本發(fā)明涉及生物檢測領(lǐng)域，特別是涉及一種軍團菌抗原膠體金檢測試劑盒及其制備方法和用途。
背景技術(shù)：
軍團菌為需氧的多性革蘭陰性菌，廣泛存在于自然環(huán)境中，其傳染源是水源和空調(diào)系統(tǒng)，通過空氣傳播。軍團桿菌的菌體微小,懸浮在空氣中,人在正常呼吸時,會將空氣中含有軍團桿菌的氣溶膠吸入呼吸道內(nèi),致使軍團桿菌有機會侵染肺泡組織和巨噬細胞,引發(fā)炎癥,導(dǎo)致軍團菌病，易爆發(fā)流行。
軍團桿菌可以侵犯身體內(nèi)許多器官,因此其臨床表現(xiàn)常是多種多樣。軍團菌病根據(jù)臨床特征,一般分為兩種類型,一類為非肺炎型,病情較輕,潛伏期1～2d,似普通感冒或流感樣起病,有發(fā)熱、肌痛、咽喉疼痛、咳嗽等癥狀,約1～2周可自愈。另一類是肺炎型,潛伏期2～10d,其初發(fā)癥狀為全身不適、疲乏、肌肉酸痛、頭痛、發(fā)熱、咳嗽、胸痛、咳血、呼吸困難等,還能侵犯消化系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng),重癥病人可出現(xiàn)肝功能變化及腎功能衰竭,并可出現(xiàn)精神紊亂等臟器損害。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
鑒于以上所述現(xiàn)有技術(shù)的缺點，本發(fā)明的目的在于提供一種軍團菌抗原膠體金檢測試劑盒及其制備方法和用途，用于解決現(xiàn)有技術(shù)中的問題。
為實現(xiàn)上述目的及其他相關(guān)目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
本發(fā)明的第一方面，提供一種軍團菌抗原膠體金檢測試劑盒，包括試紙卡，所述試紙卡包括底板、及位于底板表面的從加樣端開始依次排列的樣品墊、金標墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，所述金標墊上包含抗軍團菌單克隆抗體-1，所述硝酸纖維素膜上包被有檢測線和質(zhì)控線，所述金標墊上的抗軍團菌單克隆抗體-1采用膠體金標記。
優(yōu)選的，所述底板為PVC底板。
優(yōu)選的，所述硝酸纖維素膜上，檢測線位于離加樣端較近一側(cè)，質(zhì)控線位于離加樣端較遠一側(cè)。
優(yōu)選的，所述檢測線上包被有抗軍團菌單克隆抗體-2。所述金標墊上的抗軍團菌單克隆抗體-1與檢測線上的抗軍團菌單克隆抗體-2可以是相同的抗體，也可以是不同的抗體。
優(yōu)選的，質(zhì)控線上包被羊抗鼠IgG多克隆抗體。
優(yōu)選的，所述樣品墊采用緩沖液處理，所述緩沖液選自PBS緩沖液、Tris-HCl緩沖液、甘氨酸緩沖液、硼酸鹽緩沖液和檸檬酸-磷酸鹽緩沖液中的一種或多種的組合，緩沖液的濃度為50-100mM。
優(yōu)選的，本發(fā)明所述的金標墊還經(jīng)過預(yù)處理，預(yù)處理時所使用的預(yù)處理緩沖液選自甘氨酸緩沖液、Tris-HCl緩沖液、硼酸鹽緩沖液的一種或多種的組合，緩沖液的濃度為10-40mM。
優(yōu)選的，所述緩沖液還包括反應(yīng)增強劑，所述反應(yīng)增強劑選自PEG4000、PEG6000、PEG8000和PEG20000中的任意一種，所述反應(yīng)增強劑的濃度為10～50g/L。
優(yōu)選的，所述緩沖溶液還包括表面活性劑，所述表面活性劑選自S-19TWEEN 20、S-20TWEEN 80、S-13TRITON X-45、S-14TRITON X-100、S-15TRITON X305中的任意一種或多種的組合，所述表面活性劑的濃度為20～40g/L。
優(yōu)選的，為了使得試劑盒具有更佳的靈敏度和顯色效果，本發(fā)明所述的金標墊在預(yù)處理時所使用的預(yù)處理緩沖液包括下列組分：果糖、氫氧化鋁、葡萄糖、氯化鈉和甘氨酸，且果糖、氫氧化鋁、葡萄糖、氯化鉀和甘氨酸的總濃度為4.5－6.5g/L，緩沖液的pH值為7.3－7.5。
優(yōu)選的，各組分在緩沖液中的濃度為：
果糖1.0-2.0g/L；氫氧化鋁0.25-0.75g/L；葡萄糖1.0-1.5g/L；氯化鈉0.25-0.5g/L；甘氨酸2.0-2.25g/L。
所述預(yù)處理緩沖液的溶劑為水。
所述預(yù)處理的具體步驟為：將金標墊在預(yù)處理液中浸泡1.5～2h，取出放于36～38℃烘干。
所述預(yù)處理緩沖液可使用本領(lǐng)域各種常用的pH調(diào)節(jié)劑進行pH值的調(diào)節(jié)。
優(yōu)選的，所述試劑盒還包括卡殼，所述卡殼包括背卡和上蓋，所述背卡設(shè)有試紙卡卡槽，所述試紙卡嵌于所述試紙卡卡槽內(nèi)，所述上蓋設(shè)有測試窗和加樣孔，所述測試窗的位置與所述檢測線和質(zhì)控線的位置相配合，所述加樣孔的位置與所述樣品墊的位置相配合。
更優(yōu)選的，所述卡殼為塑料卡殼。
優(yōu)選的，所述檢測試劑盒用于定性檢測人尿液中軍團菌抗原。
本發(fā)明第二方面提供所述軍團菌抗原膠體金檢測試劑盒的制備方法，包括如下步驟：
1)用膠體金標記的抗軍團菌單克隆抗體-1溶液噴涂金標墊，制得包含抗軍團菌單克隆抗體-1的金標墊；
2)在硝酸纖維素膜的檢測線和質(zhì)控線上分別噴涂抗軍團菌單克隆抗體-2及羊抗鼠IgG多克隆抗體，制得包被后的硝酸纖維素膜；
3)將樣品墊、步驟1)制備金標墊、步驟2)制備的硝酸纖維素膜、吸水墊依次粘貼在底板上，切裁制得檢測試紙卡；最后將檢測試紙卡裝入卡殼制得檢測試劑盒。
優(yōu)選的，本發(fā)明所述的金標墊還經(jīng)過預(yù)處理，預(yù)處理時所使用的預(yù)處理緩沖液選自甘氨酸緩沖液、Tris-HCl緩沖液、硼酸鹽緩沖液的一種或多種的組合，緩沖液的濃度為10-40mM。
優(yōu)選的，所述緩沖液還包括反應(yīng)增強劑，所述反應(yīng)增強劑選自PEG4000、PEG6000、PEG8000和PEG20000中的任意一種，所述反應(yīng)增強劑的濃度為10～50g/L。
優(yōu)選的，所述緩沖溶液還包括表面活性劑，所述表面活性劑選自S-19TWEEN 20、S-20TWEEN 80、S-13TRITON X-45、S-14TRITON X-100、S-15TRITON X305中的任意一種或多種的組合，所述表面活性劑的濃度為20～40g/L。
優(yōu)選的，為了使得試劑盒具有更佳的靈敏度和顯色效果，本發(fā)明所述的金標墊在預(yù)處理時所使用的預(yù)處理緩沖液包括下列組分：果糖、氫氧化鋁、葡萄糖、氯化鈉和甘氨酸，且果糖、氫氧化鋁、葡萄糖、氯化鉀和甘氨酸的總濃度為4.5－6.5g/L，緩沖液的pH值為7.3－7.5。
優(yōu)選的，各組分在緩沖液中的濃度為：
果糖1.0-2.0g/L；氫氧化鋁0.25-0.75g/L；葡萄糖1.0-1.5g/L；氯化鈉0.25-0.5g/L；甘氨酸2.0-2.25g/L。
所述預(yù)處理緩沖液的溶劑為水。
所述預(yù)處理的具體步驟為：將金標墊在預(yù)處理液中浸泡1.5～2h，取出放于36～38℃烘干。
所述預(yù)處理緩沖液可使用本領(lǐng)域各種常用的pH調(diào)節(jié)劑進行pH值的調(diào)節(jié)。
本發(fā)明第三方面提供所述軍團菌抗原膠體金檢測試劑盒在軍團菌抗原檢測領(lǐng)域的用途。
本發(fā)明的有益效果為：
本發(fā)明所提供的軍團菌抗原膠體金檢測試劑盒兼具高靈敏性和高特異性，能夠快速檢測軍團菌抗原。此外，所述檢測試劑盒具有操作快速簡便、結(jié)果準確、經(jīng)濟適用等優(yōu)點。
具體實施方式
以下通過特定的具體實例說明本發(fā)明的實施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可由本說明書所揭露的內(nèi)容輕易地了解本發(fā)明的其他優(yōu)點與功效。本發(fā)明還可以通過另外不同的具體實施方式加以實施或應(yīng)用，本說明書中的各項細節(jié)也可以基于不同觀點與應(yīng)用，在沒有背離本發(fā)明的精神下進行各種修飾或改變。
在進一步描述本發(fā)明具體實施方式之前，應(yīng)理解，本發(fā)明的保護范圍不局限于下述特定的具體實施方案；還應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明實施例中使用的術(shù)語是為了描述特定的具體實施方案， 而不是為了限制本發(fā)明的保護范圍；在本發(fā)明說明書和權(quán)利要求書中，除非文中另外明確指出，單數(shù)形式“一個”、“一”和“這個”包括復(fù)數(shù)形式。
當(dāng)實施例給出數(shù)值范圍時，應(yīng)理解，除非本發(fā)明另有說明，每個數(shù)值范圍的兩個端點以及兩個端點之間任何一個數(shù)值均可選用。除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的意義相同。除實施例中使用的具體方法、設(shè)備、材料外，根據(jù)本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員對現(xiàn)有技術(shù)的掌握及本發(fā)明的記載，還可以使用與本發(fā)明實施例中所述的方法、設(shè)備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術(shù)的任何方法、設(shè)備和材料來實現(xiàn)本發(fā)明。
除非另外說明，本發(fā)明中所公開的實驗方法、檢測方法、制備方法均采用本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)的分子生物學(xué)、生物化學(xué)、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和分析、分析化學(xué)、細胞培養(yǎng)、重組DNA技術(shù)及相關(guān)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。這些技術(shù)在現(xiàn)有文獻中已有完善說明，具體可參見Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；the series METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS IN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，Academic Press，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，Chromatin Protocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
實施例1 本發(fā)明試紙卡的制備
1)使用預(yù)處理緩沖液對金標墊進行預(yù)處理，預(yù)處理緩沖液為：果糖1.5g/L，氫氧化鋁0.5g/L，葡萄糖1.25g/L，氯化鈉0.3g/L，甘氨酸2.0g/L的水溶液，pH＝7.4，預(yù)處理的具體步驟為：將金標墊在預(yù)處理液中浸泡2h，取出放于37℃烘干；然后用膠體金標記的抗軍團菌單克隆抗體-1溶液噴涂經(jīng)預(yù)處理的金標墊，制得包被抗軍團菌單克隆抗體-1的金標墊，溶液中膠體金與抗體的質(zhì)量比為5:1，溶液的濃度為10mg/ml，噴涂量為4ul/cm；
2)在硝酸纖維素膜的檢測線和質(zhì)控線上分別噴涂1mg/ml的抗軍團菌單克隆抗體-2溶液和羊抗鼠IgG多克隆抗體溶液，噴涂量為1ul/cm，制得包被后的硝酸纖維素膜；
3)將樣品墊、步驟1)制備金標墊、步驟2)制備的硝酸纖維素膜、吸水墊依次粘貼在PVC底板上，切裁制得寬3-5mm的檢測試紙卡；最后將檢測試紙卡裝入卡殼制得檢測試劑盒。
實施例2 對比試劑盒的制備
對比例試紙卡的制備：采用25mM甘氨酸緩沖液預(yù)處理金標墊，其他試劑及實驗方法均同實施例1。
1)采用25mM甘氨酸緩沖液預(yù)處理金標墊，然后用膠體金標記的抗軍團菌單克隆抗體-1溶液噴涂經(jīng)預(yù)處理的金標墊，制得包被抗軍團菌單克隆抗體-1的金標墊，溶液中膠體金與抗體的質(zhì)量比為5:1，溶液的濃度為10mg/ml，噴涂量為4ul/cm；
2)在硝酸纖維素膜的檢測線和質(zhì)控線上分別噴涂1mg/ml的抗軍團菌單克隆抗體-2溶液和羊抗鼠IgG多克隆抗體溶液，噴涂量為1ul/cm，制得包被后的硝酸纖維素膜；
3)將樣品墊、步驟1)制備金標墊、步驟2)制備的硝酸纖維素膜、吸水墊依次粘貼在PVC底板上，切裁制得寬3-5mm的檢測試紙卡；最后將檢測試紙卡裝入卡殼制得檢測試劑盒。
實施例3 檢測試劑盒的特異性實驗
檢測方法：
1.取實施例1制備的本發(fā)明試劑盒和實施例2的對比試劑盒，將試劑盒放置在水平臺面上。2.待測樣品的制備：按表1的四類實驗對象，從檢測者尿液中取樣，使用0.01M pH7.2的PBS緩沖液稀釋，稀釋比例為1：1。。
3.每類實驗對象為100人，對比實驗所用的樣品相同，檢測結(jié)果如表1：
表1檢測試劑盒特異性試驗結(jié)果
由上表可知，本發(fā)明的檢測試劑盒對大腸桿菌及痢疾桿菌均無交叉反應(yīng)，特異性良好。
綜上所述，本發(fā)明所提供的檢測試劑盒具有良好的抗干擾性和特異性，且具有很好的靈 敏性，陰性本底更低，有效克服了現(xiàn)有技術(shù)中的種種缺點而具高度產(chǎn)業(yè)利用價值。
上述實施例僅例示性說明本發(fā)明的原理及其功效，而非用于限制本發(fā)明。任何熟悉此技術(shù)的人士皆可在不違背本發(fā)明的精神及范疇下，對上述實施例進行修飾或改變。因此，舉凡所屬技術(shù)領(lǐng)域中具有通常知識者在未脫離本發(fā)明所揭示的精神與技術(shù)思想下所完成的一切等效修飾或改變，仍應(yīng)由本發(fā)明的權(quán)利要求所涵蓋。