本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及稻瘟病技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種稻瘟病抗性基因Pi5功能特異性分子標(biāo)記及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

水稻是世界上最重要的糧食作物之一，每年因稻瘟病造成的經(jīng)濟(jì)損失達(dá)數(shù)十億美元(鄭釗等，2009)。我國(guó)水稻主產(chǎn)區(qū)幾乎都受到稻瘟病的危害，年發(fā)病面積到330-570萬(wàn)公頃，損失稻谷數(shù)億公斤。從糧食安全和水稻遺傳育種的角度來(lái)看，培育抗病品種是防治稻瘟病最經(jīng)濟(jì)有效的方法之一。但由于稻瘟病生理小種致病性變異快，單一抗性品種的抗性會(huì)逐漸喪失(殷得所等，2011)；而傳統(tǒng)的抗病育種策略存在工作量大，周期長(zhǎng)等特點(diǎn)。因此，迫切需要改變傳統(tǒng)抗病育種的策略?；诜肿訕?biāo)記輔助選擇(Marker-associated selection，MAS)技術(shù)的抗病分子育種具有對(duì)目標(biāo)性狀的選擇不受基因表達(dá)和環(huán)境條件影響、可在植株生長(zhǎng)的任何階段進(jìn)行、能在分離世代快速準(zhǔn)確地鑒定植株基因型、還可以有效克服目標(biāo)基因與不利基因的連鎖累贅等優(yōu)點(diǎn)，已被用在水稻稻瘟病的抗性育種領(lǐng)域。然而與目的基因緊密連鎖的分子標(biāo)記在應(yīng)用過(guò)程中有可能受到遺傳背景的限制，在不同的群體中需對(duì)親本的多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)；另外，與目的基因有一定距離的分子標(biāo)記仍然存在著因染色體發(fā)生交換而失去了目的基因的可能性，這使得在目的基因鑒定過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)錯(cuò)選或漏選的情況(Hayashi et al.，2006；Ingvardsen et al.，2008)。然而，基于基因內(nèi)部序列所開(kāi)發(fā)的基因特異性分子標(biāo)記可以使上述問(wèn)題得到有效解決，從而提高抗性基因的利用效率，有助于稻瘟病抗性育種的開(kāi)展。

Pi5是定位于第9染色體上的廣譜抗稻瘟病基因(Jeon等，1994)，測(cè)序發(fā)現(xiàn)Pi5-1和Pi5-2分別有5和6個(gè)外顯子。Pi5介導(dǎo)的稻瘟病抗性需要同時(shí)具有這兩個(gè)基因，抗性基因Pi5所表現(xiàn)出的稻瘟病廣譜抗性使其在稻瘟病抗性育種工作中具有極大的應(yīng)用價(jià)值。但是，Pi5在我國(guó)水稻種質(zhì)資源和品種中的分布情況尚不明了，制約了該抗性基因在育種中的廣泛應(yīng)用。為了能更準(zhǔn)確有效地將稻瘟病廣譜抗性基因Pi5應(yīng)用到水稻抗性育種工作中，有必要在抗性基因Pi5的基因內(nèi)部開(kāi)發(fā)出Ρi5特異的InDel分子標(biāo)記，這種基因特異性分子標(biāo)記能對(duì)目標(biāo)基因篩選的準(zhǔn)確率理論值達(dá)100％。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

解決的技術(shù)問(wèn)題：為了能更快、更有效地將稻瘟病抗性基因Pi5應(yīng)用到抗性育種中，本發(fā)明提供一種稻瘟病抗性基因Pi5基因特異性分子標(biāo)記Pi5InDel及其應(yīng)用。該分子標(biāo)記Pi5InDel基于基因序列插入缺失的差異(Insertion-deletion，InDel)研究得到，其能提高該基因在分子標(biāo)記輔助選擇育種、基因聚合育種，以及轉(zhuǎn)基因育種中的利用效率。

技術(shù)方案：水稻稻瘟病抗性基因Pi5功能特異性分子標(biāo)記，命名為Pi5InDel，核酸序列如SEQ ID NO.1所示。

上述攜帶有稻瘟病抗性基因Pi5的稻瘟病抗性品種為水稻抗病品種IRBL5-M。

上述分子標(biāo)記在鑒別水稻品種稻瘟病抗性基因中的應(yīng)用。

上述應(yīng)用包含如下步驟:(1)擴(kuò)增:利用引物Fl和Rl對(duì)待檢測(cè)的水稻品種的基因組進(jìn)行PCR；(2)檢測(cè):分子量大小為93bp的的核苷酸片段，則待檢測(cè)的水稻品種攜帶有稻瘟病抗性基因Pi5；若沒(méi)有檢測(cè)到分子量大小為93bp的核苷酸片段，則待檢測(cè)的水稻品種沒(méi)有攜帶有稻瘟病抗性基因Pi5。

用于擴(kuò)增所述分子標(biāo)記的引物對(duì)，核酸序列如下所示：

SEQ ID NO.2：Fl:5’-GTTTCGAGATAGTGCTAA-3’；

SEQ ID NO.3：Rl:5’-GAATGACAGTAATAGAAA-3’。

一種鑒別水稻品種稻瘟病抗性基因的試劑盒，含有核酸序列如SEQ ID NO.1所示的Pi5InDel，以及如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所述的引物對(duì)。

本發(fā)明的原理:插入/缺失(insertion-deletion，InDel)標(biāo)記基于PCR擴(kuò)增技術(shù)，因其穩(wěn)定性好、多態(tài)性高、分型系統(tǒng)簡(jiǎn)單，開(kāi)始應(yīng)用于動(dòng)植物群體遺傳分析、分子輔助育種以及醫(yī)學(xué)診斷等領(lǐng)域。本發(fā)明通過(guò)多序列比對(duì)的方法尋找Pi5基因序列內(nèi)部出現(xiàn)的InDel，據(jù)此位點(diǎn)的上下游設(shè)計(jì)引物對(duì)F1/R1，用其進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增，攜帶有Pi5水稻品種的擴(kuò)增產(chǎn)物分子量大小為93bp，在本發(fā)明所要求的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)時(shí)，攜帶Pi5水稻品種的酶切產(chǎn)物分子量為93bp，而不攜帶Pi5的水稻品種的酶切產(chǎn)物分子量以95bp或無(wú)帶呈現(xiàn)。

有益效果：(1)本發(fā)明提供的分子標(biāo)記特異性高：Pi5所在的基因組區(qū)域存在著功能與非功能基因非特性片段，利用已有的標(biāo)記鑒定會(huì)有很多假陽(yáng)性的結(jié)果出現(xiàn)。本發(fā)明提供的分子標(biāo)記是經(jīng)過(guò)不斷地進(jìn)行序列多態(tài)性搜查，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證得到的，能明顯地將Pi5與存在于該基因組區(qū)域內(nèi)與Pi5高度同源的旁系同源基因區(qū)分開(kāi)來(lái)。

(2)本發(fā)明提供的分子標(biāo)記在實(shí)際應(yīng)用中低成本、高通量：目前，InDel標(biāo)記檢測(cè)方式簡(jiǎn)單便捷，對(duì)儀器設(shè)備和技術(shù)要求較低，在電泳技術(shù)平臺(tái)上即可進(jìn)行。本發(fā)明提供的InDel分子標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物帶型清晰簡(jiǎn)單，其穩(wěn)定性和產(chǎn)物分離效果較好；由于擴(kuò)增產(chǎn)物較短，對(duì)DNA質(zhì)量要求較低，且對(duì)樣品量要求較少，甚至能擴(kuò)增高度降解的DNA，特別適用于生產(chǎn)實(shí)踐中。

(3)本發(fā)明是第一個(gè)針對(duì)Pi5基因內(nèi)部序列所開(kāi)發(fā)的Pi5基因特異性InDel標(biāo)記。本發(fā)明能用電泳檢測(cè)的方法成功地將Pi5與定位在該位點(diǎn)上的其它非Pi5基因區(qū)分開(kāi)。到目前為止，還沒(méi)有有關(guān)這類(lèi)標(biāo)記的報(bào)道。本發(fā)明所提供的Pi5特異性分子標(biāo)記Pi5InDel是一個(gè)共顯性標(biāo)記，在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中其可靠性和準(zhǔn)確性?xún)?yōu)于顯性標(biāo)記。本發(fā)明可應(yīng)用于種質(zhì)資源分析、Pi5轉(zhuǎn)基因鑒定，基因聚合(尤其是序列高度同源的等位基因的聚合)，以及基于MAS技術(shù)的水稻抗性育種工作中。該標(biāo)記存在于Pi5基因內(nèi)部，因此對(duì)Pi5的篩選能力理論值可達(dá)100％，這樣的篩選能力優(yōu)于已報(bào)道的與Pi5連鎖的分子標(biāo)記。

(4)本發(fā)明提供的分子標(biāo)記能廣泛應(yīng)用于遺傳背景不同的群體中?，F(xiàn)有的與Pi5連鎖的分子標(biāo)記大部分都是針對(duì)同一個(gè)群體2個(gè)不同親本的序列多態(tài)性所開(kāi)發(fā)的，這些標(biāo)記在其它群體中的適用性有限。本發(fā)明適用于任何遺傳背景下的種質(zhì)資源分析、轉(zhuǎn)基因育種、基因聚合以及基于MAS技術(shù)的抗性育種，無(wú)需重復(fù)進(jìn)行親本多態(tài)性的篩選，大大提高了育種效率。

因此，本發(fā)明所提供的稻瘟病抗性基因Pi5基因特異性分子標(biāo)記具有重要的應(yīng)用價(jià)值，利用此標(biāo)記可以提高該基因在分子標(biāo)記輔助選擇育種、基因聚合育種，以及轉(zhuǎn)基因育種中利用的效率。

附圖說(shuō)明

圖1是JJ813標(biāo)記在12份代表性品種中的擴(kuò)增情況，其中:泳道M為DNA ladder，泳道2～12的DNA模板依次為抗性品種IRBL5-M(Pi5)、中花16、粵野占、花節(jié)糯、天豐B、明恢63、日本晴、9311、桂朝2號(hào)、連粳7號(hào)、II-32A、廣占63s。

圖2是Pi5基因特異性分子標(biāo)記Pi5SNP與JJ813的對(duì)比驗(yàn)證圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。

實(shí)施例1:稻瘟病抗性基因Pi5基因特異性分子標(biāo)記及其引物設(shè)計(jì)與檢測(cè)

(1)Pi5插入/缺失(insertion-deletion，InDel)位點(diǎn)的分析:

從公共數(shù)據(jù)庫(kù)中下載得到已經(jīng)公開(kāi)發(fā)表的Pi5基因組序列(Genebank收錄號(hào)分別為：EU869185，EU869186)，針對(duì)Pi5位點(diǎn)進(jìn)行設(shè)計(jì)引物，篩查Pi5特異的、能區(qū)別于該位點(diǎn)其他稻瘟病等位抗性基因的插入/缺失(InDel)差異位點(diǎn)。具有基因特異性InDel的水稻稻瘟病抗性基因Pi5與其它含有非Pi5功能基因的品種多序列比對(duì)結(jié)果如下，其中，缺失的兩個(gè)堿基部分即為鑒定到的Pi5基因插入/缺失(InDel)差異位點(diǎn)。

IRBL5-M：TATATTTTTCTGTCCCTTAAAATAGTTTTTTTT--CTATTACTGTCATTCATGTGACTCATTTTGTTTTTTAG

Zegu：TATATTTTTCTGTCCCTTAAAATAGTTTTTTTT--CTATTACTGTCATTCATGTGACTCATTTTGTTTTTTAG

Lianjing 7hao：TATATTTTTCTGTCCCTTAAAATAGTTTTTTTT--CTATTACTGTCATTCATGTGACTCATTTTGTTTTTTAG

Lianjing11hao：TATATTTTTCTGTCCCTTAAAATAGTTTTTTTT--CTATTACTGTCATTCATGTGACTCATTTTGTTTTTTAG

Yueyezhan：TATATTTTTCTGTCCCTTAAAATAGTTTTTTTTTTCTATTACTGTCATTCATGTGACTCATTTTGTTTTTTAG

Zhonghua16：TATATTTTTCTGTCCCTTAAAATAGTTTTTTTTTTCTATTACTGTCATTCATGTGACTCATTTTGTTTTTTAG

Guicao 2hao：TATATTTTTCTGTCCCTTAAAATAGTTTTTTTTTTCTATTACTGTCATTCATGTGACTCATTTTGTTTTTTAG

Jiayu 948：TATATTTTTCTGTCCCTTAAAATAGTTTTTTTTTTCTATTACTGTCATTCATGTGACTCATTTTGTTTTTTAG

Huanjienuo：TATATTTTTCTGTCCCTTAAAATAGTTTTTTTTTTCTATTACTGTCATTCATGTGACTCATTTTGTTTTTTAG

Yuxian 7hao：TATATTTTTCTGTCCCTTAAAATAGTTTTTTTTTTCTATTACTGTCATTCATGTGACTCATTTTGTTTTTTAG

Fengxinzhan：TATATTTTTCTGTCCCTTAAAATAGTTTTTTTTTTCTATTACTGTCATTCATGTGACTCATTTTGTTTTTTAG

Yixiang 1B：TATATTTTTCTGTCCCTTAAAATAGTTTTTTTTTTCTATTACTGTCATTCATGTGACTCATTTTGTTTTTTAG

Minghui63：TATATTTTTCTGTCCCTTAAAATAGTTTTTTTTTTCTATTACTGTCATTCATGTGACTCATTTTGTTTTTTAG

Zinuo：TATATTTTTCTGTCCCTTAAAATAGTTTTTTTTTTCTATTACTGTCATTCATGTGACTCATTTTGTTTTTTAG

Minghui81：TATATTTTTCTGTCCCTTAAAATAGTTTTTTTTTTCTATTACTGTCATTCATGTGACTCATTTTGTTTTTTAG

(2)設(shè)計(jì)引物：

根據(jù)InDel標(biāo)記的設(shè)計(jì)原理，在所述InDel位點(diǎn)處的上下游設(shè)計(jì)引物，引物對(duì)堿基序列如下所示：

F1：5’-GTTTCGAGATAGTGCTAA-3’；

R1：5’-GAATGACAGTAATAGAAA-3’。

(3)PCR擴(kuò)增，獲得含有Pi5基因特異性InDel的片段

利用上述引物對(duì)F1和R1，以上述的12個(gè)水稻品種的總DNA(使用CTAB法提取植物基因組DNA得到)為模板，進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，連接到Pmd18-T Vector上，挑PCR法確認(rèn)含有插入目的片段的進(jìn)行測(cè)序(賽默飛世爾科技有限公司)。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系如下：

2x Reaction Mix：12.5μL

引物F1(10μM)：1μL

引物R1(10μM)：1μL

Golden DNA polymerase：0.4μL

DNA模板(20-50ng/μL)：1μL

ddH₂O：補(bǔ)足至25μL。

PCR溫度循環(huán)條件如下：94℃3分鐘；94℃30秒、58℃30秒、72℃30秒，35個(gè)循環(huán)；72℃5分鐘；10℃保存。

PCR反應(yīng)結(jié)束后，取適量酶切樣品在1％的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)，電泳條件為90V，20分鐘，試劑盒純化。

(4)PCR產(chǎn)物連接、測(cè)序

1)在微量離心管中配制下列DNA溶液全量為5μL。

18-T Vector*1 1μL

純化PCR產(chǎn)物4μL

2)加入5μL等量的Solution I。

3)16℃反應(yīng)30分鐘。

4)全量10μL加入至100μL JM109感受態(tài)細(xì)胞中，冰中放置30分鐘。

5)42℃加熱45秒鐘后再在冰中放置1分鐘。

6)加入890μL SOC培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)60分鐘。

7)在含有Amp的L-瓊脂平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，形成單菌落。

8)挑選白色菌落，使用PCR法確認(rèn)載體中插入片段的長(zhǎng)度大小。

實(shí)施例2:抗性基因Pi5基因特異性分子標(biāo)記在鑒別Pi5基因的應(yīng)用。

根據(jù)多態(tài)性的PCR產(chǎn)物條帶，可以把含有目標(biāo)基因Pi5區(qū)分開(kāi)來(lái)。圖1是利用已開(kāi)發(fā)的標(biāo)記JJ801對(duì)12個(gè)代表性品種的擴(kuò)增情況，根據(jù)該標(biāo)記鑒定的依據(jù)，IRBL5-M(Pi5)、中花16、粵野占、花節(jié)糯、明恢63、桂朝2號(hào)和連粳7號(hào)都是陽(yáng)性帶型。圖2的結(jié)果顯示，Pi5基因特異性分子標(biāo)記既能區(qū)分不包含該位點(diǎn)的等位基因，又能區(qū)分包含該位點(diǎn)的等位基因。也就是說(shuō)，凡是攜帶有Pi5的水稻品種，電泳檢測(cè)條帶以93bp呈現(xiàn)，而在該位點(diǎn)上的其它等位基因以95bp呈現(xiàn)，不包含該位點(diǎn)的以無(wú)帶呈現(xiàn)?？梢?jiàn)試驗(yàn)結(jié)果較之前的標(biāo)記準(zhǔn)確性得到提高，說(shuō)明抗性基因Pi5基因特異性分子標(biāo)記在鑒別Pi5基因方面得到應(yīng)用。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 淮陰師范學(xué)院

江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院

<120> 水稻稻瘟病抗性基因Pi5功能特異性分子標(biāo)記及其應(yīng)用

<130>

<160> 18

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 93

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gtttcgagat agtgctaata taaattggca tgaatagtaa taatatattt ttctgtccct 60

taaaatagtt ttttttttct attactgtca ttc 93

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gtttcgagat agtgctaa 18

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

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