本發(fā)明屬生物技術領域，具體涉及一種檢測G種腸道病毒抗體診斷抗原及其試劑盒。

背景技術：

羊G種腸道病毒（CEV），屬于小RNA病毒科腸道病毒屬。羊腸道病毒感染是目前國內(nèi)外新發(fā)的一種臨床上以消化道和呼吸道為主要特征的疫病，給養(yǎng)羊業(yè)帶來嚴重威脅。

根據(jù)病毒的最新分類，小RNA病毒科腸道病毒屬包括A、B、C、D、E、F、G、H和J共9個種腸道病毒。羊腸道病毒屬G種病毒，該病的發(fā)生給健康養(yǎng)殖造成嚴重危害。申請人于2014年從吉林多地爆發(fā)的一種臨床上以嚴重腹瀉，高發(fā)病率和高致死率為主要特征的不明疫病中的山羊體內(nèi)分離到G種腸道病毒CEV-JL14，經(jīng)過序列測定與分析發(fā)現(xiàn)，該毒株不同于目前報道的所有動物腸道病毒，其核苷酸序列的同源性與綿羊的最高，只有83%，用于該病毒檢測與診斷的方法尚未見報道。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種檢測G種腸道病毒抗體的診斷抗原。

一種G種腸道病毒基因VP1，它的堿基序列如序列表SEQ ID NO.1所示；可采用PCR技術，以G種腸道病毒基因組cDNA為模板擴增獲得，也可人工合成；

一種G種腸道病毒蛋白VP1，它的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示；

一種用于檢測動物血清中G種腸道病毒抗體的間接 ELISA 試劑盒，它的包被抗原為氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示的蛋白VP1。

本發(fā)明提供了一種G種腸道病毒基因VP1，它的堿基序列如序列表SEQ ID NO.1所示，表達的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示的蛋白VP1，作為包被抗原制備的一種用于檢測動物血清中G種腸道病毒抗體的間接 ELISA 試劑盒，安全、靈敏度高、特異性強、操作簡便快速、成本低。

本發(fā)明的優(yōu)點

1、具有生物安全性。試劑盒所用的G種腸道病毒VP1抗原為純化的基因工程表達產(chǎn)物，不存在潛在散毒危險；

2、靈敏度高、特異性強。該試劑盒只檢出G種腸道病毒抗體，而病毒性腹瀉病毒（BVDV）、口蹄疫病毒（FMDV）、牛細小病毒（BPV）陽性血清反應均呈陰性，表明該試劑盒具有特異性；

3、操作簡便快速。試劑盒3 h 即可報告結(jié)果，使用方便，一般技術人員按說明書即可操作，條件一般實驗室均可進行；

4、成本低，投資少。該試劑盒成本在2-3元/頭份，成本低，投資少，見效快。

附圖說明

圖1 pGEX-4T-1-VP1重組質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果（泳道M：DNA分子marker；泳道1：pGEX-4T-1-VP1 EcoRI/XhoI雙酶切；泳道2：pGEX-4T-1-VP1 EcoRI單酶切）；

圖2重組VP1蛋白的SDS-PAGE檢測結(jié)果（泳道M：蛋白質(zhì)分子量marker；泳道1 ：pGEX-4T-1-VP1重組菌未誘導總蛋白；泳道2：pGEX-4T-1-VP1重組菌誘導后總蛋白；泳道3：純化后的重組VP1蛋白）。

具體實施方式

實施例1 G種腸道病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1原核表達重組質(zhì)粒的構(gòu)建

1、引物設計

根據(jù)目標序列的堿基組成，分別設計引物擴增VP1基因，上下游分別含有EcoRI、XhoI酶切位點。引物序列如下：

上游引物：5' TTGAATTCCAGGCTGGGTATGTGACT 3' （EcoRI）

下游引物：5' TCTCGAGTTAATGAAAATCACTGAGGGGTT 3' (XhoI)

2、基因擴增

常規(guī)Trizol法提取G種腸道病毒的基因組RNA，采用市售常規(guī)反轉(zhuǎn)錄試劑盒，按照說明操作獲得cDNA，并以其為模板擴增VP1基因，PCR反應體系：

PCR運行條件：94℃預變性3min；94℃變性1.5min、54℃退火40sec、72℃延伸40sec，共35個循環(huán)；72℃再延伸6min。反應結(jié)束后，取1μL進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

3、目標基因與pGEX-4T-1的連接、轉(zhuǎn)化

采用分子生物學領域中的常規(guī)酶切、連接等技術，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-VP1，并采用CaCl₂法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)中。利用含100 μg/mL氨芐霉素的LB培養(yǎng)平板篩選陽性克隆，并進行常規(guī)增菌培養(yǎng)，收獲菌體，提取質(zhì)粒，進行EcoRI/XhoI雙酶切鑒定，如圖1所示。

實施例2 VP1重組蛋白的表達及純化

將鑒定的陽性重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-VP1轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3) 感受態(tài)細胞后，涂板，37℃培養(yǎng)過夜，挑取單個菌落接種到3 mL含有100 μg/mL氨芐霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，然后取1 mL上述培養(yǎng)物接種到200 mL含有100 μg/mL氨芐霉素的LB液體培養(yǎng)基中37℃振搖培養(yǎng)至對數(shù)生長期(OD₆₀₀=0.6)，加入IPTG(終濃度1 mmol/L)，20℃誘導培養(yǎng)3 h，經(jīng)SDS-PAGE檢測，獲得了重組目標蛋白VP1，如圖2所示（泳道2）。離心沉淀菌體, 超聲破碎后以1.5M尿素洗滌3次后獲得高純度的重組蛋白，如圖2所示（泳道3）。

實施例3間接ELISA方法的建立

1、反應條件的建立

（1）方陣確定抗原包被濃度及酶標二抗最佳稀釋倍數(shù)

采用方陣滴定法，確定包被抗原和酶標二抗最佳工作濃度。將制備的重組VP1抗原進行稀釋，分別以0.2、0.3、0.4和0.5 μg/孔包被反應板，每個稀釋度設8個重復孔，每孔100 μL，同時設置8個空白對照孔，每孔加入100 μL包被液，置于4℃包被過夜。取出后用PBS-T洗滌3次，每次5 min。用5%脫脂奶粉37℃封閉30 min，洗滌同上。加入用PBS-T稀釋1000×的陽性血清及陰性血清樣品，每孔100 μL，37℃作用30 min，洗滌同上。HRP標記兔抗羊IgG分別以1000×、3000×和5000×稀釋，37℃作用60 min，洗滌同上。然后，向各孔加入新鮮配制的OPD-H₂O₂底物顯色液50 μL，37℃避光顯色10 min。最后每孔加入50 μL 2mol /L H₂SO₄終止液，輕輕混勻，在酶標儀上測定OD₄₉₀值，計算出陰、陽性比值（P/N值），以P/N值最大所對應的抗原濃度和HRP酶標二抗稀釋度作為最優(yōu)工作濃度。確定最佳抗原濃度為0.2μg/孔，而最佳酶標二抗稀釋倍數(shù)為1：5000（見表1）。

（2）VP1抗原最佳包被條件確定

將抗原包被于酶標板后，分別進行4℃過夜，37℃感作45 min，37℃感作90 min，按上述方法進行實驗，測定OD₄₉₀值并分析P/N比值變化情況，由于后兩種條件結(jié)果差異不顯著。確定抗原的最佳包被條件為37℃作用45 min（見表2）。

（3）最佳封閉液及最佳封閉時間的確定

在上述確定的條件下，本實驗分別以5%馬血清、5%脫脂奶粉、2%BSA和1%BSA作為封閉液，測定OD₄₉₀值，并分析P/N比值變化情況，確定最佳封閉液為2% BSA（見表3）。在2% BSA作為封閉液確定后，測定三種不同封閉時間（60 min、90 min、120 min），確定最佳封閉時間為60 min（見表4）。

P：陽性血清；N：陰性血清；P/N：為陽性血清與陰性血清OD₄₉₀的比值

（4）HRP標記兔抗羊IgG最佳孵育時間的確定

在HRP標記兔抗羊IgG工作濃度確定的條件下，于37℃下將其分別作用30 min、60 min、90 min，測定OD₄₉₀值，確定二抗最佳孵育時間為60 min（見表5）。

P：陽性血清；N：陰性血清；P/N：為陽性血清與陰性血清OD₄₉₀的比值

（5）最佳底物顯色的確定

通過4組不同的OPD底物反應時間: 5 min、10 min、15 min、20 min，用2M H₂SO₄終止液終止反應，其他按步驟已優(yōu)化條件進行，確定最佳底物顯色時間為10 min（見表6）。

（6）間接ELISA陰性和陽性判定標準的確定

取20份采集的背景清潔羊血清樣本，經(jīng)中和試驗方法檢測為CEV抗體陰性后，用上述初步建立的間接ELISA方法檢測，以20份陰性血清的平均OD₄₉₀值加減3倍標準差作為陰性和陽性樣品的臨界值，大于該值為陽性，小于或等于該值為陰性。確定此臨界值約為0.1。

（7）敏感性試驗

本實驗將23陽性血清樣品及5份陰性血清樣品進行適當稀釋，應用間接 ELISA 方法對上述樣品進行檢測，結(jié)果表明，間接ELISA方法敏感性為100%，敏感性極高（見表7）。

（8）ELISA的特異性試驗

本實驗應用建立的間接ELISA方法分別檢測不同傳染病的陽性血清包括牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）、口蹄疫病毒（FMDV）、牛細小病毒（BPV）陽性血清。結(jié)果發(fā)現(xiàn)所建立的ELISA方法與牛其它傳染病血清有無交叉反應性，表明該方法具有高特異性（見表8）。

（9）重復性試驗

板內(nèi)、板間重復性實驗：以建立的間接ELISA方法，分別應用同批次不同酶標板和不同批次酶標板測定陽性血清及陰性血清的（各做4孔重復）OD₄₉₀。_.統(tǒng)計學分析顯示板內(nèi)陽性、陰性血清檢測百分率變異系數(shù)分別為3.9%、5.1%；板間陽性、陰性血清檢測百分率變異系數(shù)分別為4.1%、4.4%，均小于10%，說明檢測方法重復性好（見表9）。

注：1、2、3、4為ELISA板編號。其中，板1、2為同一批次;板3、4為另一批次。

實施例4 間接ELISA試劑盒組裝

將建立好的間接ELISA方法中所用到的試劑盒材料：（1） 96孔抗體檢測ELISA板，（2）樣品稀釋液，（3）10×濃縮洗滌液，（4）封閉液，（5）HRP標記兔抗羊IgG工作液，（6）顯色液A，（7）顯色液B，（8）終止液，（9）陽性樣品，（10）陰性樣品。

將上述各組分分別用相應的廣口瓶加以封裝，貼上標簽，組裝成試劑盒，具體操作如下：

（1）96孔抗體檢測ELISA板：以 pH9.5的碳酸鹽包被液稀釋重組VP1抗原，每孔加入0.2 μg，37℃感作45min；洗滌甩干后，以含2% BSA的PBS-T溶液37℃封閉60 min，洗滌后真空塑封。

（2）樣品稀釋液（PBS pH7.4）：取NaCl8.0 g；KH₂PO₄0.2 g；Na₂HPO₄ ·12H₂O 2.9 g；KCl 0.2 g溶于1000 mL雙蒸水，分裝50mL/瓶。

（3）10×濃縮洗滌液：取NaCl80.0 g；KH₂PO₄2 g；Na₂HPO₄ ·12H₂O 29 g；KCl 2 g溶于1000 mL雙蒸水；加入5 mL Tween-20，分裝50 mL /瓶。

（4）封閉液：取2g BSA溶于100mL PBS，分裝10mL/瓶。

（5）HRP標記兔抗羊IgG：由博奧森生物工程有限公司制備（北京）；

（6）顯色液A：取OPD 300 mg溶于500 ml雙蒸水，分裝10mL/瓶。

（7）顯色液B：3% H₂O₂ ，分裝10mL/瓶。

（8）終止液：取2mol /L H₂SO₄ 44.5 mL與雙蒸水355.5 ml混合，分裝5mL/瓶。

（9）陽性血清樣品對照：中和試驗確定為G種腸道病毒的陽性血清按1:500稀釋于樣品稀釋液中，分裝1mL/瓶。

（10）陰性血清樣品對照：檢測為G種腸道病毒的陰性血清按1:500稀釋于樣品稀釋液中，分裝1mL/瓶。

實施例5間接ELISA試劑盒穩(wěn)定性的確定

試劑盒4℃放置2、4、6、9九個月后，測定其特異性和敏感性。結(jié)果該試劑盒4℃保存6個月后，檢測效果與新包被ELISA方法無明顯差異，表明該試劑盒4℃保存6個月后具有很好的穩(wěn)定性。

實施例6人工合成VP1基因

人工合成如序列表SEQ ID NO.1所示的VP1基因，按實施例2方法表達蛋白VP1，作為診斷抗原制備的間接ELSA試劑盒，與實施例1的基因效果相似。

<110> 吉林大學

<120>G種腸道病毒診斷抗原及其試劑盒

<160> 2

<210> 1

<211> 677

<212> DNA

<213> 人工

<400> 1

caggctgggt atgtgactgg ttggtaccag accaacatgg tgatccctcc cgagtttccc 60

cagaccgcta atatcatctg tttagtggca gcacaaccaa atttttccct gcgagtgtta 120

aaagatcgtc cagacatgga ccagactgcc gctttgcaac taccaccagt gggtgagcag 180

attagagagt ttatgggtga gactgtttct aatgcattga ctgccgccaa caccactgaa 240

agcactcaca atatttcaac gagtgatacc ccagcacttc aagctgccga gacgggggca 300

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<210> 2

<211> 225

<212> DNA

<213> 人工

<400> 2

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