV相關(guān)的肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)密切相關(guān)，是預(yù)測HBV相關(guān)肝癌患者術(shù)后總生存期的一個獨立指標(biāo)。

盡管LncRNAs數(shù)量龐大，但是LncRNAs的研究目前還處于早期階段。LncRNAs與肝癌預(yù)后的相關(guān)性仍然需要進一步探索。在正常情況下LncRNAs的組織表達(dá)特異性甚至高于mRNA，若從轉(zhuǎn)錄水平系統(tǒng)的篩選可能與患者預(yù)后相關(guān)的LncRNAs，同時考慮在肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中LncRNAs發(fā)揮的作用，將有助于找到預(yù)測效果更加優(yōu)異的預(yù)后標(biāo)記物。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的是針對以上所要解決的技術(shù)問題，提供一種用于評估肝癌患者接受切除術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險的預(yù)測標(biāo)志物及多基因組合試劑盒。

為實現(xiàn)上述技術(shù)目的，本發(fā)明提供了一種肝癌患者接受切除術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險的預(yù)測標(biāo)志物，包括分別編碼以下LncRNAs的核酸分子中的一種或幾種：AK026286、AK091204、AK094613、CV403656、NR_004855、uc001gji、uc001mjl或uc003fpg。

在一個優(yōu)選的實施方案中，所述LncRNAs在肝癌患者的腫瘤組織中水平高于或低于相應(yīng)的癌旁組織；AK091204、AK094613、NR_004855、uc001gji、uc001mjl及uc003fpg在腫瘤組織中水平高于相應(yīng)的癌旁組織，AK026286及CV403656在腫瘤組織中水平低于相應(yīng)的癌旁組織。優(yōu)選地，所述肝癌為原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌。

另一方面，本發(fā)明還提供了一種用于肝癌患者接受切除術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險的預(yù)測LncRNAs分子組合，包括AK026286、AK091204、AK094613、CV403656、NR_004855、uc001gji、uc001mjl及uc003fpg。

在一個優(yōu)選的實施方案中，所述AK091204、AK094613、NR_004855、uc001gji、uc001mjl及uc003fpg在肝癌組織中的表達(dá)水平相對于癌旁組織上調(diào)，所述AK026286及CV403656在肝癌組織中的表對水平相對于癌旁組織下調(diào)。優(yōu)選地，所述肝癌為原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌。

具體而言，本發(fā)明通過以下步驟得到了上述由8個組織LncRNAs組成的肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險評估組合：

1.通過分析芯片數(shù)據(jù)及查閱文獻得到可能與肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)相關(guān)的候選LncRNAs；

2.肝癌及其對應(yīng)癌旁組織中采用實時熒光定量PCR驗證候選LncRNAs的表達(dá)差異；

3.在由156例肝癌患者組成的訓(xùn)練組中確立可區(qū)分肝癌患者術(shù)后是否發(fā)生早期復(fù)發(fā)的組織LncRNAs組合；

4.在由174例肝癌患者組成的驗證組中驗證步驟3確立的組織LncRNAs組合預(yù)測肝癌患者術(shù)后早期復(fù)發(fā)情況的能力；

5.比較步驟3確立的組織LncRNAs組合與腫瘤直徑、腫瘤數(shù)目及BCLC分期對肝癌患者早期復(fù)發(fā)情況的預(yù)測效果；

6.分析步驟3確立的組織LncRNAs組合在小肝癌、單個腫瘤、無門靜脈癌栓及BCLC分期0/A期的肝癌患者中的預(yù)測效果

7.分析步驟3確立的組織LncRNAs組合是否可以獨立預(yù)測肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)。

對實驗結(jié)果進行分析及相關(guān)統(tǒng)計顯示：上述步驟1中，發(fā)明人通過分析基因芯片及查閱文獻確定了31個候選LncRNAs，步驟2中驗證確定了在肝癌及其對應(yīng)癌旁組織中表達(dá)差異顯著的20個候選LncRNAs。由于早期復(fù)發(fā)是影響患者術(shù)后生存期短的主要原因，防止復(fù)發(fā)的關(guān)鍵時間在于術(shù)后第一年內(nèi)。所以本發(fā)明將1年，即早期復(fù)發(fā)作為預(yù)測目標(biāo)。進一步在訓(xùn)練組標(biāo)本中檢測候選LncRNAs的表達(dá)水平，并確立了可區(qū)分肝癌患者是否發(fā)生術(shù)后早期復(fù)發(fā)的、由8個LncRNAs構(gòu)成的最優(yōu)組合：AK026286、AK091204、AK094613、CV403656、NR_004855、uc001gji、uc001mjl及uc003fpg。進一步，在獨立的驗證組中驗證了該組織LncRNAs組合能夠區(qū)分發(fā)生早期復(fù)發(fā)的肝癌患者與早期無復(fù)發(fā)患者。與此同時，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)相較臨床常用的預(yù)后手段，如腫瘤直徑、腫瘤數(shù)目及BCLC分期等，該組織LncRNAs組合具有更好的預(yù)測預(yù)后的效果。在小肝癌、單個腫瘤、無門靜脈癌栓及BCLC 0/A期的肝癌患者中，該組織LncRNAs組合預(yù)測出的高復(fù)發(fā)風(fēng)險患者早期復(fù)發(fā)風(fēng)險高于低風(fēng)險患者。多因素分析中，該組織LncRNAs組合可作為獨立預(yù)測肝癌患者術(shù)后早期復(fù)發(fā)的指標(biāo)。

在另一個方面，本發(fā)明還公開了一種肝癌患者接受切除術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險的預(yù)測試劑盒，包含用于檢測以下8個LncRNAs分子在肝癌患者腫瘤組織中表達(dá)水平的試劑：AK026286、AK091204、AK094613、CV403656、NR_004855、uc001gji、uc001mjl及uc003fpg；所述用于檢測LncRNAs分子在腫瘤組織中表達(dá)水平的試劑為實時熒光定量PCR相關(guān)試劑。

在一個優(yōu)選的實施方案中，包括檢測LncRNAs基因表達(dá)水平的特異性引物對：檢測AK026286的SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，檢測AK091204的SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4，檢測AK094613的SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6，檢測CV403656的SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8，檢測NR_004855的SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10，檢測uc001gji的SEQ ID NO:11 和SEQ ID NO:12，檢測uc001mjl的SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14，檢測uc003fpg的SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16。

進一步，計算肝癌患者復(fù)發(fā)風(fēng)險值的計算公式為：Logit[p＝Recurrence]＝-0.379-1.16*AK091204-0.712*AK094613+1.296*CV403656-0.861*NR_004855-0.786*uc001gji-0.493*uc001mjl+1.428*uc003fpg，其中AK026286、AK091204、AK094613、CV403656、NR_004855、uc001gji、uc001mjl及uc003fpg為相應(yīng)組織LncRNAs檢測水平離散化后的數(shù)值，風(fēng)險值以-0.655為預(yù)測閾值，大于-0.655則預(yù)測為高復(fù)發(fā)風(fēng)險，小于等于-0.655則預(yù)測為低復(fù)發(fā)風(fēng)險。由此，所述的預(yù)測試劑盒可應(yīng)用于肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險預(yù)警。

進一步，所述肝癌為原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌。

相對于現(xiàn)有技術(shù)，組織LncRNAs組合用于肝癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險預(yù)測的優(yōu)越性在于：第一，患者的腫瘤組織標(biāo)本易于獲得，且RT-qPCR檢測手段所需組織量極少，少量組織標(biāo)本可用于多次檢測。第二，組織LncRNAs組合中各基因表達(dá)豐度較高且穩(wěn)定性好，檢測便利。第三，實驗方法非常成熟，檢測過程簡便、易于重復(fù)，由普通的技術(shù)員均可以完成。第四，本發(fā)明從基因芯片及文獻中篩選目標(biāo)基因，并在驗證組驗證，對組織LncRNAs組合以及試劑盒的預(yù)測效果進行了全面評估，以上方法和策略的應(yīng)用保證了本發(fā)明在肝癌臨床預(yù)后預(yù)測中的潛在應(yīng)用價值，并為其它疾病生物標(biāo)志物的研制提供可借鑒的方法策略。第五，組織LncRNAs預(yù)測肝癌復(fù)發(fā)試劑盒能準(zhǔn)確評估單個肝癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險，并對高風(fēng)險患者進行預(yù)警，便于臨床醫(yī)生及時采取個性化的預(yù)防復(fù)發(fā)的方案，同時避免低風(fēng)險患者的過度治療。

為了更好地理解和實施，下面結(jié)合附圖詳細(xì)說明本發(fā)明。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實施例4、5中的ROC曲線圖。訓(xùn)練組(A)、驗證組(B)中組織LncRNAs組合預(yù)測肝癌患者術(shù)后1年內(nèi)復(fù)發(fā)的ROC曲線。

圖2為本發(fā)明實施例6在訓(xùn)練組、驗證組中的ROC曲線圖。訓(xùn)練組(A)、驗證組(B)中組織LncRNAs組合、腫瘤直徑、腫瘤數(shù)目及BCLC分期預(yù)測肝癌患者術(shù)后1年內(nèi)復(fù)發(fā)的ROC曲線。

具體實施方式

為使本發(fā)明更加容易理解，下面結(jié)合附圖和具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明，而不用于限制本發(fā)明的范圍；所描述的附圖也僅是示意性的，被認(rèn)為是非限制性的。

實施例1：腫瘤組織標(biāo)本的采集及制備

發(fā)明人采集了于2001年1月至2013年11月間接受肝癌切除術(shù)的肝癌患者(HCC)的腫瘤組織標(biāo)本，這些人群滿足以下入組標(biāo)準(zhǔn)，并根據(jù)性別、年齡匹配的原則，設(shè)定肝癌及其對照組標(biāo)本。入組標(biāo)準(zhǔn)：(1)原發(fā)性肝癌，初治且行根治性手術(shù)切除；(2)年齡在18—80歲之間；(3)確診時無伴隨肝外轉(zhuǎn)移；(4)術(shù)前未患其他惡性疾病，且或術(shù)后復(fù)發(fā)前無抗癌治療；(5)術(shù)后未出現(xiàn)任何器官嚴(yán)重失調(diào)癥狀。

訓(xùn)練組：2001年1月至2009年12月間接受肝癌切除術(shù)的HCC腫瘤組織標(biāo)本156例。

驗證組：2006年1月至2013年11月間接受肝癌切除術(shù)的HCC腫瘤組織標(biāo)本174例。

上述參與人群的臨床特征見表1。

切除術(shù)后獲得HCC腫瘤組織，立即凍存于液氮或使用RNALater處理，保存于超低溫冰箱(-80℃)。

表1訓(xùn)練組及驗證組參與者的臨床病理特征

實施例2：基因芯片及其數(shù)據(jù)分析

本發(fā)明從GEO數(shù)據(jù)庫中下載HCC Array數(shù)據(jù)(GEO ID：GSE54238；Title：LncRNAs and mRNAs expression profile in liver diseases including HCC)，并從中篩選出的可能影響預(yù)后的基因，其組成如下：(1)在NL(正常肝組織)、IL(炎癥肝組織)、CL(肝硬化組織)、eHCC(早期肝癌組織)及aHCC(晚期肝癌組織)組中表達(dá)水平變化依次升高或降低的LncRNAs，去掉低表達(dá)的LncRNA，得到候選LncRNAs 636個；(2)為了篩選出不受HBV影響但可能與預(yù)后相關(guān)的基因，我們?nèi)サ粜酒懈腥綡BV的病人樣本后，按照(1)中篩選方法，得到候選基因236個。(3)結(jié)合文獻報道，篩選出在HCC發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮功能的LncRNAs 12個。

通過生物信息學(xué)方法對上述候選LncRNAs基因進行序列及表達(dá)特征分析(UCSC：http://genome.ucsc.edu/人類基因組數(shù)據(jù)庫，version 19)，去掉無法在基因組準(zhǔn)確定位的LncRNAs，無轉(zhuǎn)錄活性標(biāo)記(H3K4me3，H3K27Ac)的LncRNAs，無特異性擴增引物的LncRNAs基因。剩下符合條件的LncRNAs 74條。針對這些LncRNAs設(shè)計引物qPCR引物，并在6份等比例混合的HCC腫瘤組織cDNA中檢測各基因的表達(dá)水平，去除表達(dá)水平Ct值大于30及無法設(shè)計出特異引物的LncRNAs，得到LncRNAs基因共31個。在20對N/T(肝癌組織及對應(yīng)癌旁組織)組織中檢測這些基因的表達(dá)水平，以U6為內(nèi)參進行校準(zhǔn)，得到20個差異顯著并用于后續(xù)驗證的候選LncRNAs：BC020899、AF339810、AK026286、CV403656、NR_003605、NR_015366、uc001gji、uc001bqo、uc001nvt、NR_002599、uc003fpg、uc001mjl、AK091204、NR_103844.1、NR_002819、NR_002766、AK094613、NR_003367、NR_045680及NR_004855。

實施例3：實時熒光定量PCR檢測訓(xùn)練組標(biāo)本LncRNAs表達(dá)水平

1、組織RNA提取

本發(fā)明采用Trizol試劑提取，具體步驟如下：(1)對于RNALater或液氮中保存的組織，按每50mg組織加入1ml Trizol的比例裂解細(xì)胞；(2)轉(zhuǎn)移Trizol裂解液到1.5ml的Rnase free EP管中振蕩混勻，室溫放置5min后加入1/5裂解液體積的氯仿，振蕩混勻，4℃、12000g離心15min；吸上清，加入等體積異丙醇，室溫放置10min，于4℃、12000g離心30min；(3)棄上清，用70％乙醇洗滌沉淀兩次，小心傾倒上清，待酒精揮發(fā)盡后加入適量DEPC水溶解RNA，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表2本發(fā)明采用的候選LncRNAs及內(nèi)源參照的引物序列

2、實時熒光定量RT-PCR(RT-qPCR)

本發(fā)明優(yōu)選地采用MMLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega)對等量的組織RNA進行逆轉(zhuǎn)錄。進一步優(yōu)選地采用SYBR Green qPCR master mix試劑盒(life)，以上述cDNA為模板，DNA寡核苷酸引物(由英駿公司合成，引物信息見表2)進行RT-qPCR檢測。

通過內(nèi)源參照U6校準(zhǔn)，得到目標(biāo)LncRNAs的表達(dá)值2^-ΔCt(ΔCt＝Ct_taget-Ct_reference)。

實施例4：訓(xùn)練組中確定最優(yōu)組織LncRNAs組合

繪制訓(xùn)練組中每個LncRNA基因表達(dá)水平預(yù)測患者術(shù)后一年內(nèi)復(fù)發(fā)的ROC曲線，取其ROC曲線上最靠近左上角的點作為最優(yōu)分界點，該點滿足(1-sensitivity)²+(1-specificity)²值最小，而該點對應(yīng)的基因表達(dá)水平數(shù)值則為分界值(訓(xùn)練組中每個基因分界值將直接用于驗證組)，若患者該基因表達(dá)水平大于分界值，則病人該基因的表達(dá)值賦為1，小于等于分界值則賦值為0。對每個病人采用上述方法賦值后，我們得到病人所有基因表達(dá)量為1或0的離 散化數(shù)值，用于下一步的模型構(gòu)建。本發(fā)明采用的LncRNAs離散化閾值(表3)將用于訓(xùn)練組、驗證組中相應(yīng)LncRNA數(shù)據(jù)的離散化，從而將連續(xù)變量轉(zhuǎn)變?yōu)槎诸愖兞?。利用支持向量機和交叉驗證的方法對獲得的20個LncRNAs進行分類器的建立，最終獲得一個由8個LncRNAs分子組成的組合，可有效地預(yù)測肝癌病人術(shù)后1年內(nèi)復(fù)發(fā)的風(fēng)險。為了簡化試劑盒的使用，利用上述8個分子指標(biāo)構(gòu)建了預(yù)測患者術(shù)后早期復(fù)發(fā)的logistic回歸模型分析，并獲得用于計算患者復(fù)發(fā)風(fēng)險值的計算式：即患者復(fù)發(fā)風(fēng)險值Logit[p＝Recurrence]＝-0.379-1.16*AK091204-0.712*AK094613+1.296*CV403656-0.861*NR_004855-0.786*uc001gji-0.493*uc001mjl+1.428*uc003fpg，其中LncRNAs基因AK026286、AK091204、AK094613、CV403656、NR_004855、uc001gji、uc001mjl及uc003fpg為相應(yīng)組織LncRNAs檢測水平離散化后的數(shù)值，風(fēng)險值以-0.655為預(yù)測閾值，大于-0.655則預(yù)測為高復(fù)發(fā)風(fēng)險，小于等于-0.655則預(yù)測為低復(fù)發(fā)風(fēng)險。

表3本發(fā)明采用的LncRNAs的引物信息及離散化閾值

該LncRNAs組合在訓(xùn)練組中可區(qū)分肝癌患者術(shù)后1年內(nèi)復(fù)發(fā)與未復(fù)發(fā)人群，能有效地預(yù)測肝癌患者是否發(fā)生1年內(nèi)復(fù)發(fā)(AUC為0.765，圖1A)，且預(yù)測效果優(yōu)于腫瘤直徑、腫瘤數(shù)目及BCLC分期，該LncRNAs組合的AUC大于其它指標(biāo)(圖2A)。

實施例5：驗證組中驗證組織LncRNAs組合預(yù)測肝癌患者術(shù)后早期復(fù)發(fā)風(fēng)險的效果

將訓(xùn)練組中確立的組織LncRNAs組合用于驗證組預(yù)測肝癌患者復(fù)發(fā)情況。同樣地，采用Trizol提取以及實時熒光定量PCR檢測方法進行實驗。所述組合在驗證組中仍可區(qū)分術(shù)后1年內(nèi)復(fù)發(fā)與未復(fù)發(fā)的肝癌患者，能有效地預(yù)測肝癌患者術(shù)后1年內(nèi)是否復(fù)發(fā)(AUC為0.677，圖1B)，對肝癌患者發(fā)生1年內(nèi)復(fù)發(fā)的預(yù)測效果優(yōu)于腫瘤直徑、腫瘤數(shù)目及BCLC分期，該LncRNAs組合的AUC大于其它指標(biāo)(圖2B)。

實施例6：組織LncRNAs組合在腫瘤直徑、腫瘤數(shù)目、無門靜脈癌栓及BCLC分期0/A期肝癌患者中的預(yù)測效果

本發(fā)明進一步證明了組織LncRNAs組合，在腫瘤直徑小于5cm、腫瘤數(shù)目為單個、無門靜脈癌栓及BCLC分期0/A期的肝癌患者中預(yù)測患者術(shù)后1年內(nèi)復(fù)發(fā)的可能(表4)。具體表現(xiàn)為，該LncRNAs組合預(yù)測的高風(fēng)險的患者，術(shù)后1年內(nèi)復(fù)發(fā)的可能性顯著高于預(yù)測的低風(fēng)險患者(p<0.05)。

表4驗證組中組織LncRNAs組合評估小肝癌、單個腫瘤、無門靜脈癌栓及BCLC分期為0/A期的肝癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險

實施例7：單因素及多因素分析與復(fù)發(fā)相關(guān)的因素：組織LncRNAs組合、腫瘤直徑、腫瘤數(shù)目及BCLC分期

本發(fā)明通過logistic回歸分析了組織LncRNAs組合與患者術(shù)后早期復(fù)發(fā)的相關(guān)性。將年齡、性別、BCLC分期及其它與BCLC分期信息無重疊的臨床指標(biāo)一起納入多因素logistic分析，結(jié)果表明，組織LncRNAs組合可以作為獨立預(yù)測(P<0.0001)肝癌患者術(shù)后早期復(fù)發(fā)的指標(biāo)(表5)。

表5驗證組中單因素及多因素logistic回歸分析與術(shù)后早期復(fù)發(fā)相關(guān)的指標(biāo)

P*:經(jīng)過年齡、性別等因素校正。

實施例8：組織LncRNAs試劑盒的制作

本發(fā)明試劑盒用于評估肝細(xì)胞肝癌患者接受切除術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險，由組織LncRNAs提取系統(tǒng)、反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)、實時熒光定量PCR系統(tǒng)、引物系統(tǒng)以及用于評估是否罹患肝癌的logistic回歸分析方法組成。

所述試劑盒的組織RNA提取系統(tǒng)中，發(fā)明人優(yōu)選地采用Trizol試劑提取獲得組織RNA。發(fā)明人采用MMLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega)進行逆轉(zhuǎn)錄，進一步優(yōu)選地采用SYBR Green qPCR master mix(life)試劑盒，運用RT-qPCR技術(shù)檢測以下分子：AK026286、AK091204、AK094613、CV403656、NR_004855、uc001gji、uc001mjl及uc003fpg，引物由英俊公司合成，內(nèi)源參照為U6。具體引物序列見表3。即患者復(fù)發(fā)風(fēng)險值Logit[p＝Recurrence]＝-0.379-1.16*AK091204-0.712*AK094613+1.296*CV403656-0.861*NR_004855-0.786*uc001gji-0.493*uc001mjl+1.428*uc003fpg，其中AK026286、AK091204、AK094613、CV403656、NR_004855、uc001gji、uc001mjl及uc003fpg為相應(yīng)組織LncRNAs檢測水平離散化后的數(shù)值，風(fēng)險值以-0.655為預(yù)測閾值，大于-0.655則預(yù)測為高復(fù)發(fā)風(fēng)險，小于等于-0.655則預(yù)測為低復(fù)發(fā)風(fēng)險。

本發(fā)明并不局限于上述實施方式，如果對本發(fā)明的各種改動或變形不脫離本發(fā)明的精神和范圍，倘若這些改動和變形屬于本發(fā)明的權(quán)利要求和等同技術(shù)范圍之內(nèi)，則本發(fā)明也意圖 包含這些改動和變形。