本發(fā)明涉及高通量測(cè)序領(lǐng)域，具體涉及一種B細(xì)胞抗原受體(BCR)重鏈(H鏈)CDR3白血病致病序列及篩選方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：白血病，是一類造血干細(xì)胞惡性克隆性疾病，并導(dǎo)致大量異常的白細(xì)胞[1]。癥狀包括出血和淤血，感覺(jué)疲倦，發(fā)熱和感染的風(fēng)險(xiǎn)增加等[2]。這些癥狀發(fā)生是由于正常血細(xì)胞的缺乏，通過(guò)骨髓活檢來(lái)診斷[2]。白血病的危險(xiǎn)因素包括吸煙，電離輻射，某些化學(xué)物質(zhì)(如苯等)，既往化療和唐氏綜合癥[3][4]。白血病的四種主要類型為急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)，急性骨髓性白血病(AML)，慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)和慢性髓細(xì)胞性白血病(CML)以及一些不常見(jiàn)的類型[4][5]。從正常的造血細(xì)胞向癌細(xì)胞的發(fā)展涉及到克隆進(jìn)化的多步驟過(guò)程，這由一系列體細(xì)胞突變所驅(qū)動(dòng)。這些突變逐漸將細(xì)胞從正常生長(zhǎng)轉(zhuǎn)化到癌前狀態(tài)及最終的癌狀態(tài)，其中旨在調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)的所有檢查點(diǎn)被打破。惡性轉(zhuǎn)化的誘導(dǎo)似乎涉及到至少兩個(gè)不同的階段：起始(initiation)和促進(jìn)(promotion)。起始涉及到基因組的變化，但它本身不導(dǎo)致惡性轉(zhuǎn)化。惡性轉(zhuǎn)化需要第二個(gè)步驟，稱為促進(jìn)。在起始階段后的侵襲性細(xì)胞分裂過(guò)程中，因新的DNA改變不斷積累，促進(jìn)可能發(fā)生，通常影響原癌基因、腫瘤抑制基因或凋亡基因，導(dǎo)致不受調(diào)控的細(xì)胞生長(zhǎng)。新一代測(cè)序通過(guò)深度測(cè)序檢測(cè)稀有克隆類型或細(xì)胞中的突變的能力，使其能夠研究免疫效應(yīng)子在惡性血液病發(fā)病中的作用。一個(gè)明顯的例子是大量報(bào)道認(rèn)為克隆干細(xì)胞疾病的發(fā)病牽涉到自身反應(yīng)性T細(xì)胞克隆，例如骨髓增生異常綜合征(MDS)和再生障礙性貧血(AA)[6]。這些研究已經(jīng)得到廣泛統(tǒng)一的認(rèn)識(shí)，即抗腫瘤免疫力的破壞，這在生理上是由T細(xì)胞介導(dǎo)的，可能容易誘發(fā)惡性血液病的發(fā)展?？傊@些T細(xì)胞庫(kù)研究以及將免疫球蛋白重鏈的重排牽連到急性淋巴細(xì)胞白血病的克隆進(jìn)化的新報(bào)道已迅速成為血液學(xué)中最令人興奮的研究領(lǐng)域之一[7-9]。免疫組庫(kù)是指在任何指定時(shí)間，某個(gè)個(gè)體的循環(huán)系統(tǒng)中所有功能多樣性B細(xì)胞和T細(xì)胞的總和。在機(jī)體的多種疾病進(jìn)程中，都有免疫過(guò)程參與，而這些疾病特異性的免疫反應(yīng)，能被機(jī)體及時(shí)記錄下來(lái)。通過(guò)檢測(cè)這些表達(dá)的B細(xì)胞或T細(xì)胞受體基因，就能準(zhǔn)確的將其反映出來(lái)，用來(lái)評(píng)估個(gè)體的免疫狀態(tài)，疾病的發(fā)生，發(fā)展和預(yù)后，甚至指導(dǎo)治療。隨著人們對(duì)免疫組庫(kù)理解的深入，其研究技術(shù)也經(jīng)歷了3個(gè)主要發(fā)展階段，從最初的流式細(xì)胞術(shù)分析T細(xì)胞各亞家族的分布與缺失，到免疫掃描譜系分析技術(shù)研究各亞家族CDR3基因長(zhǎng)度的多態(tài)性，乃至今天高通量測(cè)序技術(shù)能夠完整的檢測(cè)所有T細(xì)胞、B細(xì)胞的CDR3序列，免疫組庫(kù)研究取得引人矚目的重要進(jìn)展[10]。當(dāng)前主要的免疫組庫(kù)測(cè)序(ImmuneRepertoiresequencing，IR-SEQ)技術(shù)是以B/T淋巴細(xì)胞為研究目標(biāo)，以多重PCR目的擴(kuò)增決定B細(xì)胞抗原受體(Bcellreceptor，BCR，簡(jiǎn)稱B細(xì)胞受體)或T細(xì)胞抗原受體(Tcellreceptor，TCR，簡(jiǎn)稱T細(xì)胞受體)多樣性的互補(bǔ)決定區(qū)CDR3，再結(jié)合高通量測(cè)序技術(shù)，全面評(píng)估免疫系統(tǒng)的多樣性以深入挖掘免疫組庫(kù)與疾病的關(guān)系。腫瘤是當(dāng)前威脅人類健康最嚴(yán)重的疾病之一，尋找特異性的腫瘤標(biāo)志物對(duì)腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)以及選擇合適的治療方案具有重要意義。B胞受體測(cè)序(BCRseq)，采用多重?cái)U(kuò)增的手段獲取BCR重鏈的CDR3區(qū)域，結(jié)合高通量測(cè)序技術(shù)以及生物信息學(xué)分析手段，分析VDJ重排的方式等，已經(jīng)開(kāi)始應(yīng)用于腫瘤(如卵巢癌，腎細(xì)胞癌)、自身免疫性疾病、器官移植免疫監(jiān)測(cè)、疫苗注射免疫監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域[11，12-13]。參考文獻(xiàn)：1."GeneralInformationAboutAdultHodgkinLymphoma".NationalCancerInstitute.2014-04-23.Retrieved20June2014.2.GeneralInformationAboutAdultNon-HodgkinLymphoma".NationalCancerInstitute.2014-04-25.Retrieved20June2014.3.AdityaBardia(2010).JohnsHopkinsPatients'GuidetoLymphoma.Jones&BartlettLearning.p.6.ISBN9781449631413.4.TheLymphomaGuideInformationforPatientsandCaregivers(pdf).LeukemiaandlymphomaSociety.2013.Retrieved20June2014.5.WorldCancerReport2014.WorldHealthOrganization.2014.pp.Chapter5.13.ISBN9283204298.6.Fozza,C.,andLonginotti,M.(2013)T-cellreceptorrepertoireusageinhematologicmalignancies.Criticalreviewsinoncology/hematology86:201–2117.Faham,M.,Zheng,J.,Moorhead,M.,Carlton,V.E.H.,Stow,P.,etal.(2012)Deep-sequencingapproachforminimalresidualdiseaseetectioninacutelymphoblasticleukemia.Blood120:5173–51808.Gawad,C.,Pepin,F.,Carlton,V.E.H.,Klinger,M.,Logan,A.C.,etal.(2012)MassiveevolutionoftheimmunoglobulinheavychainlocusinchildrenwithBprecursoracutelymphoblasticleukemia.Blood120:4407–44179.Jan,M.,Snyder,T.M.,Corces-Zimmerman,M.R.,Vyas,P.,Weissman,I.L.,etal.(2012)ClonalEvolutionofPreleukemicHematopoieticStemCellsPrecedesHumanAcuteMyeloidLeukemia.ScienceTranslationalMedicine4:149ra118–149ra11810.SixA,Mariotti-FerrandizME,ChaaraW,MagadanS,PhamHP,LefrancMP&BoudinotP.ThePast,Present,andFutureofImmuneRepertoireBiology–TheRiseofNext-GenerationRepertoireAnalysis.FrontImmunol2013；4:413.doi:10.3389/fimmu.11.WoodsworthDJ,CastellarinM,HoltRA.SequenceanalysisofT-cellrepertoiresinhealthanddisease.GenomeMed.2013；5(10):98.12.DavidWu,AnnaSherwood,JonathanR.Fromm,StuartS.Winter,KimberlyP.Dunsmore,High-ThroughputSequencingDetectsMinimalResidualDiseaseinAcuteTLymphoblasticLeukemia.SciTranslMed2012；4,134ra6313.RobinsHS,EricsonNG,GuenthoerJ,etal.DigitalGenomicQuantificationofTumor-InfiltratingLymphocytes[J].ScienceTranslationalMedicine,2013,5(214):214ra169.技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明所解決的現(xiàn)有技術(shù)的問(wèn)題是：白血病發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，病因至今仍未完全清楚，缺少有效的早期診斷和檢測(cè)技術(shù)，而傳統(tǒng)檢測(cè)手段、PET(正電子發(fā)射斷層顯像)、CT(計(jì)算機(jī)斷層掃描顯像)等方法多是針對(duì)疾病的中后期的狀態(tài)。本發(fā)明人在銳意研究后發(fā)現(xiàn)了一個(gè)B細(xì)胞受體CDR3白血病致病序列。該序列的發(fā)現(xiàn)可以用來(lái)制備治療同白血病相關(guān)的試劑，用來(lái)進(jìn)行白血病復(fù)發(fā)的早期診斷或進(jìn)行無(wú)創(chuàng)確診等。B細(xì)胞受體CDR3白血病致病序列的發(fā)現(xiàn)是采用免疫組庫(kù)測(cè)序技術(shù)，以白血病患者的B淋巴細(xì)胞為研究目標(biāo)，采用優(yōu)化的多重PCR的技術(shù)對(duì)B細(xì)胞受體H鏈最具多樣性的互補(bǔ)決定區(qū)CDR3區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，再結(jié)合高通量測(cè)序技術(shù)，全面分析BCR組成，評(píng)估免疫系統(tǒng)的多樣性，深入挖掘免疫組庫(kù)與白血病的關(guān)系。具體而言，一方面，本發(fā)明提供了一種BCR重鏈CDR3白血病致病序列，所述序列為SEQIDNO.1。優(yōu)選的，所述序列采用高通量的方式進(jìn)行測(cè)序得到，所述序列通過(guò)擴(kuò)增V區(qū)和J區(qū)序列并進(jìn)行比對(duì)得到。優(yōu)選的，所述V區(qū)序列擴(kuò)增引物為SEQIDNO.3，SEQIDNO.4，SEQIDNO.5，SEQIDNO.6，SEQIDNO.7，SEQIDNO.8，SEQIDNO.9，SEQIDNO.10，SEQIDNO.11，SEQIDNO.12，SEQIDNO.13和SEQIDNO.14；所述J區(qū)序列擴(kuò)增引物為SEQIDNO.2。另一方面，本發(fā)明提供了一種B細(xì)胞受體重鏈CDR3白血病致病序列的篩選方法，包括如下步驟：(1)樣本制備：外周血取樣，提取樣本RNA；(2)文庫(kù)制備及測(cè)序：將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后采用多重PCR擴(kuò)增B細(xì)胞受體重鏈CDR3序列，并進(jìn)行上機(jī)測(cè)序；(3)下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息分析：采用軟件對(duì)生物序列數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，篩選出序列SEQIDNO.1。優(yōu)選的，所述步驟(2)中進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增時(shí)，采用V區(qū)引物SEQIDNO.3，SEQIDNO.4，SEQIDNO.5，SEQIDNO.6，SEQIDNO.7，SEQIDNO.8，SEQIDNO.9，SEQIDNO.10，SEQIDNO.11，SEQIDNO.12，SEQIDNO.13和SEQIDNO.14和J區(qū)引物SEQIDNO.2擴(kuò)增V區(qū)和J區(qū)序列。優(yōu)選的，所述步驟(2)，對(duì)B細(xì)胞受體重鏈CDR3序列進(jìn)行末端修復(fù)和末端加A，然后連接adapter。同時(shí)，本發(fā)明提供了以上任一項(xiàng)所述的序列在制備診斷和/或治療同白血病相關(guān)的試劑中的應(yīng)用。優(yōu)選的，所述試劑包括試劑盒、試紙或高通量測(cè)序用試劑。優(yōu)選的，所述試劑盒包括用于序列SEQIDNO.1基因轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)的試劑盒；所述試紙包括用于序列SEQIDNO.1基因轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)的試紙；所述高通量測(cè)序用試劑包括用于序列SEQIDNO.1基因轉(zhuǎn)錄水平的高通量測(cè)序用試劑。本發(fā)明的有益效果是：(1)通過(guò)擴(kuò)增B細(xì)胞受體重鏈(H鏈)CDR3并進(jìn)行高通量測(cè)序，對(duì)患者治療前后的BCRH鏈CDR3的多樣性及特異性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)與白血病疾病相關(guān)的一條CDR3序列。檢測(cè)血液中BCR(H鏈)CDR3多樣性及特異性具有無(wú)創(chuàng)、可隨時(shí)監(jiān)控的特點(diǎn)，因此通過(guò)BCR-seq檢測(cè)外周血BCR(H鏈)CDR3的表達(dá)特征，可與臨床檢測(cè)結(jié)果相結(jié)合，以實(shí)現(xiàn)結(jié)白血病的早期診療或?qū)χ委熜Ч脑u(píng)估。(2)健康個(gè)體在無(wú)抗原刺激時(shí)，BCR基因重排是隨機(jī)的，因此正常人外周B細(xì)胞呈多家族、多克隆性特點(diǎn)。當(dāng)不同抗原刺激后，CDR3區(qū)域可對(duì)該抗原產(chǎn)生特異性識(shí)別并產(chǎn)生高親和力突變，使帶有這類基因的B細(xì)胞得到優(yōu)勢(shì)擴(kuò)增，通過(guò)對(duì)待檢者外周血PBMC中的B細(xì)胞受體重鏈CDR3進(jìn)行擴(kuò)增及高通量測(cè)序，可分析與疾病相關(guān)的免疫CDR3序列，從而為應(yīng)用于白血病的診斷和治療提供另一種治療與評(píng)估手段。1)微創(chuàng)性：正常受檢者及腫瘤患者只需要提供5mL外周血樣本；2)實(shí)時(shí)性：可對(duì)受檢者進(jìn)行多次實(shí)時(shí)采血進(jìn)行檢測(cè)3)高通量：基于新一代測(cè)序技術(shù)的免疫組庫(kù)測(cè)序，能夠在很短的時(shí)間內(nèi)同時(shí)進(jìn)行多例樣本檢測(cè)。一次測(cè)序得到百萬(wàn)級(jí)別條數(shù)的序列信息。下面結(jié)合附圖和各個(gè)具體實(shí)施方式，對(duì)本發(fā)明及其有益技術(shù)效果進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。附圖說(shuō)明圖1為實(shí)施例一的白血病患者治療前與治療后15天與30天的致病克隆情況圖。具體實(shí)施方式如上所述，本發(fā)明提供了一種B細(xì)胞受體H鏈CDR3白血病致病序列及篩選方法和應(yīng)用。在本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種B細(xì)胞受體H鏈CDR3白血病致病序列，其序列為SEQIDNO.1。在本發(fā)明的另一種優(yōu)選實(shí)施方式中，B細(xì)胞受體H鏈CDR3白血病致病序列SEQIDNO.1可以用來(lái)制備治療或診斷同白血病相關(guān)的試劑。利用該被診斷的試劑進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，檢測(cè)到被測(cè)人員中含有該序列，則被測(cè)人群患有白血病或者很大程度上患有白血病的風(fēng)險(xiǎn)。其中，在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，采用免疫組庫(kù)技術(shù)對(duì)白血病患者的B細(xì)胞受體CDR3序列進(jìn)行分析，篩選出同白血病致病相關(guān)的序列。實(shí)施例一本實(shí)施例為對(duì)1例白血病患者治療前和治療后不同時(shí)間共三次抽血樣本，分別進(jìn)行了BCR重鏈CDR3的測(cè)序檢測(cè)。免疫組庫(kù)測(cè)序檢測(cè)以外周血中分離的PBMC作為研究對(duì)象，具體操作如下：1.外周血取樣1)取患者外周血樣本5ml于EDTA抗凝管中。上下輕輕顛倒4-6次充分混勻后，室溫放置，并在2小時(shí)以內(nèi)完成PBMC分離工作；2)加入3倍體積的無(wú)菌生理鹽水，上下顛倒混勻；3)取3ml細(xì)胞分層液于15ml離心管中，并小心的吸取2)步稀釋的全血細(xì)胞4ml沿管壁疊加于分層液面上，體積大于4ml的分多管進(jìn)行。水平離心，400g，室溫條件下離心30分鐘；4)小心吸取淋巴細(xì)胞層，置于另一離心管中，加入5倍以上體積的無(wú)菌生理鹽水，400g室溫條件下離心10分鐘；5)倒掉上清液，加入1mlTRIzol。用吸頭反復(fù)吹打細(xì)胞直至看不見(jiàn)成團(tuán)的細(xì)胞塊，整個(gè)溶液呈清亮而不粘稠的狀態(tài)；轉(zhuǎn)移至2ml離心管。6)液氮速凍后-80°保存，干冰盒運(yùn)輸，避免反復(fù)凍融。2.RNA的提取采用TrizolReage，貨號(hào)15596-018，規(guī)格200ml，廠家INVITROGEN試劑盒對(duì)患者RNA進(jìn)行提取。步驟如下：1)每管PBMC加入1mlTrizol，混均，冰上放置5min。2)加入氯仿0.2ml/管，振搖15s。15-30℃孵育2-3min，4℃，12000g，離心15min。3)吸取上層無(wú)色液體轉(zhuǎn)移至新的EP管中。4)加入等體積異丙醇，混勻，15-30℃孵育10-30min，4℃,12000g，離心10min。5)去上清，加入75％乙醇1ml，渦旋振蕩30s，4℃，7500g，離心5min。6)吸凈上清，管內(nèi)沉淀在超凈臺(tái)中鼓風(fēng)靜置3-5min。7)加入20ulDEPC水溶解，-80℃冰箱保存。3.RNA反轉(zhuǎn)錄(RNAreversetranscripyion)按照表1所示，采用SuperScriptIIReverseTranscriptase，貨號(hào)18064-014，規(guī)格10000u，廠家：INVITROGEN反轉(zhuǎn)錄試劑盒和RNASEOUTRECOMB.R，貨號(hào)10777019，規(guī)格5000UNITS，廠家：INVITROGEN試劑盒對(duì)步驟2制得的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA。表1RNA反轉(zhuǎn)錄體系4.文庫(kù)構(gòu)建4.1多重PCR(multiplexpolymerchainreaction)擴(kuò)增T細(xì)胞受體CDR3區(qū)4.1.1使用QIAGEN公司的MultiplexPCR試劑盒，配置PCR的反應(yīng)體系，進(jìn)行PCR，其中PCR反應(yīng)體系見(jiàn)表2，V區(qū)引物和J區(qū)引物序列見(jiàn)表3，PCR反應(yīng)條件見(jiàn)表4。引物均由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成。表2PCR反應(yīng)體系其中，表2中用到的V區(qū)引物和J區(qū)引物序列如表3所示：表3V區(qū)引物和J區(qū)引物序列SEQIDNO.2IgHJCTACGGAGACGGTGACARKSATSEQIDNO.3IgHV1-aAGACACACCATGACCAACGACSEQIDNO.4IgHV1-bAGAGTTACAAKRACCACGGACSEQIDNO.5IgHV1-cAGTGTCACTATGACTGAGGACSEQIDNO.6IgHV1-dAGAGTCACTATTACYAGGGACSEQIDNO.7IgHV1-eAGAGTCACGASWACCRCGGACSEQIDNO.8IgHV1-fAGAGTCACCAAGACCAGGATCSEQIDNO.9IgHV2ACCAGGCTCATCATYWCCAAAGSEQIDNO.10IgHV3GGCCGATTCACCATCTCCAGSEQIDNO.11IgHV4CGAGTCACCATRTCMGTACACSEQIDNO.12IgHV5CAGCTGACAAGTCCATCCGCSEQIDNO.13IgHV6AGTCTAATAACCATCAACACAGSEQIDNO.14IgHV7GACGGTTTGCCTTCTCCTAG其中，表3中的R、K、S、Y、W、M分別代表簡(jiǎn)并堿基，其中R為A或G，K為G或T，S為G或C，Y為C或T，W為A或T，M為A或C。表4PCR反應(yīng)條件4.1.2多重PCR產(chǎn)物，QIAquickGelPurificationKit(QIAGEN)純化膠回收產(chǎn)物1)配置2％的回收膠2)將多重PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，400mA，100V，電泳2h3)EB染膠4)片段選擇：100-200bp；5)使用30ul超純水進(jìn)行回溶。4.2末端修復(fù)采用SureSelectXTReagentkit，HSQ，16-G9611A，廠家：AgilentTechnologies和HerculaseIIFusionDNAPlymerase，貨號(hào)600677，規(guī)格200rxn，廠家：AgilentTechnologies試劑盒對(duì)得到的多重PCR產(chǎn)物進(jìn)行末端修復(fù)，其中修復(fù)步驟如下：1)在1.5ml的離心管中配制末端修復(fù)反應(yīng)體系，其中末端修復(fù)反應(yīng)體系見(jiàn)表5。表5末端修復(fù)反應(yīng)體系多重PCRDNA產(chǎn)物30μLddH2O45μL10xPolynucleotideKinaseBuffer(B904)10μLdNTPSolutionMix(10mM)4μLT4DNAPolymerase5μLKlenowFragment1μLT4PolynucleotideKinase5μL2)上述100μL反應(yīng)混合物輕微振蕩混合均勻，瞬時(shí)離心，在Thermomixer中20℃溫浴30min。3)用QIAquickPCRPurificationKit(QIAGEN)純化產(chǎn)物，34μL回溶。4.3末端加“A”(A-Tailing)采用SureSelectXTReagentkit，HSQ，16-G9611A，廠家：AgilentTechnologies和HerculaseIIFusionDNAPlymerase，貨號(hào)600677，規(guī)格200rxn，廠家：AgilentTechnologies試劑盒對(duì)末端修復(fù)產(chǎn)物進(jìn)行末端加A，其中操作步驟如下：1)在1.5ml的離心管中配制末端加“A”反應(yīng)體系，見(jiàn)表6。表6末端加A反應(yīng)體系DNA32μL10xbluebuffer5μLdATP(1mM)10μLKlenow(3’-5’exo-)3μL2)上述50μL反應(yīng)混合物輕微振蕩混合均勻，瞬時(shí)離心后置于Thermomixer中37℃溫浴30min。3)用QIAquickMinElutePCRPurificationKit(QIAGEN)純化產(chǎn)物，17μL回溶。4.4Adapter的連接(AdapterLigation)采用SureSelectXTReagentkit，HSQ，16-G9611A，廠家：AgilentTechnologies和HerculaseIIFusionDNAPlymerase，貨號(hào)600677，規(guī)格200rxn，廠家：AgilentTechnologies試劑盒對(duì)末端加A產(chǎn)物進(jìn)行adapter的連接，其中操作步驟如下：1)在1.5ml的離心管中配制Adapter連接反應(yīng)體系：表7adapter連接反應(yīng)體系DNA15μL2xRapidligationbuffer25μLPEAdapteroligomix(1μM)5μLT4DNALigase(Rapid)5μL2)上述50μL反應(yīng)混合物輕微振蕩混勻，瞬時(shí)離心后置于Thermomixer中20℃溫浴15min。3)QIAquickMinElutePCRPurificationKit純化產(chǎn)物，25μL回溶。4.5連接產(chǎn)物PCR按照表8所述的體系和表9所述的PCR反應(yīng)條件，對(duì)連接產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。表8PCR反應(yīng)體系DNA23μLPrimer1公用(10μm)1μLPrimerindexX(10μm)1μL2×phusionmastermix25μL總體積50μL表9PCR反應(yīng)條件4.6連接產(chǎn)物的純化(AGENCOURTAMPureXPbeads)采用AgencourtAMPureXP-Medium，貨號(hào)：A63882，廠家：Beckman進(jìn)行連接產(chǎn)物的純化。在50μL連接產(chǎn)物中，加入1.2倍體積的磁珠(60μL)，進(jìn)行磁珠純化，加入20μLUltraPureWater，進(jìn)行回溶。5.文庫(kù)檢測(cè)使用Agilent2100Bioanalyzer檢測(cè)文庫(kù)大小；使用qPCR定量檢測(cè)文庫(kù)產(chǎn)量6.上機(jī)測(cè)序BCR-seq采用IlluminaHiSeq進(jìn)行上機(jī)測(cè)序，測(cè)序?qū)嶒?yàn)操作按照制造商提供的操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行上機(jī)測(cè)序操作。7.下機(jī)數(shù)據(jù)生物信息分析及免疫組庫(kù)測(cè)序結(jié)果分析7.1生物信息分析1)測(cè)序數(shù)據(jù)的預(yù)處理，低質(zhì)量，接頭污染等進(jìn)行過(guò)濾。2)使用免疫組庫(kù)多套分析軟件并行分析，以確保所找出序列準(zhǔn)確性。使用軟件為(MiXCR，IMonitor等)3)根據(jù)治療前后的結(jié)果比較，確認(rèn)與疾病相關(guān)CDR3序列7.2免疫組庫(kù)測(cè)序結(jié)果分析我們從白血病患者治療前的備注樣品中找出治療克隆為SEQIDNO.1的序列，其中SEQIDNO.1序列如下：TGTGCGAGAGTCCCTGTATAGCAGCTCGTCCGGTGGTGGCTGG其中，治療前患者的SEQIDNO.1的占比為62.81％；治療后15天患者的SEQIDNO.1的占比為22.06％。治療30天后為未檢測(cè)到該克隆。其中將白血病治療前與治療后15天與30天的致病克隆情況用圖1表示，圖示Pre為治療前，治病克隆比率為62.81％，治療后15天該克隆比率降為22.06％，在治療30天后檢測(cè)不到該克隆情況。以上所述僅為本發(fā)明較佳實(shí)施例，并不用于局限本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所做的修改、等同替換和改進(jìn)等，均需要包含在發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3