本發(fā)明屬于病原物檢測技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，涉及一種CMV-PVY雙重病毒膠體金快速檢測試紙條。

背景技術(shù)：

黃瓜花葉病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)、馬鈴薯Y病毒(Potato virus Y，PVY)是侵染煙草的主要病毒。它們引發(fā)的病毒病每年導(dǎo)致煙草產(chǎn)業(yè)巨大的經(jīng)濟損失?？焖?、準(zhǔn)確地定性檢測相關(guān)病毒是生產(chǎn)上防控病害、減少損失的重要手段之一。

在科學(xué)研究中，植物病毒的檢測方法主要有生物學(xué)檢測法(癥狀類型辨別、鑒別寄主等)、電鏡技術(shù)、血清學(xué)檢測法(酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)等)和分子生物學(xué)檢測法(包括PCR技術(shù)、核酸探針技術(shù)等)等。分離病毒照電鏡雖然是診斷病毒的有效手段，其特異性強，但非常費時費力，需要專業(yè)的技術(shù)人員，不適合推廣使用。血清學(xué)檢測方法比較費時、費力。免疫熒光、ELLSA等方法雖然具有微量、特異、快速、準(zhǔn)確的優(yōu)點，但需要比較完備的試驗儀器和經(jīng)驗豐富的技術(shù)人員來操作和判斷結(jié)果，檢測一批樣品整個流程需要4～8小時，對于基層工作場所很難做到。PCR及核酸探針的診斷更需要有特殊的儀器和藥品，技術(shù)含量很高，一般只適于實驗室診斷或研究應(yīng)用，很難在基層推廣。因此，迫切需要建立一種簡單、快速、靈敏、廉價并且適合于基層應(yīng)用的病毒診斷方法。

1971年膠體金作為標(biāo)記物開始用于免疫組織化學(xué)。Faulk等應(yīng)用電鏡免疫膠體金染色法觀察沙門氏菌。許多學(xué)者進(jìn)一步證實膠體金能穩(wěn)定迅速地吸附蛋白質(zhì)，而蛋白質(zhì)的生物活性無明顯改變。它可以作為探針進(jìn)行細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)多糖、蛋白質(zhì)、多肽、抗原、激素、核酸等生物大分子的精確定位，也可以用于日常的免疫診斷，進(jìn)行免疫組織化學(xué)定位。膠體金溶液是指分散相粒子直徑在1～150nm之間的金溶膠，屬于多相不均勻體系，顏色呈桔紅色到紫紅色。免疫膠體金層析技術(shù)(Gold immunochromatography assay，GICA)作為一種新的免疫學(xué)檢測方法，是20世紀(jì)80年代在免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)基礎(chǔ)上建立起來的一種新型獨特的診斷技術(shù)。這項技術(shù)將膠體金標(biāo)記技術(shù)、免疫檢測技術(shù)、層析分析技術(shù)、單(多)克隆抗體技術(shù)和新材料技術(shù)等多種方法有機結(jié)合在一起，具有簡單、快速、準(zhǔn)確、無污染、操作簡單和無需特殊設(shè)備等優(yōu)點，在醫(yī)學(xué)、動植物檢疫、食品安全監(jiān)督各領(lǐng)域得到了日益廣泛的應(yīng)用。20世紀(jì)90年代初到中期，膠體金標(biāo)記免疫層析診斷技術(shù)開始進(jìn)入商業(yè)化應(yīng)用。利用這種技術(shù)開發(fā)的膠體金快速檢測試紙條具有操作簡便、快捷、可單份檢測、便于保存、不需特殊設(shè)備等優(yōu)點，可在現(xiàn)場(臨床)對目標(biāo)病原進(jìn)行初篩，節(jié)省大量的人力、物力。在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，這種技術(shù)除用于激素、傳染病病原的抗原和抗體、細(xì)菌、寄生蟲的檢測外，還發(fā)展到了對毒品等小分子物質(zhì)的檢測。檢測的標(biāo)本類型也涵蓋了血清、血漿、全血、尿、糞便及唾液等，顯示出了廣闊的前景和巨大的應(yīng)用價值。

目前，膠體金試紙條在國內(nèi)主要應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域和畜牧獸醫(yī)領(lǐng)域，植物病毒方面很少見到。在農(nóng)牧領(lǐng)域，較少有成熟的產(chǎn)品，更多的出現(xiàn)在相關(guān)的科研項目中。孫艷等(2011)應(yīng)用膠體金技術(shù)進(jìn)行了黃瓜細(xì)菌性角斑病(Pseudomona.s.syringae pv.Lachrymans)的快速檢測研究。國內(nèi)涉及到煙草病毒病檢測的商用膠體金試紙條非常少。國外的商品化試紙條非常昂貴，價格在50～60元人民幣/張，不適于生產(chǎn)上大批煙苗的檢測使用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷和不足，提供一種廣東煙區(qū)CMV-PVY雙重病毒膠體金快速檢測試紙條。核心技術(shù)是開發(fā)針對煙草苗期主要病毒黃瓜花葉病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)、馬鈴薯Y病毒(Potato virus Y，PVY)的雙重膠體金檢測試紙條。實現(xiàn)一次取樣，兩種病毒同時診斷，讓煙農(nóng)操作方便，診斷及時準(zhǔn)確。

本發(fā)明的目的是提供一株可以產(chǎn)生CMV特異單抗的雜交瘤細(xì)胞株BALBc-15-27，以及一株可以產(chǎn)生PVY特異單抗的雜交瘤細(xì)胞株BALBc-15-8。

本發(fā)明另一目的是提供一種CMV-PVY雙重病毒膠體金快速檢測試紙條。

本發(fā)明的再一目的是提供所述CMV-PVY雙重病毒膠體金快速檢測試紙條的應(yīng)用。

本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：

一株產(chǎn)生CMV的特異單抗的雜交瘤細(xì)胞株BALBc-15-27，于2016年6月30日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.12679，保藏地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號。

同時，由上述雜交瘤細(xì)胞株BALBc-15-27分泌產(chǎn)生的CMV特異抗體也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

一株產(chǎn)生PVY的特異單抗的雜交瘤細(xì)胞株BALBc-15-8，于2016年6月30日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.12677，保藏地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號。

同時，由上述雜交瘤細(xì)胞株BALBc-15-8分泌產(chǎn)生的PVY特異抗體也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

另外，由上述CMV特異抗體和PVY特異抗體制備的CMV-PVY雙重病毒膠體金快速檢測試紙條，也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

優(yōu)選地，所述CMV-PVY雙重病毒膠體金快速檢測試紙條由樣品墊、膠體金墊、NC膜、吸水濾紙和背襯組成；所述樣品墊、膠體金墊和NC膜按照從左至右、從上至下的順序依次結(jié)合在背襯同一面上，膠體金墊和NC膜的端部重疊；所述吸水濾紙結(jié)合在NC膜的另一端；所述膠體金墊上包被有膠體金標(biāo)記的CMV特異抗體和PVY特異抗體，所述NC膜上設(shè)置有檢測線(T線)和控制線(C線)，且檢測線(T線)位于膠體金墊和控制線(C線)之間的位置；檢測線(T線)上包被有兩種病毒的特異抗原；控制線(C線)上包被有膠體金標(biāo)記的二抗。

上述CMV-PVY雙重病毒膠體金快速檢測試紙條在CMV和/或PVY病毒的檢測方面，具有很好的應(yīng)用前景，尤其是針對廣東煙區(qū)的CMV和/或PVY病毒，檢測靈敏度可以達(dá)到1g/100mL。

本發(fā)明利用競爭抑制法，成功構(gòu)建了CMV-PVY的雙重檢測試紙條。其基本原理如下：

膠體金標(biāo)記的CMV、PVY特異抗體吸附在結(jié)合墊(即膠體金墊)上，兩種病毒的特異抗原以條帶狀固定在硝酸纖維膜的測試線(T線)處上，膠體金標(biāo)記的二抗固定在硝酸纖維膜的控制線(C線)處。當(dāng)待檢樣本加到試紙條一端的樣本墊上后，通過毛細(xì)作用向前移動，溶解結(jié)合墊上的膠體金標(biāo)記特異試劑后相互反應(yīng)，再移動至固定的抗原區(qū)域時，待檢物與金標(biāo)記抗體的結(jié)合物又與之發(fā)生特異性結(jié)合。

當(dāng)待測樣本含有CMV、PVY當(dāng)中的一種或兩種時，它與溶解在樣本墊上的膠體金標(biāo)記的相應(yīng)病毒的特異抗體相互反應(yīng)；再移動至固定的抗原區(qū)域時，已經(jīng)沒有足夠的金標(biāo)抗體與固定的抗原反應(yīng)，T線處沒有紅棕色線條出現(xiàn)，實驗結(jié)果為陽性。游離的金標(biāo)抗體或者金標(biāo)抗體復(fù)合物流經(jīng)C處時，與該處的二抗結(jié)合出現(xiàn)紅棕色質(zhì)控帶。

當(dāng)待測樣本沒有CMV、PVY當(dāng)中的任意一種病毒時，它與溶解在結(jié)合墊上的膠體金標(biāo)記抗體不發(fā)生反應(yīng)；再移動至固定的抗原區(qū)域時，有足夠的金標(biāo)抗體與固定的抗原反應(yīng)，而被截留聚集在T線上，可通過肉眼觀察到紅棕色條帶，實驗結(jié)果為陰性。

本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明首次針對植物病毒構(gòu)建了雙重病毒的檢測試紙條，創(chuàng)新性很強，開發(fā)的CMV-PVY雙重病毒快速檢測試紙條利用膠體金免疫層析技術(shù)，結(jié)合了色譜層析和免疫反應(yīng)的原理，實現(xiàn)了快速、準(zhǔn)確地定性檢測病原的目的，可以在田間快速、大規(guī)模的檢測樣品，檢測結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。與ELISA方法相比，本發(fā)明的試紙條具有快速、靈敏、直觀、成本低廉、操作簡便、對人體無害、易于大量樣本的檢測等特點，實現(xiàn)一次取樣，兩種病毒同時診斷，讓煙農(nóng)操作方便，診斷及時準(zhǔn)確。

更重要的是，本發(fā)明的試紙條檢測的病毒的特異性很強，是專門針對廣東煙區(qū)的CMV、PVY的檢測。該試紙條采用的關(guān)鍵抗體是專門針對廣東煙區(qū)CMV、PVY的流行株系構(gòu)建得到，所制備的針對性的單克隆抗體靈敏度非常高，可以達(dá)到1g/100mL，對廣東煙區(qū)CMV、PVY兩種病毒的快速檢測具有重要的意義。

另外，本發(fā)明的可以同時實現(xiàn)兩種病毒的檢測，整個產(chǎn)品體積小、攜帶方便，不需要儀器設(shè)備，操作簡單。可現(xiàn)場檢測，在3～10min內(nèi)即可出結(jié)果；結(jié)果可由肉眼根據(jù)T線顏色的深淺進(jìn)行判斷。一次取樣，兩種病毒同時診斷，讓煙農(nóng)操作方便，診斷及時準(zhǔn)確。這種方法非常適合對大批量樣品進(jìn)行現(xiàn)場初篩，在實際生產(chǎn)中很有應(yīng)用價值，具有強大的推廣應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1為CP-C-GD連接到pET30a-GST載體的重組載體示意圖。

圖2為CP-C-GD蛋白小量表達(dá)檢測電泳圖；M：marker，1：目標(biāo)蛋白，2：未誘導(dǎo)對照。

圖3為CP-C-GD蛋白大量表達(dá)檢測電泳圖；M：marker，1：上清，2：沉淀。

圖4為CP-C-GD蛋白純化結(jié)果；M：marker，1：樣品稀釋100倍。

圖5為CP-P-GD連接到pET30a-GST載體的重組載體示意圖。

圖6為CP-P-GD蛋白小量表達(dá)檢測電泳圖；M：marker，1：目標(biāo)蛋白，2：未誘導(dǎo)對照。

圖7為CP-P-GD蛋白大量表達(dá)檢測電泳圖；M：marker，1：上清，2：沉淀。

圖8為CP-P-GD蛋白純化結(jié)果；M：marker，1：樣品稀釋100倍。

圖9為膠體金快速檢測試紙條的示意圖。

圖10為CMV-PVY雙重病毒膠體快速金檢測試紙條檢測效果；(左邊為陰性性樣本，右邊為陽性樣本)。

具體實施方式

以下結(jié)合說明書附圖和具體實施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但實施例并不對本發(fā)明做任何形式的限定。除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設(shè)備為本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)試劑、方法和設(shè)備。

除非特別說明，本發(fā)明所用試劑和材料均為市購。

實施例1廣東煙區(qū)CMV、PVY病毒株的分離

1、2012～2014年，從廣東省韶關(guān)市的南雄、始興、乳源、樂昌，清遠(yuǎn)市的連洲，梅州市的五華、蕉嶺、大埔和梅縣等9個地縣29個鎮(zhèn)，33個村的煙田里表現(xiàn)普通花葉病的煙草植株上進(jìn)行取樣。取樣點覆蓋廣東省的所有煙區(qū)。共72個樣品。將之分別進(jìn)行生物學(xué)和ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定)的分離、鑒定。

共分離得到24個CMV分離物，13個PVY分離物，都已得到ELISA檢測驗證。生物學(xué)鑒定結(jié)果表明：所采CMV、PVY分離物都屬于各自的普通株系。

2、分別對兩種病毒的全CP(coat protein))基因進(jìn)行擴增。將PCR產(chǎn)物膠回收后與pMD-18T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli DH5α。挑取陽性克隆擴大繁殖培養(yǎng)，堿裂解法抽提質(zhì)粒后，進(jìn)行雙酶切鑒定，得到含有重組質(zhì)粒的陽性轉(zhuǎn)化子。將兩種陽性轉(zhuǎn)化子送北京奧科生物技術(shù)有限公司測序。

測序得到的CMV CP基因為654bp(序列如SEQ ID NO.2所示)、PVY CP基因為796bp(序列如SEQ ID NO.3所示)，將之分別命名為CP-C-GD、CP-P-GD。

進(jìn)入NCBI的數(shù)據(jù)庫，用Blast工具將CP-C-GD、CP-P-GD兩個序列分別與數(shù)據(jù)庫里的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對分析。

3、分析結(jié)果顯示：CP-C-GD序列與其他報道的CMV CP基因的序列的相似性為69.5％～97％。CP-P-GD序列與其他報道的PVY CP基因的序列的相似性為80.5％～95％。這說明本研究獲得的在廣東煙區(qū)占主要優(yōu)勢地位的CMV、PVY分離物與普通的CMV、PVY株系存在一定差異。

實施例2制備兩種CP基因原核表達(dá)特異蛋白

將CP-C-GD、CP-P-GD分別構(gòu)建到pET30a-GST載體上，轉(zhuǎn)化BL21菌株，進(jìn)行原核表達(dá)，分別純化表達(dá)蛋白。

1、制備CP-C-GD原核表達(dá)蛋白，相關(guān)信息匯總?cè)缦卤?所示。

表1

具體方法如下。

(1)目的基因序列：根據(jù)大腸桿菌密碼子優(yōu)化后序列，兩端加酶切位點EcoR I和Xho I。合成目的基因到pUC57載體。

(2)通過酶切、連接，將目的基因連接到pET30a-GST載體，構(gòu)建后的重組載體示意圖如附圖1所示。

基因片段酶切：43μl重組質(zhì)粒，1μl EcoR I，1μl Xho I，5μl 10×Buffer，37℃過夜反應(yīng)。(瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，BPI)。

載體酶切：43μl載體(pET30a-GST)質(zhì)粒，1μl EcoR I，1μl Xho I，5μl10×Buffer，37℃過夜反應(yīng)。(瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，BPI)。

連接：1μl載體酶切片段，3μl基因酶切片段，1μl連接酶(BPI)，5μl2×Rapid Buffer，混勻，室溫反應(yīng)30min。

(3)將重組載體轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞：

1)取出-80℃保存的100μl感受態(tài)細(xì)胞(BL21)，放在冰上緩慢解凍；

2)將感受態(tài)細(xì)胞加入1μl重組質(zhì)粒的管中，混勻，冰上放置30min；

3)42℃熱激90s；

4)冰浴2min后，加入800μl無抗性的LB培養(yǎng)基；

5)37℃培養(yǎng)45min；

6)5000rpm離心3min，棄大部分上清，留約100-150μl，重懸菌體，選擇有相應(yīng)抗性的LB平板，涂板；

7)晾干，于37℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)過夜。然后測序驗證正確。

(4)小量表達(dá)檢測：

1)從轉(zhuǎn)化的平板挑單克隆到1.5ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃，200rpm培養(yǎng)；

2)培養(yǎng)至OD＝0.6，IPTG(0.5mM)誘導(dǎo)，37℃，200rpm培養(yǎng)2h；

3)取1ml誘導(dǎo)的菌液，12000rpm，離心1min，棄上清，沉淀用50-100μl10mM Tris-HCl(pH8.0)溶液吹散(加入緩沖液的量視菌體量而定)；

4)加入與緩沖液等體積的2×loading buffer，100℃煮5min，電泳檢測(15％SDS-PAGE)。

結(jié)果如附圖2所示，有正確表達(dá)條帶。

(5)大量表達(dá)：

1)挑選驗證正確的菌株，接5～10μl活化的菌液到5ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃，200rpm，培養(yǎng)；

2)將培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)接到500mL LB液體培養(yǎng)基混合，37℃，200rpm，培養(yǎng)至OD＝0.6，IPTG(0.5mM)誘導(dǎo)4h；

3)大量收菌：用400ml大離心筒，6000rpm，離心5min，棄上清；

4)超聲破菌：沉淀用25ml 10mM Tris-HCl(pH 8.0)溶液吹散，超聲；

5)電泳確定表達(dá)形式：取100μl超聲(500W,90次，每次3s，間隔6s)后的菌懸液，12000rpm，離心10min，取50μl上清至另一EP管，上清去除干凈后，沉淀用50μl 10mM Tris-HCl(pH 8.0)溶液吹散，加入50μl 2×loading buffer，100℃煮5min，電泳檢測(15％SDS-PAGE)。

結(jié)果如附圖3所示，蛋白有表達(dá)，主要表達(dá)在沉淀中。

(6)蛋白質(zhì)純化(洗包涵體)：

1)20～30ml 10mM Tris-HCl(pH8.0)溶液重懸超聲離心得到的沉淀，靜置10min；

2)12000rpm，離心10min，上清轉(zhuǎn)入另一管中保存；

3)20～30ml 10mM Tris-HCl(pH8.0)溶液重懸沉淀，靜置10min；

4)12000rpm，離心10min，棄上清；

5)重復(fù)3)、4)一次；

6)先加入少量的10mM Tris-HCl(pH8.0)溶液重懸沉淀，再加5～10ml含8M尿素的10mM Tris-HCl(pH8.0)溶液溶解蛋白；

7)12000rpm，離心10min，收集上清，取50μl電泳(15％SDS-PAGE)。

結(jié)果如附圖4所示，純化得到目的蛋白CP-T-GD。

2、制備CP-P-GD原核表達(dá)蛋白，相關(guān)信息匯總?cè)缦卤?所示。

表2

具體方法同上述CP-T-GD蛋白制備。

構(gòu)建后的重組載體示意圖如附圖5所示。

蛋白小量表達(dá)檢測如附圖6所示，有正確表達(dá)條帶。

蛋白大量表達(dá)檢測如附圖7所示，蛋白有表達(dá)，主要表達(dá)在沉淀中。

蛋白純化結(jié)果如附圖8所示，純化得到目的蛋白CP-P-GD。

實施例3構(gòu)建表達(dá)CMV、PVY兩種病毒特異單抗的雜交瘤細(xì)胞株

利用實施例2得到的兩種CP基因原核表達(dá)特異蛋白，用相應(yīng)的表達(dá)蛋白免疫小鼠；進(jìn)行融合試驗，得到分別產(chǎn)生兩種病毒的特異單抗的陽性雜交瘤細(xì)胞株。

1、構(gòu)建表達(dá)CMV病毒特異單抗的雜交瘤細(xì)胞株，方法如表3所示。

表3

具體方法如下：

(1)免疫

1)用“CMV”，按60ug蛋白/只小鼠的量，皮下初次免疫4只SPF BALB/c雌性小鼠，編號為：1、2，3，4。

2)初免兩周后，皮下第一次加強免疫，免疫量為30ug蛋白/只。

3)第一次加強免疫兩周后，皮下第二次加強免疫，免疫量為30ug蛋白/只。

4)第二次加強免疫兩周后，皮下第三次加強免疫，免疫量為30ug蛋白/只。

5)第二次加強免疫一周后，眼眶取血，測血清效價。

(2)免疫效價檢測：

用“CMV”，2ug/ml，4℃包被過夜；2％牛奶，37℃封閉2h；血清從200倍開始2倍梯度稀釋，空白對照(blank)為PBS，陰性對照(negative)為陰性血清200倍稀釋。

表4免疫效價(效價為大于最大OD/2的最小OD讀數(shù)所對應(yīng)的稀釋度)

根據(jù)結(jié)果選取沖擊4號小鼠做細(xì)胞融合實驗。融合前，用免疫原“CMV”50ug，腹腔沖擊免疫4號小鼠。

(2)細(xì)胞融合

取小鼠脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞，采用PEG法進(jìn)行融合。融合完細(xì)胞用半固體培養(yǎng)基(含HAT)進(jìn)行篩選培養(yǎng)。

1)實驗器材：滅菌的手術(shù)器械(包括三把剪刀、三把鑷子、一個細(xì)胞篩、一個注射器的內(nèi)芯、一個平皿)，濕盒，2個500ml燒杯，2個50ml離心管，3個15ml離心管。

2)實驗試劑：IMDM培養(yǎng)基；IMDM完全培養(yǎng)基(含15％血清)；2.2％甲基纖維素：廠家：SIGMA，貨號：M0262-100G；新生牛血清10ml；PEG1500：廠家：Roche，貨號：78364；HAT：廠家：Sigma，貨號：H0262-10VL；HT：廠家：Sigma，貨號：H0137-10VL。

3)融合實驗步驟

a.將狀態(tài)良好的sp2/0細(xì)胞輕柔的從培養(yǎng)瓶壁上吹打下來，吸入到50ml離心管中。

b.小鼠摘眼球取血，然后拉頸處死，放入75％的酒精中浸泡5min。

c.在平皿中倒入少量無血清的IMDM，將細(xì)胞篩及注射器內(nèi)芯放入平皿中。用剪刀和鑷子取下小鼠的脾臟，放到細(xì)胞篩上。用注射器的內(nèi)芯輕輕地將脾充分碾碎，將碾好的細(xì)胞吸入到裝sp2/0的離心管中，離心1500rad/min，5min。

d.用剪刀和鑷子取下小鼠的胸腺，碾碎。將碾好的胸腺細(xì)胞到15ml離心管中，再加入1ml的HAT，放在孵箱中備用。

e.將離心好的細(xì)胞，倒掉上清，用無血清的IMDM將細(xì)胞小心輕柔地吹勻，離心(1500rad/min，5min)。

f.將離心好的細(xì)胞上清盡量倒掉。拍打離心管底充分懸浮細(xì)胞，將離心管放入37℃溫水中，在1分鐘內(nèi)緩慢加入1ml的PEG，加完后，在溫水中靜置1min。然后2min內(nèi)緩慢加入2ml的無血清的IMDM，接著2min內(nèi)緩慢加入8ml無血清的IMDM。離心1000rad/min，5min。

g.倒掉上清，加入10ml的血清，小心的將細(xì)胞吹勻，倒入前面準(zhǔn)備好的胸腺細(xì)胞。再加入25ml滅過菌的半固體培養(yǎng)基，充分混勻。然后均勻倒入30個細(xì)胞培養(yǎng)皿中。將細(xì)胞培養(yǎng)皿放入濕盒中，然后放入孵箱中培養(yǎng)。

(3)挑克隆

挑10板×93個細(xì)胞單克隆，培養(yǎng)于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(事先用胸腺細(xì)胞鋪板，100ul/孔)。

(4)單克隆細(xì)胞1篩

用“CMV”包板，對挑選的克隆采用ELISA方法，做第一次篩選，得到48株陽性雜交瘤細(xì)胞株。

1)實驗試劑：

包被液：碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液，pH9.6

PBS緩沖液pH7.4

封閉液：2％牛奶in PBS

洗液：PBS－T(0.05％吐溫，PBS)

顯色液:1％A液+10％B液(A液：1％TMB in DMSO；B液：0.1％H2O2in檸檬酸緩沖液)

終止液：2M硫酸

二抗：山羊抗小鼠IgG/HRP

2)實驗步驟

用包被液稀釋“CMV”，終濃度為2ug/ml，100ul/孔，4℃，過夜；后用洗液洗滌3次。

a.2％牛奶封閉液封閉，200ul/孔，37℃孵箱，2h；后用洗液洗滌3次。

b.加入一抗(細(xì)胞培養(yǎng)上清)、陰性對照(SP2/0培養(yǎng)上清)、空白對照(PBS)、陽性對照(陽性血清PBS 1000倍稀釋)，均為100ul/孔，37℃孵箱，1h；后用洗液洗滌3次。

c.加入PBS稀釋20000倍的二抗，100ul/孔，37℃孵箱，1h；取出后用洗液洗滌3次。

d.顯色，顯色液100ul/孔，顯色時間為5min左右。

e.每孔加入50ul終止液終止。

f.雙波長(450，630)測吸光值，記錄保存數(shù)據(jù)。包括對免疫蛋白篩選呈陽性的雜交瘤細(xì)胞株的數(shù)據(jù)、陽性對照讀數(shù)、空白對照讀數(shù)以及陰性對照讀數(shù)。

根據(jù)結(jié)果篩選得到對免疫蛋白篩選呈陽性的雜交瘤細(xì)胞株，共48株。

(5)單克隆細(xì)胞2篩

將48株陽性的細(xì)胞株，用“CMV”及標(biāo)簽蛋白再次包板，采用ELISA方法，做第二次篩選，得到24株陽性雜交瘤細(xì)胞株。

(6)將篩選出來的24株陽性細(xì)胞株進(jìn)行亞類鑒定，最后得到13株IgG類型的陽性雜交瘤細(xì)胞株。

1)實驗試劑

包被抗體：(Southern Biotech)

封閉液：2％BSA+3％蔗糖in PBS；

顯色液:0.2ml A液+10ul 30％H₂O₂in 10ml B液(A液：15mg/ml ABTS in H₂O；B液：檸檬酸緩沖液,pH4.0)

2)各型亞類二抗：(Southern Biotech)實驗步驟：

a.用100mM PBS(pH7.4)稀釋包被抗體至0.5ug/ml，每孔加0.1ml，4℃，過夜。

b.PBS-T洗2次，每孔加入200ul封閉液，370C孵育2h。

c.PBS-T洗3次；每孔加入100ul雜交瘤上清，370C孵育1h。

d.PBS-T洗3次；用封閉液1：10000(κ,λ)或1：20000(其它的)稀釋的HRP標(biāo)記的抗體0.1ml每孔，分別加入適當(dāng)?shù)目字校?70C孵育1h。

e.PBS-T洗3次；每孔加50ul底物溶液，10-20min內(nèi)于雙波長(450，630)測吸光值，記錄保存數(shù)據(jù)。

表5

最終得到13株產(chǎn)生CMV的特異單抗的雜交瘤細(xì)胞株，選取最好的一株培育保存，并命名為雜交瘤細(xì)胞株BALBc-15-27，于2016年6月30日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.12679，保藏地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號。

2、構(gòu)建表達(dá)PVY病毒特異單抗的雜交瘤細(xì)胞株，方法同上。

表6

最終得到19株產(chǎn)生PVY的特異單抗的雜交瘤細(xì)胞株，選取最好的一株培育保存，并命名為BALBc-15-8，于2016年6月30日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.12677，保藏地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號。

實施例4制備CMV-PVY雙重病毒膠體金快速檢測試紙條

1、實驗材料

(1)膠體金顆粒：枸櫞酸鈉還原法制備(30nm)

(2)CMV、PVY兩種病毒的特異性抗體

將實施例3的兩種陽性雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行培養(yǎng)表達(dá)，進(jìn)行Protein A過柱純化，得到兩種病毒的特異單克隆抗體。

(3)二抗：Goat-anti-Rabbit Ig G

特異抗體膠體金標(biāo)記的pH為8.2，膠體金標(biāo)記二抗的pH為9.0。

金標(biāo)抗體用BSA做穩(wěn)定劑。

2、儀器設(shè)備：

JY-EQ03連續(xù)式劃膜儀，JY-EQ02噴金機，JY-EQ01斬切式切刀，I JY-EQ05壓殼機。

3、耗材：

JY-D101DB-6底板，JY-X115H5072吸水紙，JY-BX101金標(biāo)墊，JY-JZ112fusion 3樣品墊，JY-C111A-11塑料卡。

4、試紙條的組裝

(1)如附圖9所示，將背襯(背襯)、樣品墊、吸水墊(吸水濾紙)、硝酸纖維素膜(NC膜)、金標(biāo)墊(膠體金墊)粘在一起，利用切條機將其切成4.5mm寬的試紙條，于4℃干燥保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)試紙條組裝條件：

試紙條的組裝要求在室溫恒定干燥的環(huán)境下，濕度大或溫度過高會影響玻璃纖維、NC膜的性質(zhì)和二抗、包被抗體、金標(biāo)抗體的活性，進(jìn)而影響試紙條的層析速度及顯色反應(yīng)。各部分組裝時，要粘貼緊密不要劃到NC膜，否則會影響出線效果。本試紙條在室溫25℃、濕度低于40％條件下進(jìn)行組裝。

5、本發(fā)明的CMV-PVY雙重病毒檢測試紙條的結(jié)構(gòu)描述如下：

由樣品墊、膠體金墊、NC膜、吸水濾紙和背襯組成；所述樣品墊、膠體金墊和NC膜按照從左至右、從上至下的順序依次結(jié)合在背襯同一面上，膠體金墊和NC膜的端部重疊；所述吸水濾紙結(jié)合在NC膜的另一端；所述膠體金墊上包被有膠體金標(biāo)記的CMV、PVY特異抗體，所述NC膜上設(shè)置有檢測線(T線)和控制線(C線)，且檢測線(T線)位于膠體金墊和控制線(C線)之間的位置；檢測線(T線)上包被有兩種病毒的特異抗原；；所述膠體金墊上的金標(biāo)抗體可以與檢測線上的抗原結(jié)合反應(yīng)并顯色；控制線(C線)上包被有膠體金標(biāo)記的二抗。

該試紙條的檢測基本原理如下：

膠體金標(biāo)記的CMV、PVY特異抗體吸附在結(jié)合墊(即膠體金墊)上，兩種病毒的特異抗原以條帶狀固定在硝酸纖維膜的測試線(T線)處上，膠體金標(biāo)記的二抗固定在硝酸纖維膜的控制線(C線)處。當(dāng)待檢樣本加到試紙條一端的樣本墊上后，通過毛細(xì)作用向前移動，溶解結(jié)合墊上的膠體金標(biāo)記特異試劑后相互反應(yīng)，再移動至固定的抗原區(qū)域時，待檢物與金標(biāo)記抗體的結(jié)合物又與之發(fā)生特異性結(jié)合。

當(dāng)待測樣本含有CMV、PVY當(dāng)中的一種或兩種時，它與溶解在樣本墊上的膠體金標(biāo)記的相應(yīng)病毒的特異抗體相互反應(yīng)；再移動至固定的抗原區(qū)域時，已經(jīng)沒有足夠的金標(biāo)抗體與固定的抗原反應(yīng)，T線處沒有紅棕色線條出現(xiàn)，實驗結(jié)果為陽性。游離的金標(biāo)抗體或者金標(biāo)抗體復(fù)合物流經(jīng)C處時，與該處的二抗結(jié)合出現(xiàn)紅棕色質(zhì)控帶。

當(dāng)待測樣本沒有CMV、PVY當(dāng)中的任意一種病毒時，它與溶解在結(jié)合墊上的膠體金標(biāo)記抗體不發(fā)生反應(yīng)；再移動至固定的抗原區(qū)域時，有足夠的金標(biāo)抗體與固定的抗原反應(yīng)，而被截留聚集在T線上，可通過肉眼觀察到紅棕色條帶，實驗結(jié)果為陰性。

實施例5膠體金快速檢測試紙條的樣品檢測

1、取感染了CMV、PVY兩種病毒的煙草，以及健康煙草的葉片作為實驗材料，各0.2g，加PBS緩沖液(pH8.0，0.01M)，進(jìn)行研磨，不要用自來水稀釋葉子。

各取50uL研磨液加到制備好的試紙條樣品墊上，五分鐘后判讀結(jié)果。

2、結(jié)果如附圖10所示。感病煙草樣本的試紙條C處質(zhì)檢帶出現(xiàn)明顯的紅棕色條帶，實驗結(jié)果為陽性。

健康煙草樣本的試紙條C處質(zhì)檢以及T處檢測帶帶出現(xiàn)明顯的3條紅棕色條帶，實驗結(jié)果為陰性。

結(jié)果顯示，本發(fā)明的CMV-PVY雙重病毒膠體金快速檢測試紙條對CMV、PVY兩種病毒的檢測效果良好。

實施例6膠體金快速檢測試紙條的靈敏度的測試

1、將0.1g煙草病樣用0.01mol/L的PBS稀釋6個系列濃度，與樣品處理液等體積混合后，終濃度為10、1、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4mg/mL，以PBS與樣品處理液等體積混合為陰性對照，測定試紙條靈敏度。

2、結(jié)果顯示，當(dāng)煙草病樣的濃度為10^-3mg/mL時，試紙條的檢測條帶模糊不清。因此，本發(fā)明試紙條的檢測靈敏度可達(dá)到10^-2mg/mL。