本發(fā)明屬于生物遺傳學(xué)領(lǐng)域，涉及豬HOXA1基因的兩個(gè)CDS區(qū)及其檢測方法。

背景技術(shù)：

HOXA1基因是HOX同源異型盒基因家族中的一員。HOX基因高度保守，在染色體上成簇排列，是脊椎動(dòng)物生長發(fā)育和細(xì)胞分化的主控基因。其中，HOXA1基因在基因簇中的位置靠近染色體的3’端，是最早表達(dá)的HOX基因，主要調(diào)控體軸近端的發(fā)育。近年來研究發(fā)現(xiàn)此基因與癌癥的發(fā)生密切相關(guān)。

人和小鼠的HOXA1基因均具有一個(gè)可變CDS區(qū)，而豬僅有一個(gè)預(yù)測的可變CDS區(qū)。在小鼠的參考基因組（GRCm38.p4）上，該基因的CDS區(qū)和可變CDS區(qū)分別有1011 bp和417 bp堿基，分別編碼336和138個(gè)氨基酸；在人的參考基因組（GRCh38.p5）上，該基因的CDS區(qū)和可變CDS區(qū)分別有1008 bp和414 bp堿基，分別編碼335和137個(gè)氨基酸；而在豬的基因組（Sscrofa10.2）上，該基因的CDS區(qū)含有1011 bp堿基，編碼336個(gè)氨基酸，預(yù)測的CDS區(qū)含有417 bp堿基，編碼138個(gè)氨基酸。

利用小鼠在體外進(jìn)行HOXA1可變CDS區(qū)的研究發(fā)現(xiàn)，可變CDS區(qū)編碼的短蛋白可以通過影響正常HOXA1與pbx的結(jié)合能力，從而最終影響正常HOXA1的功能。同樣，人的HOXA1可變CDS區(qū)編碼的蛋白可導(dǎo)致人罹患BSA和ABDS綜合征。BSAS綜合征患者表現(xiàn)為眼睛水平凝視障礙和智力發(fā)育遲緩等，ABDS綜合征的患者常出現(xiàn)肺換氣不足，這一疾病若不經(jīng)過醫(yī)學(xué)干預(yù)，對人將是致命的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于為研究HOXA1基因提供新的可變CDS區(qū)，進(jìn)而用于HOXA1基因?qū)ιL發(fā)育和癌癥發(fā)生的機(jī)理研究。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

豬的兩個(gè)CDS區(qū)，第一個(gè)CDS區(qū)的序列如SEQ ID NO：2所示，共372bp，與豬HOXA1基因的CDS區(qū)，如SEQ ID NO：1所示的序列相比：第一個(gè)CDS區(qū)5’端第213-238位堿基缺失，缺失了26個(gè)堿基；5’端第253-271位堿基缺失，缺失了19個(gè)堿基；5’端第358-560位堿基缺失，缺失了203個(gè)堿基，共缺失248個(gè)堿基；第二個(gè)CDS區(qū)的序列如SEQ ID NO：3所示，共183bp，與豬HOXA1基因的CDS區(qū)如SEQ ID NO：1所示的序列相比：第二個(gè)CDS區(qū)5’端的第124-560位堿基缺失，共缺失437個(gè)堿基。

所述第一個(gè)CDS區(qū)翻譯的蛋白序列如SEQ ID NO：5所示，與豬HOXA1蛋白質(zhì)序列如SEQ ID NO：4所示相比，SEQ ID NO：5編碼122個(gè)氨基酸，且只有前71個(gè)氨基酸與SEQ ID NO：4相同，從第72位氨基酸開始發(fā)生改變，第72-122位氨基酸變?yōu)槿鏢EQ ID NO：9所示蛋白序列；第二個(gè)CDS區(qū)翻譯的蛋白序列如SEQ ID NO：6所示，編碼60個(gè)氨基酸，與豬HOXA1蛋白質(zhì)序列如SEQ ID NO：4所示的序列相比，SEQ ID NO：6編碼60個(gè)氨基酸，且只有前41個(gè)氨基酸與SEQ ID NO：4相同，從第42位氨基酸開始發(fā)生改變，第42-60位氨基酸變?yōu)镾EQ ID NO：10。

豬HOXA1基因的兩個(gè)CDS區(qū)的檢測方法，所述檢測方法為PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系：300 ng豬基因組cDNA，2×Taq PCR Mix 7.5μL，正向引物40 pmol，反向引物40 pmol，加水補(bǔ)足15μL；反應(yīng)程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，68-54 ℃每個(gè)循環(huán)降1℃ 40s，72 ℃ 1 min，14個(gè)循環(huán)；94 ℃ 30 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，共25個(gè)循環(huán)；最后在72 ℃延伸8 min。

所述檢測方法中采用的正向引物如SEQ ID NO：7所示、反向引物如SEQ ID NO：8所示。

本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明對豬腎臟組織cDNA的擴(kuò)增HOXA1基因全長轉(zhuǎn)錄本時(shí)發(fā)現(xiàn)，存在除已預(yù)測過的CDS區(qū)之外的兩種新的CDS區(qū)域。這兩個(gè)新的CDS區(qū)可通過降低已有HOXA1蛋白與其輔因子pbx1的結(jié)合能力，從而降低HOXA1的靶基因HOXB1的轉(zhuǎn)錄水平，最終影響有機(jī)體的體軸骨骼、神經(jīng)和內(nèi)臟器官原基的分化發(fā)育和癌細(xì)胞的增生。即，這兩個(gè)新的CDS區(qū)可在分子和細(xì)胞水平上，用于挖掘影響生長發(fā)育及癌癥發(fā)生的基因網(wǎng)絡(luò)，探究該網(wǎng)絡(luò)內(nèi)基因間的互作。

附圖說明

圖1為腎臟組織RNA電泳圖；其中1-6泳道分別表示6個(gè)個(gè)體，M代表DNA ladder。

圖2為腎臟cDNA的內(nèi)參基因GAPDH的PCR擴(kuò)增電泳圖；其中PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物大小為205bp，1-2泳道分別表示2個(gè)個(gè)體，M表示DNA ladder。

圖3為HOXA1基因的PCR凝膠電泳圖。

圖4為HOXA1基因第一種新的CDS區(qū)的測序圖。

圖5為HOXA1基因第二種新的CDS區(qū)的測序圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行解釋說明：

首先，利用Trizol提取豬腎臟組織的總RNA，提取結(jié)果如圖1所示。取1ug RNA，利用Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript? 1st Strand cDNA Synthesis Kit，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。利用內(nèi)參基因GAPDH進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢驗(yàn)cDNA的質(zhì)量，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為205bp，擴(kuò)增結(jié)果如圖2所示。

其次，登陸網(wǎng)站Ensembl（http://asia.ensembl.org/index.html），下載豬HOXA1基因的全長轉(zhuǎn)錄本。利用軟件Primer 3.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，正向引物如SEQ ID NO：7所示、反向引物如SEQ ID NO：8所示。15 μL的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）體系包括300 ng豬基因組cDNA，2×Taq PCR Mix 7.5μL，正反向引物各40 pmol，水5μL。引物的擴(kuò)增條件為94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，68 ℃（每個(gè)循環(huán)減1 ℃）40s，72 ℃ 1 min，14個(gè)循環(huán)；94 ℃ 30 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，共25個(gè)循環(huán)；最后在72 ℃延伸8 min。PCR產(chǎn)物見圖3，與正常HOXA1相比，含有已預(yù)測的CDS區(qū)、兩種新CDS區(qū)的cDNA，分別比含有全長CDS區(qū)的cDNA短293bp和248bp、437bp。豬的兩個(gè)CDS區(qū)，第一個(gè)CDS區(qū)的序列如SEQ ID NO：2所示，共372bp，與豬HOXA1基因的CDS區(qū)，如SEQ ID NO：1所示的序列相比：第一個(gè)CDS區(qū)5’端第213-238位堿基缺失，缺失了26個(gè)堿基；5’端第253-271位堿基缺失，缺失了19個(gè)堿基；5’端第358-560位堿基缺失，缺失了203個(gè)堿基，共缺失248個(gè)堿基；第二個(gè)CDS區(qū)的序列如SEQ ID NO：3所示，共183bp，與豬HOXA1基因的CDS區(qū)如SEQ ID NO：1所示的序列相比：第二個(gè)CDS區(qū)5’端的第124-560位堿基缺失，共缺失437個(gè)堿基。

所述第一個(gè)CDS區(qū)翻譯的蛋白序列如SEQ ID NO：5所示，與豬HOXA1蛋白質(zhì)序列如SEQ ID NO：4所示相比，SEQ ID NO：5編碼122個(gè)氨基酸，且只有前71個(gè)氨基酸與SEQ ID NO：4相同，從第72位氨基酸開始發(fā)生改變，第72-122位氨基酸變?yōu)槿鏢EQ ID NO：9所示蛋白序列；第二個(gè)CDS區(qū)翻譯的蛋白序列如SEQ ID NO：6所示，編碼60個(gè)氨基酸，與豬HOXA1蛋白質(zhì)序列如SEQ ID NO：4所示的序列相比，SEQ ID NO：6編碼60個(gè)氨基酸，且只有前41個(gè)氨基酸與SEQ ID NO：4相同，從第42位氨基酸開始發(fā)生改變，第42-60位氨基酸變?yōu)镾EQ ID NO：10。

將PCR擴(kuò)增的每條產(chǎn)物帶分別進(jìn)行割膠回收，回收后，連接質(zhì)粒，進(jìn)行克隆測序，。

第一種新CDS區(qū)的測序結(jié)果見圖3。圖3（A）的測序結(jié)果顯示，與家豬基因組（Sscrofa10.2）上HOXA1的CDS區(qū)（1011個(gè)bp，如SEQ ID NO：1所示）相比，在5’端第213-238位堿基缺失、第253-271位堿基缺失；圖3（B）的測序結(jié)果顯示第358-560位堿基缺失，共缺失248個(gè)堿基。

第二種新CDS區(qū)的測序結(jié)果見圖4。測序結(jié)果顯示，與家豬基因組（Sscrofa10.2）上HOXA1的CDS區(qū)（1011 bp，如SEQ ID NO：1所示）相比，在5’端第124-560位堿基缺失，共缺失437個(gè)堿基。