本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，本發(fā)明公開了一種Purα基因片段P5及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

Purα具有模體結(jié)構(gòu)，它的中心部位為DNA結(jié)合區(qū)，含有三個(gè)1級(jí)重復(fù)序列和兩個(gè)2級(jí)重復(fù)序列。其它比較顯著的結(jié)構(gòu)特征還包括N-端的富含甘氨酸區(qū)，一個(gè)“Psycho”模體區(qū)和C-端的富含谷氨酰胺和谷氨酸區(qū)。在整個(gè)進(jìn)化過程中，Purα的DNA結(jié)合區(qū)域的序列是極其保守的。Purα幾乎在所有后生動(dòng)物組織中表達(dá)，它是一種多功能蛋白質(zhì)，既能與DNA結(jié)合，也可以與RNA結(jié)合，在DNA復(fù)制起始、mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)翻譯等過程中都發(fā)揮著不同程度的作用。在神經(jīng)元中，Purα可以轉(zhuǎn)運(yùn)并結(jié)合在mRNA上。Purα與病毒和細(xì)胞復(fù)制起始位點(diǎn)的DNA序列有著很密切的關(guān)系，由于復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的起始需要雙鏈DNA的解鏈，這比較符合Purα作為一種單鏈核酸結(jié)合蛋白，具有使DNA螺旋失穩(wěn)的特點(diǎn)。此外，近來研究還發(fā)現(xiàn)，Purα在DNA損傷修復(fù)方面也發(fā)揮著一定的作用，這在維持神經(jīng)系統(tǒng)基因組的穩(wěn)定性方面有著一定的意義。

目前，現(xiàn)有技術(shù)中，構(gòu)建與GFP蛋白融合表達(dá)的Purα突變體方面的研究還較少見。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服上述技術(shù)存在的缺陷，提供一種Purα基因片段P5及其應(yīng)用，本發(fā)明通過構(gòu)建Pura部分結(jié)構(gòu)域的質(zhì)粒P5，可以用于構(gòu)建Pura結(jié)構(gòu)突變體的模型，用于該蛋白結(jié)構(gòu)域功能的研究。

其具體技術(shù)方案為：

一種Purα基因片段P5，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本發(fā)明所述Purα基因片段P5在構(gòu)建與GFP蛋白融合表達(dá)的Purα突變體過程中的應(yīng)用。

進(jìn)一步，所述Purα基因片段P5在構(gòu)建與GFP蛋白融合表達(dá)的Purα突變體過程中的應(yīng)用，包括以下步驟：

通過PCR擴(kuò)增目的基因,擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳來比對分子量大小,并對分子量與預(yù)期結(jié)果一致的目的片段進(jìn)行純化和回收；純化的目的條帶需要要兩個(gè)末端加A來進(jìn)行進(jìn)一步的亞克隆，使用taq polymerase和dATP在在72℃作用30min完成末端加A過程，將末端加A后的PCR片段與Peasy-T1克隆載體進(jìn)行連接完成亞克隆過程,連接反應(yīng)在16℃水浴環(huán)境下過夜完成；第二天將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞中,然后將轉(zhuǎn)化的菌液涂到含有X-gal和IPTG的氨芐青霉素的瓊脂培養(yǎng)板上,置于37℃培養(yǎng)箱中過夜；次日待菌斑形成后進(jìn)行藍(lán)白斑篩選；挑取白斑在LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng),提取質(zhì)粒并酶切鑒定,對鑒定結(jié)果為陽性且大小正確的片段進(jìn)行切膠回收；隨后將回收的片段克隆到pCDNA3.0真核表達(dá)載體中去。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：

本發(fā)明真核表達(dá)pCDNA3.0載體上的Purα的基因片段，可以轉(zhuǎn)染該質(zhì)粒到需要的研究細(xì)胞系中，通過蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)來探討Purα蛋白不同結(jié)構(gòu)域?qū)δ康幕虻淖饔?。pEGFP-C1載體上的Purα基因片段與綠色熒光蛋白GFP融合表達(dá)，可以在熒光顯微鏡下觀察Purα蛋白在細(xì)胞內(nèi)的分布情況，同時(shí)也可以通過GFP蛋白的表達(dá)水平來量化Purα不同結(jié)構(gòu)域蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平。同時(shí)，原核表達(dá)載體pGEX上的Purα蛋白基因片段可以在體外研究Purα蛋白不同結(jié)構(gòu)域?qū)δ康幕虻淖饔谩?/p>

附圖說明

圖1是Purα蛋白結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2是pEGFP-C1-P5的酶切鑒定圖；

圖3是pCDNA3.0-P5酶切鑒定圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)地說明。

Purα的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)包括三大部分:N-端的富含甘氨酸區(qū)域；C-端的psycho模體和富含谷氨酰胺和谷氨酸區(qū)域以及中央的DNA結(jié)合區(qū)域。它的DNA結(jié)合區(qū)域包含3個(gè)class I和2個(gè)class II重復(fù)序列，分別位于66-88、102-131、148-170、188-120和224-246位氨基酸區(qū)域(圖1)。

一種Purα基因片段P5，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。P5從1-288個(gè)氨基酸序列，包括富含甘氨酸區(qū)的N端和位于中心的DNA結(jié)合區(qū)，該區(qū)包括3個(gè)ClassI和2個(gè)ClassII重復(fù)序列。

本發(fā)明所述Purα基因片段P5在構(gòu)建與GFP蛋白融合表達(dá)的Purα突變體過程中的應(yīng)用。

進(jìn)一步，所述Purα基因片段P5在構(gòu)建與GFP蛋白融合表達(dá)的Purα突變體過程中的應(yīng)用，包括以下步驟：

通過PCR擴(kuò)增目的基因,擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳來比對分子量大小,并對分子量與預(yù)期結(jié)果一致的目的片段進(jìn)行純化和回收。純化的目的條帶需要要兩個(gè)末端加A來進(jìn)行進(jìn)一步的亞克隆，使用taq polymerase和dATP在在72℃作用30min完成末端加A過程。將末端加A后的PCR片段與Peasy-T1克隆載體進(jìn)行連接完成亞克隆過程,連接反應(yīng)在16℃水浴環(huán)境下過夜完成。第二天將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞中,然后將轉(zhuǎn)化的菌液涂到含有X-gal和IPTG的氨芐青霉素的瓊脂培養(yǎng)板上,置于37℃培養(yǎng)箱中過夜。次日待菌斑形成后進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。挑取白斑在LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng),提取質(zhì)粒并酶切鑒定,對鑒定結(jié)果為陽性且大小正確的片段進(jìn)行切膠回收。隨后將回收的片段克隆到pCDNA3.0真核表達(dá)載體中去。簡言之,將真核表達(dá)載體pCDNA3.0用BamH I與EcoR I雙酶切,純化回收線性化的載體DNA,與同樣酶切的Purα缺失突變的回收片段在16℃水浴環(huán)境下過夜連接,并進(jìn)行轉(zhuǎn)化、鋪板、挑單克隆、搖菌、提質(zhì)粒、酶切鑒定,最終通過序列測定進(jìn)行確定。

以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實(shí)施方式，本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明披露的技術(shù)范圍內(nèi)，可顯而易見地得到的技術(shù)方案的簡單變化或等效替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。