本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及一種在大腸桿菌中制備線性單鏈DNA(LssDNA)的方法、以及實(shí)施該方法的試劑盒。

背景技術(shù)：

單鏈DNA(single-stranded DNA，ssDNA)在生物學(xué)領(lǐng)域中有廣泛的用途，例如DNA測(cè)序、定點(diǎn)誘變、探針制備、適配體篩選、基因治療用質(zhì)粒微載體制備、DNA折紙、納米傳輸給藥中。目前，大規(guī)模制備200nt以上的長(zhǎng)鏈ssDNA一直是本領(lǐng)域內(nèi)亟待解決的難題。

迄今為止，體外制備單鏈ssDNA的方法有很多種，例如化學(xué)合成；不對(duì)稱PCR；利用鏈霉親和素顆粒分離親和素標(biāo)記單鏈；lambda核酸外切酶消化磷酸化單鏈；滾環(huán)PCR擴(kuò)增；限制性內(nèi)切酶剪切質(zhì)粒后變性等。這些方法都還存在一些不足，例如：1.制備ssDNA的長(zhǎng)度有限，通常少于200nt；2.需要在體外反應(yīng)中借助生物酶剪切，因此成本高昂；3.無(wú)法工藝放大進(jìn)行規(guī)?；a(chǎn)，僅限于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模。

除上述方法，本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員還可利用生物反應(yīng)器規(guī)?；苽鋝sDNA，例如利用噬菌體/細(xì)菌、病毒/細(xì)胞系統(tǒng)。M13噬菌體能感染大腸桿菌宿主，并從感染的細(xì)胞中分泌出噬菌體顆粒，而宿主細(xì)胞仍能繼續(xù)生長(zhǎng)和分裂。這種噬菌體的基因組為環(huán)狀單鏈DNA分子，長(zhǎng)6407個(gè)核苷酸，含DNA復(fù)制和噬菌體增殖所需的遺傳信息，利用該噬菌體可以大量制備長(zhǎng)鏈ssDNA。但這種環(huán)狀單鏈DNA可容納的外源DNA片段長(zhǎng)度非常有限，約300-400nt，且有時(shí)候外源DNA片段容易丟失；另外該方法制備出來(lái)的環(huán)狀ssDNA含有大量的噬菌體基因組序列。經(jīng)過(guò)改造的噬菌粒(phagemid)可以部分解決上述問(wèn)題，提高外源DNA長(zhǎng)度，但是仍存在其局限性。例如，1.需要輔助噬菌體感染后才能實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)復(fù)制ssDNA；2.有時(shí)候單鏈DNA的產(chǎn)量較低且重復(fù)性較差；3.噬菌體生產(chǎn)方式對(duì)設(shè)備和實(shí)驗(yàn)環(huán)境也有一定的特殊要求；4.該方法制備出來(lái)ssDNA為環(huán)狀且含有大量的噬菌體基因組序列。

真核生物/病毒系統(tǒng)也可以制備ssDNA，可以通過(guò)共轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞包裝出含ssDNA基因組的AAV病毒顆粒，這些細(xì)胞包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞、酵母細(xì)胞等。但是該方 法的生產(chǎn)能力有限，在生物安全性還存在很多關(guān)切。另外因?yàn)樯a(chǎn)工藝中涉及細(xì)胞培養(yǎng)等過(guò)程，導(dǎo)致其制備成本偏高。

CRISPR/Cas系統(tǒng)在原核生物抗病毒防御中發(fā)揮重要功能，分別存在于90％和40％的古細(xì)菌及細(xì)菌基因組中，可用來(lái)對(duì)抗入侵的病毒及外源DNA。CRISPR/Cas系統(tǒng)主要被分為三類：I型，II型和III型。其中II型進(jìn)行DNA干擾需要一個(gè)稱作為Cas9的蛋白。近年來(lái)，II型CRISPR/Cas系統(tǒng)被用于高等真核生物中在細(xì)胞和生物體水平上實(shí)現(xiàn)基因組編輯，在過(guò)去的幾年里CRISPR-Cas9技術(shù)在全球的應(yīng)用呈爆炸性增長(zhǎng)。此系統(tǒng)的工作原理是crRNA(CRISPR-derived RNA)通過(guò)堿基配對(duì)與tracrRNA(trans-activating RNA)結(jié)合形成tracrRNA/crRNA復(fù)合物，并引導(dǎo)核酸酶Cas9蛋白在與crRNA配對(duì)的序列靶位點(diǎn)剪切雙鏈DNA。人工改造tracrRNA/crRNA的sgRNA(single guide RNA)同樣具有引導(dǎo)作用，足以引導(dǎo)Cas9切口酶對(duì)含有PAM序列的DNA進(jìn)行定點(diǎn)切割，從而實(shí)現(xiàn)基因編輯功能。隨著CRISPR/Cas9機(jī)理的明確，該技術(shù)已大量應(yīng)用于不同物種基因組編輯，該基因編輯系統(tǒng)不僅高效而且簡(jiǎn)單易操作。野生型Cas9具有多個(gè)結(jié)構(gòu)域，通過(guò)兩個(gè)核酸酶結(jié)構(gòu)域RuvC和HNH來(lái)產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂，在真核生物基因編輯過(guò)程中，研究人員為了降低脫靶效應(yīng)往往將Cas9核酸酶結(jié)構(gòu)域中兩個(gè)關(guān)鍵殘基中的一個(gè)轉(zhuǎn)換成丙氨酸(D10A或H840A)，形成了Cas9切口酶(Cas9-nickase，Cas9n)。Cas9n需要兩個(gè)sgRNA的協(xié)助下才能產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂，與野生型spCas9相比大大增強(qiáng)了識(shí)別靶點(diǎn)序列特異性。D10A(即第10位的天冬氨酸D突變?yōu)楸彼酇)突變型Cas9n只剪切sgRNA互補(bǔ)鏈DNA，而H840A(即第840位的組氨酸H突變?yōu)楸彼酇)突變型Cas9n只剪切sgRNA非互補(bǔ)鏈DNA。同時(shí)存在D10A和H840A突變的cas9稱為dCas9，其仍然保留結(jié)合DNA活性，但不具有任何酶切割活性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術(shù)中大規(guī)模生產(chǎn)線性單鏈DNA、尤其是200nt以上的線性長(zhǎng)單鏈DNA(LssDNA)的不足，本發(fā)明根據(jù)CRISPR/Cas系統(tǒng)原理，利用基因工程技術(shù)構(gòu)建了一種CRISPR/Cas9切口酶自殺體系，以生物技術(shù)領(lǐng)域中最常用的大腸桿菌作為生產(chǎn)菌，實(shí)施LssDNA的大規(guī)模制備。

因此，本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供一種用于在大腸桿菌中制備線性單鏈DNA的方法。

本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供一種實(shí)施該方法的試劑盒。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種在大腸桿菌中制備線性單鏈DNA的方法，包括如下步驟：

A)構(gòu)建可表達(dá)Cas切口酶的Cas表達(dá)元件，該Cas表達(dá)元件包含操縱子、啟動(dòng)子、Cas切口酶基因序列、終止子、復(fù)制子和篩選標(biāo)記基因，所述Cas切口酶是來(lái)源于化膿鏈球菌的spCas9或來(lái)源于金黃色葡萄球菌的saCas9，優(yōu)選是來(lái)源于化膿鏈球菌的spCas9；

B)將步驟A)中得到的Cas表達(dá)元件整合入質(zhì)?；蚧蚪M，得到Cas切口酶表達(dá)質(zhì)?；蛑亟M基因組；

C)構(gòu)建可在大腸桿菌細(xì)胞中與上述Cas表達(dá)元件兼容的sgRNA基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)元件，其包含操縱子、啟動(dòng)子、sgRNA基因序列、終止子、復(fù)制子和篩選標(biāo)記基因，

D)將步驟C)中得到的sgRNA基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)元件構(gòu)建成質(zhì)粒，得到sgRNA表達(dá)質(zhì)粒，該質(zhì)粒上包含作為自殺sgRNA靶點(diǎn)的PAM序列和對(duì)應(yīng)于所述線性單鏈DNA的序列；

E)將步驟B)中得到的Cas切口酶表達(dá)質(zhì)粒和步驟D)中得到的sgRNA表達(dá)質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中、或者將步驟D)中得到的sgRNA表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入包含所述重組基因組的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中；

F)培養(yǎng)大腸桿菌至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，誘導(dǎo)Cas切口酶基因表達(dá)和自殺性sgRNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)，Cas切口酶協(xié)同sgRNA自剪切sgRNA表達(dá)質(zhì)粒的雙鏈DNA并形成單鏈斷裂，通過(guò)質(zhì)粒的θ復(fù)制機(jī)制協(xié)同作用產(chǎn)生線性單鏈DNA；

G)提取sgRNA基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)元件自剪切的DNA產(chǎn)物中的線性單鏈DNA。

優(yōu)選地，上述的Cas切口酶是SEQ ID No:1所示的Cas9(D10A)或SEQ ID No:2所示的Cas9(H840A)。

優(yōu)選地，上述的PAM序列為5’-Nx-NGG-3’序列，其中N表示堿基A、T、C、G中的任意一種，x表示介于10-30之間的任意自然數(shù)。序列中的Nx并不意味著某一種堿基的重復(fù)序列比如AA……AA、TT……TT、CC……CC、GG……GG，而是僅表示選自四種堿基A、T、C和G的數(shù)量有x個(gè)，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解的。

優(yōu)選地，上述的Cas表達(dá)元件和sgRNA基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)元件中的操縱子各自獨(dú)立地選自下組：四環(huán)素操縱子、乳糖操縱子、半乳糖操縱子、阿拉伯糖操縱子、鼠李糖調(diào)節(jié)子、pR/pL溫控操縱子。

優(yōu)選地，上述的Cas表達(dá)元件中的操縱子為四環(huán)素操縱子(Tet-on)。

優(yōu)選地，上述的Cas表達(dá)元件和sgRNA基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)元件中的篩選標(biāo)記基因各自獨(dú)立地選自下組：氯霉素抗性基因、氨芐青霉素抗性基因、卡納霉素抗性基因。

優(yōu)選地，上述的sgRNA基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)元件中的啟動(dòng)子選自下組：TacI、LacZ、LacI、J23100。

優(yōu)選地，上述的Cas表達(dá)元件中的復(fù)制子選自p15和pSC101。

優(yōu)選地，上述的sgRNA基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)元件中的復(fù)制子選自pMB1和ColE1。

優(yōu)選地，上述的Cas切口酶表達(dá)質(zhì)粒選自下組：SEQ ID No:3所示的pETetCas9-Nickase、SEQ ID No:4所示的pETetCas9-Nickase(pSC101)、SEQ ID No:5所示的pPrPl Cas9Nickase。

在pETetCas9-Nickase的序列SEQ ID No:3中，第7-704位的序列是四環(huán)素操縱子；第740-4846位的序列是Cas9切口酶DNA；第5146-5691位的序列是p15復(fù)制子。

在pETetCas9-Nickase(pSC101)的序列SEQ ID No:4中，第7-704位的序列是四環(huán)素操縱子；第740-4846位的序列是Cas9切口酶DNA；第5253-6473位的序列是pSC101復(fù)制子。

在pPrPl Cas9Nickase的序列SEQ ID No:5中，第198-1323位的序列是pR/pL溫控操縱子；第1373-5479位的序列是Cas9切口酶DNA；第5779-6324位的序列是p15復(fù)制子。

優(yōu)選地，上述的sgRNA表達(dá)質(zhì)粒選自下組：SEQ ID No:6所示的pJ23sgRNA-EGFP、SEQ ID No:7所示的pJ23sgRNA-GFPuv(TacI)。

在pJ23sgRNA-EGFP的序列SEQ ID No:6中，第431-494位的序列是J23100啟動(dòng)子；第1896-2444位的序列是ColE1/pMB1復(fù)制子。

在pJ23sgRNA-GFPuv(TacI)的序列SEQ ID No:7中，第428-481位的序列是TacI-LacI啟動(dòng)子；第761-824位的序列是J23100啟動(dòng)子；第2267-2855位的序列是ColE1/pMB1復(fù)制子。

一種用于制備線性單鏈DNA的試劑盒，包括：Cas切口酶表達(dá)質(zhì)粒，其包含可表達(dá)Cas切口酶的Cas表達(dá)元件；sgRNA表達(dá)質(zhì)粒，其包含可在大腸桿菌細(xì)胞中與上述Cas表達(dá)元件兼容的sgRNA基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)元件；和宿主大腸桿菌；所述Cas切口酶表達(dá)質(zhì)粒選自SEQ ID No:3所示的pETetCas9-Nickase、SEQ ID No:4所示的pETetCas9-Nickase(pSC101)、SEQ ID No:5所示的pPrPl Cas9Nickase；所述sgRNA表達(dá)質(zhì)粒選自SEQ ID No:6所示的pJ23sgRNA-EGFP、SEQ ID No:7所示的pJ23sgRNA-GFPuv(TacI)。

優(yōu)選地，上述試劑盒還可用于篩選Cas9/sgRNA復(fù)合物對(duì)靶DNA的剪切效率。

通過(guò)本發(fā)明提供的方法，在大腸桿菌中利用CRISPR/Cas切口酶自殺系統(tǒng)可篩選最適剪切效率自殺性sgRNA，并生產(chǎn)線性長(zhǎng)單鏈DNA(LssDNA)。在該自殺系統(tǒng)中Cas切口酶能 協(xié)同自殺性sgRNA切割質(zhì)粒雙鏈DNA，產(chǎn)生單鏈斷裂最終生成大量的自剪切產(chǎn)物L(fēng)ssDNA。該方法可以實(shí)現(xiàn)線性單鏈DNA、尤其是200nt以上的線性長(zhǎng)單鏈DNA的大規(guī)模生產(chǎn)。

附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明的CRISPR/Cas切口酶自殺系統(tǒng)生產(chǎn)線性長(zhǎng)單鏈DNA的原理圖。

圖2是實(shí)施例1中CRISPR/Cas自殺系統(tǒng)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)元件的結(jié)構(gòu)示意圖。其中圖2A是Cas切口酶表達(dá)元件；圖2B是sgRNA基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)元件。

圖3是實(shí)施例2中不同類型Cas9表達(dá)質(zhì)粒(Cas9n、wtCas9、dCas9)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌的培養(yǎng)皿照片，顯示了CRISPR/Cas切口酶自殺系統(tǒng)對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響。

圖4是實(shí)施例2中不同類型Cas9表達(dá)質(zhì)粒(Cas9n、wtCas9、dCas9)轉(zhuǎn)化大腸桿菌后產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖，顯示了CRISPR/Cas切口酶自殺系統(tǒng)對(duì)質(zhì)粒復(fù)制的影響。

圖5是實(shí)施例3中491、911、107、140、385五個(gè)靶點(diǎn)sgRNA表達(dá)質(zhì)粒與不同類型的Cas9表達(dá)質(zhì)粒(Cas9n、dCas9)共轉(zhuǎn)化大腸桿菌后產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖，顯示了CRISPR/Cas切口酶自殺系統(tǒng)篩選“效率適中”sgRNA靶點(diǎn)的結(jié)果。圖中各條帶：1、2：49D；3、4：49N1；5、6：49N2；7、8：49N3；9、10：49N4；11、12：91D；13、14:91N1；15、16：91N2；17、18：107N1；19、20：140N1；21、22：385N1。其中1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21為非誘導(dǎo)組，2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22為四環(huán)素誘導(dǎo)組。

圖6是實(shí)施例4中912、913、914、492、493和494號(hào)靶點(diǎn)sgRNA表達(dá)質(zhì)粒與Cas表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化大腸桿菌后產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖，顯示了調(diào)整sgRNA靶點(diǎn)長(zhǎng)度篩選“剪切效率適中”sgRNA的結(jié)果。圖中各條帶：1、2：911N；3、4：912N；5、6：913N；7、8：914N；9、10：491N；11、12：492N；13、14:493N；15、16：494N。所有樣品都為四環(huán)素誘導(dǎo)自剪切后提取的質(zhì)粒。

圖7是實(shí)施例5中491-494、911-914、Ori1R靶點(diǎn)sgRNA表達(dá)質(zhì)粒與Cas表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化大腸桿菌后產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖(溴化乙錠EB染色)，顯示了CRISPR/Cas切口酶自殺系統(tǒng)對(duì)不同sgRNA表達(dá)質(zhì)粒的自剪切效果。圖中各條帶：1：492D；2、3：492N；4、5：913N；6：OriR1D；7、8：OriR1N。所有樣品都為四環(huán)素誘導(dǎo)自剪切后提取的質(zhì)粒。D表示自殺sgRNA與dCas9表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化大腸桿菌；N表示自殺sgRNA與Cas9n表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化大腸桿菌。

圖8是實(shí)施例5中492、913、Ori1R靶點(diǎn)sgRNA表達(dá)質(zhì)粒與Cas表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化大 腸桿菌后產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖，顯示了CRISPR/Cas切口酶自殺系統(tǒng)對(duì)不同sgRNA表達(dá)質(zhì)粒的自剪切效果。圖中各條帶：1：492N；2：913N；4-6：OriR1N。所有樣品都為四環(huán)素誘導(dǎo)自剪切后提取的質(zhì)粒。D表示自殺sgRNA與dCas9表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化大腸桿菌；N表示自殺sgRNA與Cas9n表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化大腸桿菌。

圖9是實(shí)施例5中491、492、493、913、914靶點(diǎn)sgRNA表達(dá)質(zhì)粒與Cas表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化大腸桿菌后產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖(SYBR Green I染色)，顯示了CRISPR/Cas切口酶自殺系統(tǒng)對(duì)不同sgRNA表達(dá)質(zhì)粒的自剪切效果。圖中各條帶：1：491D；2：491N；3：492N；4：493N；5：913N；6：914N。所有樣品都為四環(huán)素誘導(dǎo)自剪切后提取的質(zhì)粒。D表示自殺sgRNA與dCas9表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化大腸桿菌；N表示自殺sgRNA與Cas9n表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化大腸桿菌。

圖10是實(shí)施例5中491、493靶點(diǎn)sgRNA表達(dá)質(zhì)粒與Cas表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化大腸桿菌后產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖(吖啶橙染色)，顯示了CRISPR/Cas切口酶自殺系統(tǒng)對(duì)不同sgRNA表達(dá)質(zhì)粒的自剪切效果。圖中各條帶：1：491D；2：491N；3：913N。所有樣品都為四環(huán)素誘導(dǎo)自剪切后提取的質(zhì)粒。D表示自殺sgRNA與dCas9表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化大腸桿菌；N表示自殺sgRNA與Cas9n表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化大腸桿菌。

圖11A是實(shí)施例5中限制性內(nèi)切酶消化自剪切DNA產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖。圖中各條帶：1：491D；2：491N；3：913N；4、913D；5、491N；6、913N；M、marker，其中1-3為EcoRI消化產(chǎn)物，4-6為PstI消化產(chǎn)物。

圖11B是實(shí)施例5中限制性內(nèi)切酶消化自剪切DNA產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖。圖中各條帶：1：491D；2：491N；3：913D；4、913N；5、491N；6、913N；M：marker，1-4為HpaII消化產(chǎn)物，5和6為未消化對(duì)照質(zhì)粒。所有樣品都為四環(huán)素誘導(dǎo)自剪切后提取的質(zhì)粒。D表示自殺sgRNA與dCas9表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化大腸桿菌；N表示自殺sgRNA與Cas9n表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化大腸桿菌。

圖12是實(shí)施例5中核酸酶S1消化自剪切DNA產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖。圖中各條帶：1-2：491D；3-4：491N；5-6：913N；M：marker，其中1、3、5為核酸酶S1消化產(chǎn)物，2、4、6為未消化對(duì)照質(zhì)粒。所有樣品都為四環(huán)素誘導(dǎo)自剪切后提取的質(zhì)粒。D表示自殺sgRNA與dCas9表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化大腸桿菌；N表示自殺sgRNA與Cas9n表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化大腸桿菌。

圖13是實(shí)施例5中瓊脂糖凝膠回收自剪切DNA副產(chǎn)物及其電泳鑒定圖。圖13A中各條帶：1-5：913N瓊脂糖凝膠電泳回收前。圖13B中各條帶：1-2：913N瓊脂糖凝膠回收的自剪切DNA副產(chǎn)物；3：913D對(duì)照；4：marker。D表示自殺sgRNA與dCas9表達(dá)質(zhì)粒 共轉(zhuǎn)化大腸桿菌；N表示自殺sgRNA與Cas9n表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化大腸桿菌。

圖14是實(shí)施例5中DNA自剪切生成特異性線性單鏈及測(cè)序引物示意圖。

圖15是實(shí)施例5中913N自剪切DNA副產(chǎn)物回收后測(cè)序結(jié)果示意圖。

圖16是實(shí)施例6中Ori20、21、23、25、28號(hào)靶點(diǎn)sgRNA表達(dá)質(zhì)粒與Cas表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化大腸桿菌后的培養(yǎng)結(jié)果，顯示了質(zhì)粒復(fù)制子區(qū)不同靶點(diǎn)對(duì)CRISPR/Cas切口酶自殺系統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)物的影響。

圖17是實(shí)施例6中Ori20、21、23、25、28號(hào)靶點(diǎn)sgRNA表達(dá)質(zhì)粒與Cas表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化大腸桿菌后產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖，顯示了質(zhì)粒復(fù)制子區(qū)不同靶點(diǎn)對(duì)CRISPR/Cas切口酶自殺系統(tǒng)生成LssDNA的影響。圖中“-”表示提取質(zhì)粒的大腸桿菌未經(jīng)四環(huán)素誘導(dǎo)；“+”表示提取質(zhì)粒的大腸桿菌為四環(huán)素誘導(dǎo)后的細(xì)菌。PC泳道為單獨(dú)轉(zhuǎn)化sgRNA表達(dá)質(zhì)粒細(xì)菌提取的質(zhì)粒；其他泳道皆為自殺sgRNA與Cas9n表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化大腸桿菌后的培養(yǎng)物所提取的質(zhì)粒；M是marker。

圖18是實(shí)施例7中Ori2、Ori4、Ori19、Ori22、Ori24、Ori25、Ori27、Ori28靶點(diǎn)sgRNA表達(dá)質(zhì)粒與Cas9n表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化大腸桿菌后產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖，顯示了不同操縱子對(duì)CRISPR/Cas切口酶自殺系統(tǒng)制備LssDNA的影響。圖中“-”表示提取質(zhì)粒的大腸桿菌未經(jīng)溫控誘導(dǎo)；“+”表示提取質(zhì)粒的大腸桿菌為溫控42℃誘導(dǎo)后的細(xì)菌。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)理解，以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而非用于限定本發(fā)明的范圍。

在本發(fā)明中，有時(shí)為了描述簡(jiǎn)便，會(huì)將sgRNA與其編碼基因(DNA)名稱混用，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)能理解它們?cè)诓煌枋鰣?chǎng)合表示不同的物質(zhì)。例如，sgRNA基因指的是可轉(zhuǎn)錄為sgRNA的基因DNA。

在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“線性單鏈DNA”、“單鏈線性DNA”、“線狀單鏈DNA”、“單鏈線狀DNA”、和“LssDNA”表示相同的含義。類似地，術(shù)語(yǔ)“線性長(zhǎng)單鏈DNA”、“長(zhǎng)單鏈線性DNA”、和“長(zhǎng)線性單鏈DNA”表示相同的含義，是指線性單鏈DNA。

在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“Cas切口酶轉(zhuǎn)錄表達(dá)質(zhì)?！?、“Cas切口酶表達(dá)質(zhì)?！?、“Cas轉(zhuǎn)錄表達(dá)質(zhì)?！?、和“Cas表達(dá)質(zhì)粒”表示相同的含義。類似地，術(shù)語(yǔ)“sgRNA基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)質(zhì)?！?、“sgRNA基因表達(dá)質(zhì)粒”、“sgRNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)質(zhì)?！?、和“sgRNA表達(dá)質(zhì)?！北硎鞠嗤暮x。

在本發(fā)明中，“自殺性”或“自殺”是指sgRNA與Cas切口酶的復(fù)合體剪切sgRNA基因自身所在的質(zhì)粒的DNA單鏈或雙鏈。

在本發(fā)明中所述方法中的CRISPR/Cas切口酶自殺系統(tǒng)包含兩個(gè)可在大腸桿菌細(xì)胞中兼容的基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)元件，其中一個(gè)轉(zhuǎn)錄表達(dá)元件可調(diào)控表達(dá)Cas切口酶蛋白，另一個(gè)表達(dá)元件為可調(diào)控或非可調(diào)控轉(zhuǎn)錄出靶向質(zhì)粒的自殺性sgRNA。

本發(fā)明中所述的CRISPR/Cas系統(tǒng)包括但不局限于I型、II型和III型CRISPR-Cas系統(tǒng)，Cas切口酶蛋白包括但不局限于Cas3、Cas9和、Cas10。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例中，優(yōu)選II型Cas9切口酶，更優(yōu)選化膿鏈球菌Cas9切口酶(spCas9n)。本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員熟知其他Cas蛋白的切口酶形式也可以具有Cas9切口酶相似的內(nèi)切酶活性和特點(diǎn)，例如金黃色葡萄球菌saCas9切口酶等。

本發(fā)明中所述基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)元件指整合于大腸桿菌基因組上的基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)元件或質(zhì)粒序列上的基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)元件。基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)元件包含操縱子、啟動(dòng)子、目的基因序列、終止序列、復(fù)制子和篩選標(biāo)記基因等基因功能元件。操縱子(operon)指啟動(dòng)基因、操縱基因和一系列緊密連鎖的結(jié)構(gòu)基因的總稱；在操縱子中很多功能上相關(guān)的基因前后相連成串，由一個(gè)共同的控制區(qū)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的控制，包括結(jié)構(gòu)基因以及調(diào)節(jié)基因的整個(gè)DNA序列。在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，操縱子能調(diào)控所述Cas切口酶和/或自殺sgRNA的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。在原核生物中常見(jiàn)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控表達(dá)元件包括但不局限于四環(huán)素操縱子、乳糖操縱子、阿拉伯糖操縱子、鼠李糖調(diào)節(jié)子、半乳糖操縱子、pR/pL操縱子等。在本發(fā)明的優(yōu)選具體實(shí)施例中，乳糖操縱子調(diào)控sgRNA轉(zhuǎn)錄或J23100組成型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)sgRNA轉(zhuǎn)錄。本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員熟知，當(dāng)sgRNA基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)元件為非調(diào)控型時(shí)，其啟動(dòng)子包括但不局限于lacZ、lacI及J23100等啟動(dòng)子。

本發(fā)明中所述的LssDNA制備方法的基礎(chǔ)是：含CRISPR/Cas切口酶自殺系統(tǒng)的大腸桿菌在非誘導(dǎo)條件下培養(yǎng)，自殺系統(tǒng)中的Cas切口酶受操縱子調(diào)控其表達(dá)量很低，無(wú)法與sgRNA協(xié)同作用有效切割DNA；當(dāng)細(xì)菌培養(yǎng)達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)誘導(dǎo)Cas切口酶表達(dá)，Cas切口酶開(kāi)始過(guò)量表達(dá)并協(xié)助自殺sgRNA切割sgRNA基因所在的質(zhì)粒的雙鏈DNA，使大量質(zhì)粒雙鏈DNA形成單鏈斷裂即切口狀態(tài)；繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)菌使切口質(zhì)粒能隨細(xì)菌生長(zhǎng)在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制擴(kuò)增，質(zhì)粒在θ型復(fù)制的過(guò)程中需要雙鏈DNA作為模板，由于質(zhì)粒的一條模板鏈斷裂無(wú)法完整復(fù)制而游離出來(lái)，形成LssDNA，從而實(shí)現(xiàn)在原核生物例如大腸桿菌中快速制備LssDNA。

本發(fā)明中所述自殺sgRNA的靶序列含有Cas切口酶/sgRNA復(fù)合物識(shí)別所必須的PAM 序列(protospacer)。在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，spCas9切口酶的PAM序列為NGG序列，自殺sgRNA的靶序列為5’-Nx-NGG-3’序列，其中N表示堿基A、T、C、G中的任意一種，x表示介于10-30之間的自然數(shù)。質(zhì)粒的自殺性sgRNA可靶向質(zhì)粒自身的任一包含PAM序列位置，Cas9n/sgRNA的剪切效率可以通過(guò)增長(zhǎng)或縮短靶序列調(diào)整。利用本發(fā)明中的CRISPR/Cas切口酶自殺系統(tǒng)可以篩選出最適合制備LssDNA的自殺sgRNA序列。優(yōu)選篩選得到的sgRNA對(duì)質(zhì)粒自身靶序列的剪切效率適中，所述“效率適中”指即能維持Cas切口酶蛋白對(duì)質(zhì)粒持續(xù)剪切，又能使質(zhì)粒在細(xì)胞中維持一定的拷貝數(shù)，使得攜帶目的基因的質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)持續(xù)擴(kuò)增，從而實(shí)現(xiàn)LssDNA的大量生成。

在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，Cas切口酶基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)元件和sgRNA基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)元件的篩選標(biāo)記基因?yàn)榭剐曰?，包括但不局限于氯霉素、氨芐青霉素、卡那霉素等。

本發(fā)明中所述Cas切口酶轉(zhuǎn)錄表達(dá)元件和/或自殺sgRNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)元件優(yōu)選位于質(zhì)粒序列上。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例中，Cas切口酶基因表達(dá)元件優(yōu)選包含低拷貝復(fù)制子p15或psc101，最優(yōu)選復(fù)制子為p15；sgRNA基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)元件優(yōu)選包含高拷貝復(fù)制子pMB1或ColE1，最優(yōu)選復(fù)制子為pMB1。本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員知悉Cas切口酶或sgRNA表達(dá)元件整合到大腸桿菌基因組或位于同一質(zhì)粒上中，也可實(shí)現(xiàn)相似的轉(zhuǎn)錄或表達(dá)功能。

本發(fā)明的創(chuàng)新點(diǎn)之一在于CRISPR/Cas切口酶自殺系統(tǒng)中的DNA內(nèi)切酶為Cas切口酶，其剪切效率取決于sgRNA靶序列，不同于經(jīng)典的限制性內(nèi)切酶切口酶。sgRNA的靶序列是可以人工設(shè)計(jì)和調(diào)整的，本發(fā)明的CRISPR/Cas切口酶自殺系統(tǒng)中自殺sgRNA靶向質(zhì)粒序列的識(shí)別序列一般為20個(gè)堿基左右，因此Cas切口酶只會(huì)在質(zhì)粒上的特異性序列處產(chǎn)生單鏈損傷(nick)，對(duì)細(xì)菌基因組DNA序列幾乎沒(méi)有影響，最小程度地降低對(duì)細(xì)菌生存的影響；經(jīng)典的DNA限制性內(nèi)切酶切口酶則僅識(shí)別特定的短序列，一般為4-8個(gè)堿基，因?yàn)榛蚪M序列數(shù)據(jù)龐大，所以無(wú)法設(shè)計(jì)或篩選出質(zhì)粒特異性的短序列。sgRNA的靶序列及長(zhǎng)度不同會(huì)導(dǎo)致Cas切口酶的剪切效率不同，基于此原理，可以調(diào)整sgRNA/Cas切口酶的剪切效率，而經(jīng)典的DNA限制性內(nèi)切酶切口酶在細(xì)胞內(nèi)一般無(wú)法調(diào)整剪切效率。

根據(jù)經(jīng)典的細(xì)菌DNA損傷修復(fù)理論，本發(fā)明中CRISPR/Cas切口酶自殺系統(tǒng)可能會(huì)影響細(xì)菌的生長(zhǎng)，但是我們發(fā)現(xiàn)由于本發(fā)明中的自殺sgRNA靶向質(zhì)粒而非基因組DNA，因此在非誘導(dǎo)條件下細(xì)菌生長(zhǎng)及質(zhì)粒復(fù)制皆未受到影響。更令人意外的是，當(dāng)誘導(dǎo)Cas切口酶表達(dá)后，部分sgRNA剪切“效率適中”時(shí)，雙鏈質(zhì)粒DNA并沒(méi)有遵循經(jīng)典的DNA損傷修復(fù)機(jī)制，而是產(chǎn)生了單鏈DNA副產(chǎn)物，這些ssDNA類似于噬菌體環(huán)狀ssDNA，能夠在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定存在，但其不是環(huán)狀ssDNA，而是以線狀形態(tài)存在。噬菌體ssDNA基 因組之所以穩(wěn)定，是因?yàn)槭删w基因組能表達(dá)結(jié)合單鏈DNA的保護(hù)蛋白，而質(zhì)粒ssDNA能穩(wěn)定存在于大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)的現(xiàn)象未見(jiàn)有任何報(bào)道，具有其獨(dú)特而新穎的形成機(jī)制。經(jīng)過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)和誘導(dǎo)條件，這種ssDNA副產(chǎn)物產(chǎn)量甚至高于原質(zhì)粒雙鏈DNA。我們還發(fā)現(xiàn)，這種ssDNA的產(chǎn)生效率只取決于sgRNA對(duì)靶DNA的剪切效率，而不取決于靶DNA序列在質(zhì)粒上的位置。試驗(yàn)表明，這種ssDNA的形成跟質(zhì)粒的復(fù)制過(guò)程密切相關(guān)，ssDNA的產(chǎn)量呈時(shí)間依賴性。本發(fā)明中所述的ssDNA產(chǎn)生機(jī)制完全不同于已有報(bào)道的理論，我們認(rèn)為在切口質(zhì)粒復(fù)制的過(guò)程中，由于Cas切口酶對(duì)dsDNA中的一條鏈發(fā)生持續(xù)定點(diǎn)剪切，使得以此斷裂鏈為模板的復(fù)制過(guò)程無(wú)法進(jìn)行，而另一條完整鏈的復(fù)制卻在解鏈酶及SSB等復(fù)制相關(guān)蛋白的協(xié)助下可能可以完成，由于ColE1質(zhì)粒為同向θ復(fù)制，斷裂鏈在這種不完整的復(fù)制過(guò)程中得以從雙鏈質(zhì)粒中解離出來(lái)并形成ssDNA，最終實(shí)現(xiàn)LssDNA的生產(chǎn)。

實(shí)施例

材料和方法

本文中的全基因合成、引物合成及測(cè)序皆由百奧邁科生物技術(shù)有限公司完成。

實(shí)施例1 CRISPR/Cas自殺系統(tǒng)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)元件和sgRNA靶序列設(shè)計(jì)及構(gòu)建

在本實(shí)施例中，CRISPR/Cas切口酶自殺系中的Cas切口酶表達(dá)元件和/或自殺sgRNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)元件分別位于不同的質(zhì)粒載體序列上，為雙質(zhì)粒系統(tǒng)。雙質(zhì)粒CRISPR/Cas切口酶自殺系統(tǒng)中的sgRNA表達(dá)質(zhì)粒為pJ23sgRNA-EGFP、pJ23sgRNA-GFPuv(TacI)或pJ23TacsgRNA-LacI-GFPuv；Cas9n表達(dá)質(zhì)粒為pETetCas9-Nickase、pPrPlCas9-Nickase或pETetCas9-Nickase(pSC101)。wtCas9表達(dá)質(zhì)粒為pETet-wtCas9；dCas9表達(dá)質(zhì)粒為pETet-dCas9，在本實(shí)施例中這兩個(gè)質(zhì)粒作為對(duì)照質(zhì)粒。上述所有載體質(zhì)粒皆為百奧邁科生物技術(shù)有限公司構(gòu)建，所有質(zhì)粒的核苷酸全序列及功能元件序列如序列表中所示。如圖2所示，在基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)元件中，Cas9n基因和或sgRNA基因可由不同的操縱子調(diào)控轉(zhuǎn)錄表達(dá)，且可包含不同的復(fù)制子。

1.設(shè)計(jì)自殺性sgRNA靶序列：在自殺靶質(zhì)粒上選取任意含5’-Nx-NGG-3’序列為自殺sgRNA靶點(diǎn)序列，如表1所示，根據(jù)設(shè)計(jì)好的自殺sgRNA靶序列合成相應(yīng)的DNA引物序列用于亞克隆試驗(yàn)。

表1不同自殺sgRNA靶序列

2.根據(jù)靶序列合成引物如下：

具體引物序列參見(jiàn)表2。

表2各質(zhì)粒的引物序列

注：引物名稱中的F或f表示正向引物，R或r表示反向引物。

3.將pJ23sgRNA-EGFP質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶BamHI和XbaI雙酶切后回收線性質(zhì)粒DNA、將pJ23sgRNA-GFPuv(TacI)質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶BsaI單酶切后回收線性質(zhì)粒DNA，將pJ23TacsgRNA-LacI-GFPuv用限制性內(nèi)切酶BglII和NotI雙酶切后回收線性質(zhì)粒。

4.用pJ23sgRNA-EGFP和pJ23sgRNA-GFPuv(TacI)構(gòu)建sgRNA表達(dá)質(zhì)粒時(shí)，將合成的正反向DNA引物退火后形成粘末端雙鏈DNA，與上述線性質(zhì)粒DNA連接轉(zhuǎn)化后PCR鑒定篩選得到陽(yáng)性克??；用pJ23TacsgRNA-LacI-GFPuv質(zhì)粒構(gòu)建sgRNA表達(dá)質(zhì)粒時(shí)，則直接合成sgRNA全序列后，用限制性內(nèi)切酶BglII和NotI雙酶切后再與線性質(zhì)粒DNA連接轉(zhuǎn)化，PCR鑒定篩選得到陽(yáng)性克隆。

實(shí)施例2利用CRISPR/Cas切口酶自殺系統(tǒng)制備LssDNA的獨(dú)特性

1.試驗(yàn)方法

將實(shí)施例1中得到的911F號(hào)靶點(diǎn)sgRNA表達(dá)質(zhì)粒和不同類型的Cas9切口酶表達(dá)質(zhì)粒(Cas9n、wtCas9、dCas9)共轉(zhuǎn)化大腸桿菌化學(xué)感受態(tài)，將全部轉(zhuǎn)化菌液涂布于氨芐青霉素/氯霉素雙抗性LB平板上于37℃溫箱中過(guò)夜培養(yǎng)。不同類型Cas9切口酶表達(dá)質(zhì)粒分別為pETetCas9-Nickase(p15)、pETet-wtCas9和pETet-dCas9，轉(zhuǎn)化菌分組分別對(duì)應(yīng)命名為91N、91WT和91D。

挑取抗性平板上的陽(yáng)性克隆子，分別在4mL LB雙抗性培養(yǎng)液中37℃培養(yǎng)12小時(shí)，收獲細(xì)菌前添加四環(huán)素誘導(dǎo)劑以便誘導(dǎo)Cas9蛋白表達(dá)2-4個(gè)小時(shí)，誘導(dǎo)劑量為每1mL LB培養(yǎng)基中加入1μl濃度為10mg/mL的鹽酸四環(huán)素溶液，然后收獲全部細(xì)菌，提取質(zhì)粒，溶于60μl TE溶液，提取質(zhì)粒后進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，點(diǎn)樣量為2μl。

2.試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果如圖3所示，野生型Cas9+自殺sgRNA對(duì)質(zhì)粒的剪切最為高效，從而導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)相應(yīng)的抗生素篩選更為敏感，因此抗性平板上的陽(yáng)性克隆極為稀少；dCas9和Cas9Nickase則不能剪切或不能完全剪切自殺靶向質(zhì)粒，使得大部分質(zhì)粒仍然可以復(fù)制并維持表達(dá)抗性基因，陽(yáng)性克隆子數(shù)量幾乎不受影響。

在質(zhì)粒產(chǎn)量上，91d大于91N，91N大于91wt，即便由于wtCas9質(zhì)粒能夠少量存在于細(xì)胞內(nèi)，也使得其質(zhì)粒的最終產(chǎn)量非常少，細(xì)菌生長(zhǎng)速度也低于dCas9和Cas9Nickase，尤其是在誘導(dǎo)后，不僅收獲菌量較少，而且自殺質(zhì)粒幾乎消失殆盡。另外在誘導(dǎo)條件下，91d分組的質(zhì)粒隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，質(zhì)粒產(chǎn)量也隨之增加；而由于Cas9Nickase仍然具有部分的剪切效應(yīng)，因此質(zhì)粒產(chǎn)量增加緩慢。

在瓊脂糖電泳圖4中可以發(fā)現(xiàn)，切口酶分組中可以發(fā)現(xiàn)其質(zhì)粒超螺旋DNA下方有自剪切DNA副產(chǎn)物，為線性單鏈DNA。CRISPR/Cas切口酶自殺系統(tǒng)優(yōu)于CRISPR/wtCas9自殺系統(tǒng)，因?yàn)镃RISPR/wtCas9自殺系統(tǒng)無(wú)法維持質(zhì)粒的正常復(fù)制擴(kuò)增；CRISPR/Cas切口酶自殺系統(tǒng)優(yōu)于CRISPR/dCas系統(tǒng)，因?yàn)镃RISPR/dCas系統(tǒng)無(wú)法實(shí)現(xiàn)質(zhì)粒DNA自剪切，所以91D組也無(wú)線性單鏈DNA副產(chǎn)物生成。

3.試驗(yàn)結(jié)論

CRISPR/Cas切口酶自殺系統(tǒng)區(qū)別于CRISPR/wtCas9或CRISPR/dCas自殺系統(tǒng)，既維持了帶自殺sgRNA質(zhì)粒細(xì)菌的生存能力，又可以相當(dāng)程度保留質(zhì)粒的復(fù)制能力。試驗(yàn)結(jié)果表明CRISPR/Cas切口酶自殺系統(tǒng)是一種獨(dú)特的新型自殺系統(tǒng)，可用于制備DNA自剪切副產(chǎn)物，即線性單鏈DNA。

實(shí)施例3 CRISPR/Cas9n自殺系統(tǒng)篩選“效率適中”sgRNA靶點(diǎn)

1.試驗(yàn)方法

按實(shí)施例1所述方法，構(gòu)建491、911、107、140、385五個(gè)靶點(diǎn)sgRNA表達(dá)質(zhì)粒，將上述質(zhì)粒分別與不同類型的Cas9表達(dá)質(zhì)粒(Cas9n、dCas9)共轉(zhuǎn)化大腸桿菌化學(xué)感受態(tài)，轉(zhuǎn)化后涂布氨芐青霉素/氯霉素雙抗性LB平板37℃過(guò)夜培養(yǎng)，待其單克隆生長(zhǎng)完畢， 分別挑取若干單克隆菌培養(yǎng)于4ml雙抗性LB液體培養(yǎng)基，37℃過(guò)夜培養(yǎng)。將上述單克隆菌種液體培養(yǎng)物200μl接種于新的4ml雙抗性LB液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)，待其生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，按千分之一比例添加10mg/mL鹽酸四環(huán)素液體誘導(dǎo)劑，以誘導(dǎo)Cas9n的表達(dá)，繼續(xù)培養(yǎng)6小時(shí)后，離心收獲全部細(xì)菌，并提取質(zhì)粒溶于60μl TE溶液，提取質(zhì)粒后進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，點(diǎn)樣量為2μl。轉(zhuǎn)化菌分組分別對(duì)應(yīng)命名為49N、49D、91N、91D、107N、140N和385N；同一分組不同克隆株則直接在其分組名稱上重新編號(hào)，例如49N1、49N2、49N3等，以此類推。

2.試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果如下：如圖5所示，不同靶點(diǎn)sgRNA因?yàn)榧羟行实牟煌?，超螺旋質(zhì)粒/自剪切DNA副產(chǎn)物比例亦有所不同，其中107、140和385靶點(diǎn)由于自剪切效率較高，在誘導(dǎo)Cas9n后sgRNA表達(dá)質(zhì)粒完整雙鏈DNA數(shù)量非常之少，無(wú)法表達(dá)一定數(shù)量的抗性基因，因此在雙抗培養(yǎng)基中無(wú)法生長(zhǎng)，即無(wú)法提取到質(zhì)粒。而49和91號(hào)靶點(diǎn)則因?yàn)樽约羟行瘦^弱，仍然維持一定數(shù)量的完整雙鏈DNA，因此可以表達(dá)足夠的抗性基因并在雙抗LB液體培養(yǎng)基中正常生長(zhǎng)，與此同時(shí)，在Cas9n的剪切和質(zhì)粒自我復(fù)制的協(xié)同作用下，產(chǎn)生大量的小分子量自剪切DNA副產(chǎn)物。優(yōu)選491號(hào)靶點(diǎn)和911號(hào)靶點(diǎn)作為進(jìn)一步優(yōu)化的sgRNA靶點(diǎn)。其中49號(hào)靶點(diǎn)在Cas切口酶泄漏表達(dá)水平，即可產(chǎn)生一定量的自剪切DNA副產(chǎn)物，誘導(dǎo)Cas切口酶表達(dá)后質(zhì)粒復(fù)制反而受到影響；而91號(hào)靶點(diǎn)在Cas切口酶誘導(dǎo)表達(dá)后產(chǎn)生的自剪切DNA副產(chǎn)物更多。

3.試驗(yàn)結(jié)論

結(jié)果表明通過(guò)CRISPR/Cas切口酶自殺系統(tǒng)可以穩(wěn)定快速地篩選出剪切“效率適中”的sgRNA靶點(diǎn)。

實(shí)施例4調(diào)整sgRNA靶點(diǎn)長(zhǎng)度篩選最優(yōu)“效率適中”sgRNA

1.試驗(yàn)方法

根據(jù)上述實(shí)施例3中的試驗(yàn)結(jié)果，將911和491號(hào)靶點(diǎn)長(zhǎng)度分別伸長(zhǎng)或縮短若干個(gè)堿基，重新構(gòu)建相應(yīng)的自殺性sgRNA表達(dá)載體，分別命名為912、913、914、492、493和494號(hào)靶點(diǎn)，然后與Cas切口酶表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)。誘導(dǎo)試驗(yàn)方法、檢測(cè)方法及分組命名規(guī)則與實(shí)施例3相同。其中491-494號(hào)sgRNA靶點(diǎn)長(zhǎng)度分別為20、18、16、25nt；911-914號(hào)sgRNA靶點(diǎn)長(zhǎng)度分別為20、17、24、27nt。

2.試驗(yàn)結(jié)果

如圖6所示，491-494系列靶點(diǎn)和911-914系列靶點(diǎn)的剪切效率都表現(xiàn)出很強(qiáng)的靶點(diǎn)長(zhǎng)度依賴性。與剪切效率較強(qiáng)的491號(hào)系列靶點(diǎn)相比，靶點(diǎn)長(zhǎng)度縮短后的492和493號(hào)靶點(diǎn)的質(zhì)粒復(fù)制能力更好，DNA自剪切副產(chǎn)物產(chǎn)量更高；當(dāng)494號(hào)靶點(diǎn)長(zhǎng)度伸長(zhǎng)到25nt時(shí)，剪切效率最強(qiáng)并導(dǎo)致細(xì)菌在雙抗培養(yǎng)基中無(wú)法正常生長(zhǎng)，因此提取不到相應(yīng)質(zhì)粒。911-914系列靶點(diǎn)同樣呈現(xiàn)出隨靶點(diǎn)長(zhǎng)度增長(zhǎng)剪切效率增強(qiáng)的效果。因?yàn)榧羟行什粌H取決于sgRNA長(zhǎng)度，還取決于序列中的堿基組成，因此即便914靶點(diǎn)伸長(zhǎng)到27nt時(shí)，靶點(diǎn)仍然表現(xiàn)出剪切效率適中。優(yōu)選913、914、492、493號(hào)靶點(diǎn)為最優(yōu)sgRNA靶點(diǎn)。

3.試驗(yàn)結(jié)論

通過(guò)伸長(zhǎng)或縮短sgRNA靶點(diǎn)序列長(zhǎng)度可以調(diào)整sgRNA基因表達(dá)質(zhì)粒在CRISPR/Cas切口酶自殺系統(tǒng)的自剪切能力，篩選出剪切效率適中的最適合生產(chǎn)線性單鏈DNA的靶點(diǎn)序列，從而提高自剪切DNA副產(chǎn)物的產(chǎn)量。

實(shí)施例5 CRISPR/Cas切口酶自殺系統(tǒng)自剪切DNA產(chǎn)物為線性單鏈DNA的鑒定

1.試驗(yàn)方法

a)分子量大小測(cè)定：按實(shí)施例1中所述的方法，除491-494和911-914靶點(diǎn)的sgRNA表達(dá)載體外，再構(gòu)建靶向Ori1R靶點(diǎn)的sgRNA表達(dá)載體pJ23TacsgRNAOri1R-LacI-GFPuv；然后按照實(shí)施例3中所述方法生產(chǎn)、純化不同靶點(diǎn)的自剪切DNA副產(chǎn)物；1％瓊脂糖凝膠電泳分析不同樣品的DNA自剪切DNA副產(chǎn)物的分子量，點(diǎn)樣量為3μl，瓊脂糖凝膠染料為溴化乙錠(EB)。

b)SYBR Green I DNA染色和吖啶橙DNA染色：按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)分別制備SYBR Green I(百奧邁科)和Gold view(翊圣生物，吖啶橙染料)的1％瓊脂糖進(jìn)行凝膠電泳，樣品為步驟a)中不同靶點(diǎn)的自剪切DNA產(chǎn)物，點(diǎn)樣量為3μl，在紫外凝膠成像儀中顯色成像。

c)限制性內(nèi)切酶酶切檢測(cè)：按照II型DNA限制性內(nèi)切酶EcoRI、PstI和HpaII產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)(NEB)，分別剪切不同自殺性sgRNA靶點(diǎn)的自剪切DNA產(chǎn)物，然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，所有樣品為步驟a)中不同靶點(diǎn)的自剪切DNA產(chǎn)物。

d)單鏈特異性核酸酶S1降解檢測(cè)：按照核酸酶S1(Invitrogen)說(shuō)明書(shū)消化不同自殺性sgRNA靶點(diǎn)的自剪切DNA產(chǎn)物，然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，樣品為步驟a)中不同靶點(diǎn)的自剪切DNA產(chǎn)物。瓊脂糖凝膠電泳染料為吖啶橙。

e)測(cè)序驗(yàn)證：按照DNA凝膠回收試劑盒(Biomics)回收自殺性sgRNA靶點(diǎn)的自剪切DNA副產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后進(jìn)行測(cè)序并分析測(cè)序結(jié)果。

2.試驗(yàn)結(jié)果

a)如圖7所示，CRISPR/Cas切口酶自殺系統(tǒng)可以使序列完全不同的sgRNA表達(dá)質(zhì)粒都產(chǎn)生自剪切DNA副產(chǎn)物。與dCas9表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化大腸桿菌則不能產(chǎn)生自剪切DNA副產(chǎn)物。

本試驗(yàn)中492和913號(hào)靶點(diǎn)的sgRNA表達(dá)質(zhì)粒皆為pJ23sgRNA-EGFP，其序列總長(zhǎng)為3.7kb，質(zhì)粒為氨芐抗性；OriR1靶點(diǎn)的sgRNA表達(dá)質(zhì)粒則為pJ23TacsgRNA-LacI-GFPuv，其序列總長(zhǎng)約為5.2kb；質(zhì)粒pETetCas9-Nickase(p15)序列總長(zhǎng)約為6.7kb。如圖8所示，自剪切DNA產(chǎn)物重新電泳，比對(duì)天根生化科技有限公司1kb DNA marker，計(jì)算不同質(zhì)粒的自剪切DNA副產(chǎn)物大小。結(jié)果表明，不同質(zhì)粒的自剪切DNA副產(chǎn)物分子量大小皆約等于原自殺sgRNA表達(dá)質(zhì)粒的分子量的1/2，即1.9kb、1.9kb、2.6kb，因此自剪切DNA副產(chǎn)物為完整的質(zhì)粒單鏈DNA時(shí)，符合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

b)SYBR Green I是一種結(jié)合于所有dsDNA雙螺旋小溝區(qū)域的具有綠色激發(fā)波長(zhǎng)的染料。在游離狀態(tài)下，SYBRGreen I發(fā)出微弱的熒光，但一旦與雙鏈DNA結(jié)合后，熒光大大增強(qiáng)。因此，SYBR Green I的熒光信號(hào)強(qiáng)度與雙鏈DNA的數(shù)量相關(guān)，可以根據(jù)熒光信號(hào)檢測(cè)出PCR體系存在的雙鏈DNA數(shù)量。SYBRGreen I的最大吸收波長(zhǎng)約為497nm，發(fā)射波長(zhǎng)最大約為520nm。最大激發(fā)波長(zhǎng)454nm。在紫外照射透視下，與雙鏈DNA接合的SYBR Green I呈現(xiàn)綠色熒光。如果瓊脂糖凝膠中含有單鏈DNA，則顏色為橘黃而不是綠色。

將不同自殺sgRNA表達(dá)質(zhì)粒的自剪切DNA副產(chǎn)物樣品進(jìn)行SYBR Green I瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下觀察檢測(cè)。如圖9所示：Cas切口酶和sgRNA表達(dá)質(zhì)粒本身為雙鏈閉環(huán)DNA，超螺旋及開(kāi)環(huán)質(zhì)粒均呈現(xiàn)綠色，dCas9無(wú)法剪切sgRNA質(zhì)粒，對(duì)應(yīng)泳道無(wú)橘黃色ssDNA條帶；Cas9n能剪切sgRNA表達(dá)質(zhì)粒并導(dǎo)致dsDNA形態(tài)占比減少，綠色超螺旋及開(kāi)環(huán)質(zhì)粒條帶變?nèi)?，而最下方多出?lái)的自剪切DNA副產(chǎn)物條帶為橘黃色ssDNA。

吖啶橙(acridine orange，AO)屬于三環(huán)雜芳香染料，可以染色dsDNA、ssDNA或者RNA。其于核酸的結(jié)合方式主要有兩種：一種為插入性結(jié)合，AO嵌入核酸雙鏈的堿基對(duì)之間，這種方式主要為AO與dsDNA結(jié)合，其熒光發(fā)射峰為530nm，激發(fā)后呈綠色熒光；另一種為靜電吸引，帶正電荷的AO與單鏈核酸的磷酸根(帶負(fù)電荷)產(chǎn)生靜電間的吸引結(jié)合，這種結(jié)合方式主要為AO與ssDNA及RNA的結(jié)合，其熒光發(fā)射峰為640nm，激發(fā)后呈紅色熒光，少量結(jié)合會(huì)成桔黃色或橘紅色。因此吖啶橙嵌合到雙鏈DNA分子中顯綠色，與DNA單鏈或RNA結(jié)合時(shí)發(fā)桔黃色或橘紅色熒光。

如圖10所示：dCas9和自殺sgRNA共轉(zhuǎn)無(wú)法產(chǎn)生顯色為紅色的ssDNA；而Cas9n和自殺sgRNA共轉(zhuǎn)可以產(chǎn)生大量顯色為紅色的自剪切ssDNA副產(chǎn)物；sgRNA和Cas9表達(dá)質(zhì)粒的其它形態(tài)都呈現(xiàn)為綠色。

c)如圖11A所示：用EcoRI和PstI分別單酶切鑒定不同分組的自剪切DNA產(chǎn)物，491D、913D與491N、913N理論上的消化產(chǎn)物應(yīng)完全一致，但自剪切DNA副產(chǎn)物不能被識(shí)別雙鏈DNA的限制性DNA內(nèi)切酶消化。如圖11B所示，再選取HpaII限制性內(nèi)切酶進(jìn)行鑒定試驗(yàn)，自剪切副產(chǎn)物仍然在一定時(shí)間內(nèi)不能被消化，而其他形態(tài)質(zhì)粒則被完全消化。區(qū)別于EcoRI和PstI，HpaII酶只識(shí)別雙鏈DNA的四個(gè)堿基“CCGG”，因此自殺sgRNA表達(dá)質(zhì)粒上均勻分布有多達(dá)18個(gè)消化位點(diǎn)。在如此多的識(shí)別位點(diǎn)存在下，自剪切DNA副產(chǎn)物保持穩(wěn)定，表明其在這些識(shí)別位點(diǎn)區(qū)序列都為單鏈DNA形態(tài)。

d)核酸酶S1來(lái)源于稻谷曲霉(Aspergillμsoryzae)，是一種高度單鏈特異的核酸內(nèi)切酶，在最適的酶催反應(yīng)條件下，特異性降解單鏈DNA或RNA，產(chǎn)生帶5'-磷酸的單核苷酸或寡核苷酸。該酶對(duì)雙鏈DNA、雙鏈RNA和DNA-RNA雜交體相對(duì)不敏感。核酸酶S1水解單鏈DNA的速率要比水解雙鏈DNA快75000倍。S1核酸酶的單鏈水解功能可以作用于雙鏈核酸分子的單鏈區(qū)，并從單鏈部位切斷核酸分子，而且這種單鏈區(qū)可以小到只有一個(gè)堿基對(duì)的程度，因此可以用核酸酶S1來(lái)鑒別dsDNA和ssDNA。

如圖12所示：自剪切DNA副產(chǎn)物能被核酸酶S1完全降解，491N和913N酶消化組泳道相應(yīng)位置無(wú)任何紅色ssDNA條帶，而未加酶分組則有ssDNA紅色條帶；491D對(duì)照組無(wú)論是否消化都無(wú)紅色ssDNA條帶，由于核酸酶S1雖然不降解雙鏈DNA，但可能仍然會(huì)形成DNP(DNA蛋白復(fù)合物)引起不同形態(tài)dsDNA位置上移。上述結(jié)果表明，自剪切DNA副產(chǎn)物為完全單鏈。

e)如圖13所示，913N自剪切DNA副產(chǎn)物可以用瓊脂糖凝膠電泳回收試劑盒成功回收。將上述ssDNA回收產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，正向引物分別為M13F：5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’)、eGFP-F：5’-CATGGTCCTGCTGGAGTTCGTG-3’)，反向引物為M13R：5’-CAGGAAACAGCTATGACC-3’)。

如圖14所示，為確保測(cè)序能夠驗(yàn)證自剪切DNA副產(chǎn)物是否為線性ssDNA，測(cè)序引物M13F和M13R序列距離Cas切口酶剪切位點(diǎn)小于800bp，以保證測(cè)序儀可以檢測(cè)到該位點(diǎn)信號(hào)；引物eGFP-F則是為了檢驗(yàn)線性單鏈的完整性，其序列位于預(yù)測(cè)線性ssDNA的3’端。

結(jié)果如圖14顯示，兩條正向引物均可以正常測(cè)序，而反向引物無(wú)法測(cè)序成功。證明 了本實(shí)驗(yàn)中所用Cas切口酶Cas9(D10A)特異性剪切與sgRNA互補(bǔ)的DNA單鏈，其單鏈切口在反義鏈上，導(dǎo)致生成的自剪切ssDNA產(chǎn)物為反義鏈，因此反向引物無(wú)法測(cè)序成功。

如圖15所示，以M13F引物測(cè)序時(shí)，測(cè)序信號(hào)在Cas9n的理論剪切位點(diǎn)處戛然而止，即PAM位點(diǎn)上游4個(gè)堿基處。上述結(jié)果表明Cas9n(D10A)剪切sgRNA互補(bǔ)鏈并導(dǎo)致該單鏈從質(zhì)粒上分離開(kāi)來(lái)，形成的自剪切DNA副產(chǎn)物為線性ssDNA(LssDNA)；該LssDNA5’末端序列完整，在細(xì)胞內(nèi)沒(méi)有任何堿基降解，這可能是跟復(fù)制相關(guān)蛋白的結(jié)合保護(hù)有關(guān)；靠近3’端的eGFP-F引物測(cè)序成功表明ssDNA在3’端序列也是完整的。

3.試驗(yàn)結(jié)論

CRISPR/Cas切口酶自殺系統(tǒng)生成的自剪切DNA副產(chǎn)物為線性單鏈DNA(LssDNA)，該單鏈?zhǔn)菑馁|(zhì)粒dsDNA中分離的Cas切口酶剪切鏈，線性單鏈DNA兩端序列完整無(wú)降解。

實(shí)施例6 CRISPR/Cas切口酶自殺系統(tǒng)生成LssDNA為非序列特異性

1.試驗(yàn)方法

按實(shí)施例1中所述方法構(gòu)建靶向質(zhì)粒oriV復(fù)制區(qū)序列的不同sgRNA表達(dá)質(zhì)粒，靶點(diǎn)序列及引物參見(jiàn)實(shí)施例1。構(gòu)建的自殺sgRNA表達(dá)質(zhì)粒與Cas切口酶質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)。誘導(dǎo)試驗(yàn)方法、檢測(cè)方法及分組命名規(guī)則與實(shí)施例3相同。sgRNA表達(dá)質(zhì)粒為pJ23sgRNA-GFPuv(TacI)，該質(zhì)粒攜帶有GFPuv基因表達(dá)框，GFPuv表達(dá)量的多少可以通過(guò)UV射線下觀察大腸桿菌培養(yǎng)液中的綠色熒光蛋白多寡而得以評(píng)估。檢測(cè)不同sgRNA靶點(diǎn)在CRISPR/Cas切口酶自殺系統(tǒng)中生成的LssDNA數(shù)量；評(píng)估LssDNA生成是否與GFPuv表達(dá)量具有相關(guān)性。PC為僅轉(zhuǎn)化pJ23sgRNA-GFPuv(TacI)質(zhì)粒表達(dá)菌，NC無(wú)質(zhì)粒大腸桿菌。

2.試驗(yàn)結(jié)果

如圖16所示，Cas切口酶誘導(dǎo)表達(dá)后，轉(zhuǎn)化Ori20、21、23、25、28號(hào)靶點(diǎn)質(zhì)粒的菌株無(wú)論GFPuv表達(dá)量還是細(xì)菌培養(yǎng)物濃度都遠(yuǎn)低于PC組。其中Ori20和Ori28號(hào)靶點(diǎn)GFPuv表達(dá)量和細(xì)菌培養(yǎng)物濃度最低，Ori21和Ori23號(hào)靶點(diǎn)優(yōu)于Ori20和Ori28號(hào)靶點(diǎn)，Ori25號(hào)靶點(diǎn)最優(yōu)。GPFuv表達(dá)量與細(xì)菌培養(yǎng)物濃度呈正相關(guān)關(guān)系。

提取各分組誘導(dǎo)后質(zhì)粒，結(jié)果如圖17所示：21、23、25號(hào)靶點(diǎn)質(zhì)粒皆可以誘導(dǎo)產(chǎn)生ssDNA產(chǎn)物，但25號(hào)靶點(diǎn)剪切效率適中，產(chǎn)量最高；20和28號(hào)靶點(diǎn)誘導(dǎo)后細(xì)菌生長(zhǎng)極少無(wú)法提取質(zhì)粒，誘導(dǎo)前細(xì)菌培養(yǎng)物提取質(zhì)粒中sgRNA表達(dá)質(zhì)粒及其剪切DNA副產(chǎn)物也非常少。自剪切生成的LssDNA數(shù)量與上述GFPuv表達(dá)量及細(xì)菌培養(yǎng)物濃度呈正相關(guān)關(guān)系。

本實(shí)施例中各靶點(diǎn)序列皆位于復(fù)制子區(qū)(Ori)，并不靶向GFPuv表達(dá)基因或氨芐青霉素抗性基因，CRISPR/Cas切口酶自殺系統(tǒng)并不直接作用于上述表達(dá)基因元件，無(wú)論是GFPuv的表達(dá)量還是細(xì)菌培養(yǎng)物的數(shù)量都取決于細(xì)菌中sgRNA表達(dá)質(zhì)粒的拷貝數(shù)。試驗(yàn)結(jié)果表明，LssDNA副產(chǎn)物的生成量只與使用的sgRNA靶點(diǎn)的剪切效率有關(guān)，當(dāng)剪切效率高時(shí)，相應(yīng)自殺質(zhì)?？截悢?shù)降低，直接導(dǎo)致GFPuv和氨芐青霉素抗性基因表達(dá)量下降，并影響細(xì)菌生長(zhǎng)。剪切效率適中時(shí)則有利于LssDNA的生成。

3.試驗(yàn)結(jié)論

CRISPR/Cas切口酶自殺系統(tǒng)中LssDNA的生成機(jī)制為非序列特異性，只跟剪切效率有關(guān)，跟靶序列在質(zhì)粒中所處位置無(wú)關(guān)，剪切效率則跟靶點(diǎn)的堿基組成及序列長(zhǎng)度密切相關(guān)。

實(shí)施例7不同操縱子對(duì)CRISPR/Cas切口酶自殺系統(tǒng)制備LssDNA的影響

1.試驗(yàn)方法

按實(shí)施例1所述方法，構(gòu)建Ori2、Ori4、Ori19、Ori22、Ori24、Ori25、Ori27、Ori28多個(gè)靶點(diǎn)sgRNA表達(dá)質(zhì)粒，將上述質(zhì)粒分別與Cas9n表達(dá)質(zhì)粒pPrPl Cas9Nickase共轉(zhuǎn)化大腸桿菌化學(xué)感受態(tài)，轉(zhuǎn)化后涂布氨芐青霉素/氯霉素雙抗性LB平板，37℃過(guò)夜培養(yǎng)，待其單克隆生長(zhǎng)完畢，分別挑取若干單克隆菌培養(yǎng)于4ml雙抗性LB液體培養(yǎng)基過(guò)夜37℃培養(yǎng)。將上述單克隆菌種液體培養(yǎng)物200μl接種于新的4ml雙抗性LB液體培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)，待其生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，將培養(yǎng)溫度調(diào)整為42℃以誘導(dǎo)Cas9n的表達(dá)，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)后，離心收獲全部細(xì)菌并提取質(zhì)粒溶于60μl TE溶液，提取質(zhì)粒后進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，點(diǎn)樣量為2μl。

2.試驗(yàn)結(jié)果

將CRISPR/Cas切口酶自殺系統(tǒng)中的Cas切口酶基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)元件中的操縱子替換為PrPl溫控操縱子，驗(yàn)證不同的操縱子是否影響線性單鏈DNA的制備。即將質(zhì)粒pETetCas9-Nickase替換為質(zhì)粒pPrPl Cas9Nickase，誘導(dǎo)條件改為溫度調(diào)整為42℃培養(yǎng)。如圖18所示，在新的CRISPR/Cas切口酶自殺系統(tǒng)中，不同靶點(diǎn)的自殺sgRNA仍然容易形成自剪切副產(chǎn)物L(fēng)ssDNA。與四環(huán)素操縱子CRISPR/Cas切口酶自殺系統(tǒng)類似，不同自殺sgRNA因剪切效率不同，LssDNA的產(chǎn)量及占總DNA比例有所不同。

3.試驗(yàn)結(jié)論

在CRISPR/Cas切口酶自殺系統(tǒng)中，基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)元件可以使用不同類型的操縱子調(diào) 控Cas切口酶和/或sgRNA的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，都可以達(dá)到制備LssDNA的目的。

上述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明制備線性單鏈DNA(LssDNA)的技術(shù)方案進(jìn)行了驗(yàn)證，本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)理解，在不違背本發(fā)明的思想下，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在此基礎(chǔ)上做出各種改動(dòng)或者修改，所做的各種變形或者修改的等價(jià)形式，同樣應(yīng)屬于本發(fā)明的范圍。