本發(fā)明涉及單克隆抗體細(xì)胞培養(yǎng)工藝領(lǐng)域，具體內(nèi)容涉及生產(chǎn)抗PD-1單克隆抗體的細(xì)胞培養(yǎng)基及其優(yōu)化方法。

背景技術(shù)：

程序性死亡受體1(Programmed Death-1)，也稱之PD-1和CD279，最初是在1992年從凋亡的小鼠T細(xì)胞雜交瘤2B4.11克隆得到并命名。PD-1是免疫球蛋白超家族CD28家族成員，相對分子量為50～55KD的Ⅰ型跨膜糖蛋白。PD-1是T細(xì)胞免疫抑制受體，在激活的T細(xì)胞和B細(xì)胞中高表達(dá)，在腫瘤細(xì)胞中可限制T細(xì)胞效應(yīng)子的功能，同時在調(diào)控腫瘤免疫逃逸以及自身免疫反應(yīng)方面起著關(guān)鍵性的作用。

PD-1作為受體，它的配體有兩個PD-L1(B7-H1)和PD-L2(B7-DC)。PD-1與PD-L1結(jié)合可以激活TCR和BCR，促使PD-1的ITSM結(jié)構(gòu)域中的Tyr磷酸化，進(jìn)而使SH2結(jié)構(gòu)域(包括SHP-2和SHP-1)結(jié)合到PD-1的胞槳區(qū)，引起CD28調(diào)控的PI3K去磷酸化，抑制下游AKT/ERK等通路的活化，導(dǎo)致T細(xì)胞活化所需的基因及細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄和翻譯被抑制。PD-1同時也可以抑制其他信號分子的磷酸化，比如CD3，ZAP70和PCK。PD-1/PD-L1信號通路的免疫抑制作用對多種免疫失調(diào)性疾病的發(fā)生及發(fā)展具有重要作用，因此人源化抗PD-1單克隆抗體是目前最為熱門的單克隆抗體。

中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞廣泛應(yīng)用與生物制藥領(lǐng)域，生物制藥采用的細(xì)胞培養(yǎng)方式為批次補(bǔ)料培養(yǎng)，即將一定體積的基礎(chǔ)培養(yǎng)基裝入細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器中，將細(xì)胞接種到培養(yǎng)反應(yīng)器中后進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中隨著細(xì)胞的不斷生長，所需的營養(yǎng)物質(zhì)不斷消耗，需要不斷的補(bǔ)加富含營養(yǎng)物質(zhì)的補(bǔ)料培養(yǎng)基來維持細(xì)胞的營養(yǎng)需求，使細(xì)胞分泌更多的抗體。不同細(xì)胞培養(yǎng)基經(jīng)過篩選可以表達(dá)高產(chǎn)量和高質(zhì)量的抗體。優(yōu)化培養(yǎng)基的方法有單因素篩選法，正交實(shí)驗(yàn)法、響應(yīng)面分析法、均勻設(shè)計(jì)法、全因子實(shí)驗(yàn)法、部分因子設(shè)計(jì)法、Plackett-Burman設(shè)計(jì)、中心組合法及Box-Behnken設(shè)計(jì)等。氨基酸分析技術(shù)通常應(yīng)用于蛋白質(zhì)和多肽中的氨基酸分析、體液中的氨基酸分析、食品中的氨基酸分析、農(nóng)作物中的氨基酸分析以及氨基酸的手性分離等方面。在CHO細(xì)胞用于單克隆抗體表達(dá)方面，尚未有結(jié)合氨基酸分析進(jìn)行培養(yǎng)基優(yōu)化的相關(guān)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了生產(chǎn)抗PD-1單克隆抗體的細(xì)胞培養(yǎng)基及其選擇優(yōu)化方法，采用氨基酸分析技術(shù)，確定影響細(xì)胞生長和抗體表達(dá)的關(guān)鍵氨基酸，以此為基礎(chǔ)確定培養(yǎng)基種類并對培養(yǎng)基進(jìn)行氨基酸種類和添加量的優(yōu)化，使細(xì)胞生長、維持及抗體表達(dá)效果最優(yōu)化。

本發(fā)明提供的生產(chǎn)抗PD-1單克隆抗體的細(xì)胞培養(yǎng)基包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和補(bǔ)料培養(yǎng)基，其特征在于所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基含有23.0g/L～28.0g/L Hycell CHO Medium培養(yǎng)基，0.1mmol/L～1.0mmol/L L-谷氨酰胺，0.5mmol/L～1.5mmol/L L-天冬酰胺；所述補(bǔ)料培養(yǎng)基含有98.0g/L～103.0g/L OPM CHOCD Feed 1培養(yǎng)基，35.0mmol/L～40.0mmol/L L-組氨酸，70.0mmol/L～80.0mmol/L L-酪氨酸，55.0mmol/L～65.0mmol/L L-絲氨酸，40.0mmol/L～50.0mmol/L L-谷氨酰胺，15.0mmol/L～20.0mmol/L L-半胱氨酸。

優(yōu)選的，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中含有25.4g/L Hycell CHO Medium培養(yǎng)基，0.76mmol/L L-谷氨酰胺，1.04mmol/L L-天冬酰胺；所述補(bǔ)料培養(yǎng)基中含有101.25g/L OPM CHOCD Feed 1培養(yǎng)基，38.7mmol/L L-組氨酸，75.0mmol/L L-酪氨酸，64.0mmol/L L-絲氨酸，49.2mmol/L L-谷氨酰胺，18.7mmol/L L-半胱氨酸。

本發(fā)明細(xì)胞株采用二氫葉酸還原酶(DHFR)缺陷型系統(tǒng)表達(dá)抗PD-1單克隆抗體的基因重組CHO細(xì)胞。

本發(fā)明所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基和補(bǔ)料培養(yǎng)基注射用水溶解，pH為7.2±0.2，0.22μm濾膜過濾除菌。

本發(fā)明還提供了一種抗PD-1單克隆抗體生產(chǎn)用細(xì)胞培養(yǎng)基的優(yōu)化方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：

步驟1)：將表達(dá)抗PD-1單克隆抗體的細(xì)胞株在多種基礎(chǔ)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞生長狀況從20種基礎(chǔ)培養(yǎng)基中篩選得到抗PD-1單克隆抗體細(xì)胞培養(yǎng)最優(yōu)的2～4種基礎(chǔ)培養(yǎng)基；

步驟2)：通過檢測步驟1)篩選出的2～4種基礎(chǔ)培養(yǎng)基細(xì)胞液中氨基酸的消耗情況，確定影響細(xì)胞生長的關(guān)鍵氨基酸種類；

步驟3)：根據(jù)在步驟1)篩選出的最優(yōu)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加不同濃度的氨基酸實(shí)驗(yàn)確定基礎(chǔ)培養(yǎng)基中氨基酸的添加濃度及抗PD-1單克隆抗體的基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方；

步驟4)：將表達(dá)PD-1單克隆抗體的細(xì)胞株在選用步驟3)確定的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中進(jìn)行批次補(bǔ)料培養(yǎng)，根據(jù)抗體表達(dá)量狀況從10種補(bǔ)料培養(yǎng)基中篩選得到抗PD-1單克隆抗體表達(dá)較優(yōu)的2～4種補(bǔ)料培養(yǎng)基；

步驟5)：通過檢測步驟4)篩選出的2～4種補(bǔ)料培養(yǎng)基細(xì)胞液中氨基酸的消耗情況，確定影響抗體表達(dá)的關(guān)鍵氨基酸種類；

步驟6)：根據(jù)在步驟4)篩選出的最優(yōu)的補(bǔ)料培養(yǎng)基中添加不同濃度的氨基酸實(shí)驗(yàn)確定補(bǔ)料培養(yǎng)基中氨基酸的添加濃度及抗PD-1單克隆抗體的補(bǔ)料培養(yǎng)基配方。

本發(fā)明所選用于篩選實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基選自Hyclone公司的Hycell CHO Medium培養(yǎng)基、CDM4CHO培養(yǎng)基以及CDM4PERMAB培養(yǎng)基等，Sigma公司的Ex-cell CHO CD培養(yǎng)基，還有Millipore、上海奧普邁生物科技有限公司等公司的共20種基礎(chǔ)培養(yǎng)基(見表1)；補(bǔ)料培養(yǎng)基選自Hyclone公司的Cell Boost 6培養(yǎng)基、Millipore公司的Cellwento Feed-200等共10種補(bǔ)料培養(yǎng)基(見表2)。

表1 20種基礎(chǔ)培養(yǎng)基信息

表2 10種補(bǔ)料培養(yǎng)基信息

本發(fā)明所述氨基酸分析方法采用Waters公司的UPLC H-class-PDA檢測，可以準(zhǔn)確分離27種氨基酸，進(jìn)行定量分析。具體的氨基酸分析篩選培養(yǎng)基的方法見實(shí)施例。

本發(fā)明提供生產(chǎn)抗PD-1單克隆抗體的細(xì)胞培養(yǎng)基及其選擇優(yōu)化方法，采用氨基酸分析技術(shù)，通過對抗PD-1單克隆抗體的生產(chǎn)用基因重組CHO細(xì)胞在多種培養(yǎng)基中的生長情況進(jìn)行分析，確定影響細(xì)胞生長和抗體表達(dá)的關(guān)鍵氨基酸，以此為基礎(chǔ)確定培養(yǎng)基種類并對培養(yǎng)基進(jìn)行氨基酸種類和添加量的優(yōu)化，優(yōu)化后的培養(yǎng)基能使抗PD-1單克隆抗體細(xì)胞生長、維持及抗體表達(dá)效果最優(yōu)化。結(jié)合氨基酸分析技術(shù)進(jìn)行培養(yǎng)基的優(yōu)化，可以更加精準(zhǔn)的分析細(xì)胞營養(yǎng)代謝情況，根據(jù)培養(yǎng)基中的氨基酸消耗速率來進(jìn)行補(bǔ)加適量的氨基酸，在保證細(xì)胞生長狀況良好的前提下，提高抗體表達(dá)量，為放大生產(chǎn)提供成熟的工藝步驟，能夠減少資源和能源消耗，大大縮減生產(chǎn)成本。

下面結(jié)合具體實(shí)施方式的實(shí)施例及說明書附圖對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。

說明書附圖

附圖1 20種基礎(chǔ)培養(yǎng)基活細(xì)胞密度變化曲線；

附圖2 20種基礎(chǔ)培養(yǎng)基細(xì)胞活率變化曲線；

附圖3 MH15基礎(chǔ)培養(yǎng)基細(xì)胞培養(yǎng)液中的氨基酸濃度；

附圖4 MA06基礎(chǔ)培養(yǎng)基細(xì)胞培養(yǎng)液中的氨基酸濃度；

附圖5 MG03基礎(chǔ)培養(yǎng)基細(xì)胞培養(yǎng)液中的氨基酸濃度；

附圖6添加氨基酸后MH15培養(yǎng)基進(jìn)行批次培養(yǎng)的細(xì)胞生長曲線；

附圖7 10種補(bǔ)料培養(yǎng)基進(jìn)行批次補(bǔ)料培養(yǎng)的抗體表達(dá)量變化曲線；

附圖8 FA04培養(yǎng)基細(xì)胞培養(yǎng)液中的氨基酸消耗數(shù)據(jù)；

附圖9 FM09培養(yǎng)基細(xì)胞培養(yǎng)液中的氨基酸消耗數(shù)據(jù)；

附圖10 FH02培養(yǎng)基細(xì)胞培養(yǎng)液中的氨基酸消耗數(shù)據(jù)；

附圖11添加氨基酸后的FA04培養(yǎng)基批次補(bǔ)料培養(yǎng)的抗體表達(dá)量變化曲線；

附圖12 FA04添加氨基酸的驗(yàn)證抗體表達(dá)量變化曲線；

附圖13未優(yōu)化與優(yōu)化基礎(chǔ)和補(bǔ)料培養(yǎng)基的細(xì)胞生長變化曲線；

附圖14未優(yōu)化與優(yōu)化基礎(chǔ)和補(bǔ)料培養(yǎng)基的抗體表達(dá)量變化曲線；

附圖15未優(yōu)化與優(yōu)化培養(yǎng)基中細(xì)胞表達(dá)的抗PD-1單克隆抗體生物學(xué)活性數(shù)據(jù)。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明涉及多個術(shù)語，使用這些術(shù)語并不限制本發(fā)明的范圍。

如本文所用，術(shù)語“細(xì)胞培養(yǎng)液”包括所有的細(xì)胞以及細(xì)胞碎片。

如本文所用，術(shù)語“批次培養(yǎng)”一般是指細(xì)胞培養(yǎng)期間不補(bǔ)加培養(yǎng)基，僅補(bǔ)加適量濃度的葡萄糖。

如本文所用，術(shù)語“分批補(bǔ)料式培養(yǎng)”一般是指在細(xì)胞培養(yǎng)期間，根據(jù)細(xì)胞生長進(jìn)行補(bǔ)加培養(yǎng)基、葡萄糖及氨基酸等。

如本文所用，術(shù)語“活細(xì)胞密度”與“VCD”一般是指每毫升細(xì)胞液中所包含的活細(xì)胞總數(shù)，使用單位“cells/mL”表示。

如本文所用，術(shù)語“細(xì)胞活率”與“VIA”一般是指每毫升細(xì)胞液中活細(xì)胞總數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的比例，使用單位“％”表示。

如本文所用，術(shù)語“抗體表達(dá)量”與“Titer”一般是指每毫升細(xì)胞液中細(xì)胞所產(chǎn)生的抗體總量，使用單位“mg/mL”或“g/L”表示。

如本文所用，術(shù)語“最高活細(xì)胞密度”與“PVCD”一般是指細(xì)胞批培養(yǎng)和分批補(bǔ)料式培養(yǎng)過程中，細(xì)胞達(dá)到的最大活細(xì)胞總數(shù)，使用單位“cells/mL”表示。

實(shí)施例1基礎(chǔ)培養(yǎng)基的優(yōu)化

將20種基礎(chǔ)培養(yǎng)基(見表1)對采用DHFR缺陷型系統(tǒng)表達(dá)抗PD-1單克隆抗體的基因重組CHO細(xì)胞進(jìn)行125mL搖瓶批次培養(yǎng)(批次培養(yǎng)指細(xì)胞接種至基礎(chǔ)培養(yǎng)基后，只添加葡萄糖滿足碳源的需求，不補(bǔ)加補(bǔ)料培養(yǎng)基，直至細(xì)胞進(jìn)入衰亡期)，培養(yǎng)條件為：接種密度5×10⁵cells/mL，培養(yǎng)體積為30mL，搖床轉(zhuǎn)速為110rpm，培養(yǎng)溫度為37℃，CO₂濃度為5％，在培養(yǎng)第0、3、5天至培養(yǎng)結(jié)束(細(xì)胞活率低于70％)取樣檢測活細(xì)胞密度(VCD)和細(xì)胞活率(VIA)，20種基礎(chǔ)培養(yǎng)基活細(xì)胞密度和細(xì)胞活率變化曲線見附圖1和附圖2。

如圖1和2所示，20種基礎(chǔ)培養(yǎng)基中最高活細(xì)胞密度(PVCD)排在前三位的依次為：MH15(Hycell)，MA06(OPM CHOCD07)和MG03(CD FortiCHO)；三種基礎(chǔ)培養(yǎng)基的PVCD分別為1.64×10⁷cells/mL，1.55×10⁷cells/mL和1.50×10⁷cells/mL，確認(rèn)MH15是20種基礎(chǔ)培養(yǎng)基中細(xì)胞生長最優(yōu)的培養(yǎng)基；

在20種基礎(chǔ)培養(yǎng)基搖瓶批次培養(yǎng)期間，分別在第0天(D0)，第3天(D3)和培養(yǎng)結(jié)束時留樣細(xì)胞培養(yǎng)液1mL，取PVCD最高的三種基礎(chǔ)培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行上清氨基酸分析，結(jié)果如圖3-5所示?？梢娫诩?xì)胞生長較優(yōu)的三種基礎(chǔ)培養(yǎng)基中氨基酸濃度變化趨勢較大為L-天冬酰胺(Asn)和L-谷氨酰胺(Gln)：Asn在MH15、MA06和MG03中的氨基酸濃度從D0至D3分別減少了2.05mmol/L、2.35mmol/L和2.65mmol/L，Gln在MH15、MA06和MG03中的氨基酸濃度從D0至D3分別減少了1.60mmol/L、1.92mmol/L和2.60mmol/L，其他氨基酸濃度變化不大，因此可以確定Asn和Gln為影響細(xì)胞生長的關(guān)鍵氨基酸。

進(jìn)一步在最優(yōu)基礎(chǔ)培養(yǎng)基MH15基礎(chǔ)上進(jìn)行氨基酸濃度梯度實(shí)驗(yàn)，添加不同濃度的Asn和Gln進(jìn)行搖瓶批次培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)：

實(shí)驗(yàn)條件：根據(jù)Asn和Gln在MH15中D0至D3的消耗情況，進(jìn)行添加不同氨基酸濃度的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，采用DOE(Design of Experiment)設(shè)計(jì)兩因子兩水平試驗(yàn)，在已含有4.96mmol/L Asn和3.24mmol/L Gln的MH15基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，分別補(bǔ)加Asn 1.04mmol/L和3.04mmol/L，至終濃度為：6mmol/L和8mmol/L，補(bǔ)加Gln 0.76mmol/L和2.76mmol/L，至終濃度為：4mmol/L和6mmol/L，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案如表3。

表3 MH15中添加不同氨基酸濃度實(shí)驗(yàn)方案

細(xì)胞培養(yǎng)條件：接種密度為5×10⁵cells/mL，培養(yǎng)體積為30mL，培養(yǎng)轉(zhuǎn)速為110rpm，培養(yǎng)溫度為37℃，CO₂濃度為5％，培養(yǎng)第0天、3天、5天至培養(yǎng)結(jié)束取樣檢測VCD和VIA。

MH15添加不同氨基酸后的細(xì)胞生長狀況如圖6，可見添加Asn濃度為1.04mmol/L的和添加Gln濃度為0.76mmol/L的6#試驗(yàn)組細(xì)胞生長狀況最佳，在第7天達(dá)到最高活細(xì)胞密度，PVCD為1.82×10⁷cells/mL，且活率維持也較好，在第10天培養(yǎng)結(jié)束時，仍有68.3％，因此可以確定以MH15為基礎(chǔ)培養(yǎng)基時，培養(yǎng)基中添加Asn的最佳濃度為1.04mmol/L，Gln的最佳添加濃度為0.76mmol/L。

實(shí)施例2補(bǔ)料培養(yǎng)基的優(yōu)化

使用實(shí)施例1確定的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，10種補(bǔ)料培養(yǎng)基(見表2)進(jìn)行125mL搖瓶批次補(bǔ)料培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：接種密度8×10⁵cells/mL，培養(yǎng)體積30mL，培養(yǎng)轉(zhuǎn)速110rpm，培養(yǎng)起始溫度37℃，在培養(yǎng)至第5天時降溫為33℃，CO₂濃度5％，分別在第3天(D3)、5天(D5)、7天(D7)、9天(D9)、11天(D11)補(bǔ)加起始培養(yǎng)體積6％的補(bǔ)料培養(yǎng)基，篩選補(bǔ)料培養(yǎng)基的首要參考標(biāo)準(zhǔn)是抗PD-1單克隆抗體的表達(dá)量，所以在培養(yǎng)結(jié)束時取樣檢測抗體表達(dá)量(Titer)，10種補(bǔ)料培養(yǎng)基抗體表達(dá)狀況見圖7。

如圖7所示，10種補(bǔ)料培養(yǎng)基中抗體表達(dá)量排在前三位的依次為：FA04(OPM CHOCD Feed1)，F(xiàn)H02(Cell Boost 6)和FM09(Cellvento Feed-210)；三種補(bǔ)料中抗體表達(dá)量分別為3.03g/L、2.87g/L和2.62g/L。確認(rèn)FA04是10種補(bǔ)料培養(yǎng)基中利于PD-1單克隆抗體表達(dá)的最優(yōu)補(bǔ)料培養(yǎng)基；

在10種補(bǔ)料培養(yǎng)基進(jìn)行搖瓶批次補(bǔ)料培養(yǎng)期間，分別在第3、5、7、9、11天補(bǔ)料前后各留取細(xì)胞培養(yǎng)液1mL；取表達(dá)量最高的三種補(bǔ)料培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行上清氨基酸分析，結(jié)果如圖8-10所示?？梢娫谌N補(bǔ)料培養(yǎng)基中都有一些氨基酸在細(xì)胞生長后期會累積，如L-異亮氨酸(Ile)、L-丙氨酸(Ala)和L-纈氨酸(Val)等，有些氨基酸在前期消耗較少，隨著細(xì)胞密度增加，后期氨基酸消耗量也持續(xù)增加，導(dǎo)致補(bǔ)料中部分氨基酸消耗殆盡，不足以供給細(xì)胞繼續(xù)生長及抗體表達(dá)所需。根據(jù)這些氨基酸的消耗情況，確定影響抗PD-1單克隆抗體抗體表達(dá)的關(guān)鍵氨基酸為L-組氨酸(His)、L-酪氨酸(Tyr)、L-絲氨酸(Ser)、L-谷氨酰胺(Gln)和L-半胱氨酸(Cys)這五種。

進(jìn)一步在最優(yōu)補(bǔ)料培養(yǎng)基FA04基礎(chǔ)上進(jìn)行氨基酸濃度梯度實(shí)驗(yàn)，添加不同濃度五種氨基酸進(jìn)行搖瓶批次補(bǔ)料培養(yǎng)試驗(yàn)：

實(shí)驗(yàn)條件：根據(jù)6％起始培養(yǎng)體積補(bǔ)料(計(jì)算公式如公式1)后細(xì)胞液中His、Tyr、Ser、Gln和Cys在FA04中的消耗情況，進(jìn)行添加不同氨基酸濃度的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，采用DOE設(shè)計(jì)五因子兩水平試驗(yàn)，在已含有25.0mmol/L His、50.0mmol/L Tyr、42.0mmol/L Ser、50.0mmol/L Gln和28.0mmol/L Cys的FA04補(bǔ)料培養(yǎng)基中，分別添加His 25.0mmol/L和41.7mmol/L，Tyr 33.3mmol/L和83.3mmol/L，Ser 41.7mmol/L和66.7mmol/L，Gln 16.7mmol/L和50.0mmol/L，Cys 22.0mmol/L和55.3mmol/L，使培養(yǎng)基中各氨基酸終濃度分別為：His 50.0mmol/L和66.7mmol/L，Tyr 83.3mmol/L和133.3mmol/L，Ser 83.7mmol/L和108.7mmol/L，Gln 66.7mmol/L和100.0mmol/L，Cys 50.0mmol/L和83.3mmol/L，具體的實(shí)驗(yàn)方案如表4。

公式1：

例如：FA04中的His濃度為25.0mmol/L，則補(bǔ)料后培養(yǎng)液中的His濃度為1.5mmol/L；如果要求補(bǔ)料后培養(yǎng)液中的His濃度為2.5mmol/L，則FA04中需要補(bǔ)加的His濃度為41.7mmol/L。

表4 FA04中添加不同氨基酸濃度的實(shí)驗(yàn)方案

細(xì)胞培養(yǎng)條件：接種密度8×10⁵cells/mL，培養(yǎng)體積30mL，培養(yǎng)轉(zhuǎn)速110rpm，CO₂濃度為5％，培養(yǎng)起始溫度為37℃，在培養(yǎng)第5天降溫至33℃繼續(xù)培養(yǎng)，分別在第3天、5天、7天、9天、11天補(bǔ)加起始培養(yǎng)體積6％的補(bǔ)料培養(yǎng)基，在培養(yǎng)結(jié)束時取樣檢測抗體表達(dá)量。

FA04添加不同種類及濃度氨基酸后的抗體表達(dá)量情況如圖11所示，直觀分析抗體表達(dá)量最高為15#試驗(yàn)組，表達(dá)量為3.65g/L，經(jīng)過DOE結(jié)果分析預(yù)測出FA04中各氨基酸最優(yōu)添加濃度為His：38.7mmol/L，Tyr：75.0mmol/L，Ser：64.0mmol/L，Gln：49.2mmol/L，Cys：18.7mmol/L，最高表達(dá)量預(yù)測可達(dá)3.89g/L。在DOE結(jié)果預(yù)測最優(yōu)氨基酸組合基礎(chǔ)上，結(jié)合DoE實(shí)驗(yàn)結(jié)果較好的前三組以及未添加氨基酸的補(bǔ)料培養(yǎng)基進(jìn)行了一批驗(yàn)證試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)方案如表5，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖12所示，DOE預(yù)測的實(shí)驗(yàn)組平均表達(dá)量為3.84g/L，達(dá)到預(yù)測，且高于DOE試驗(yàn)中最高的3.65g/L。

因此，確定以FA04作為補(bǔ)料培養(yǎng)基時，培養(yǎng)基中添加各氨基酸終濃度分別為：L-組氨酸38.7mmol/L，L-酪氨酸75.0mmol/L，L-絲氨酸64.0mmol/L，L-谷氨酰胺49.2mmol/L，L-半胱氨酸18.7mmol/L。

表5 FA04添加不同氨基酸濃度的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)方案

實(shí)施例3

為進(jìn)一步驗(yàn)證優(yōu)化后基礎(chǔ)和補(bǔ)料培養(yǎng)基相對于未優(yōu)化培養(yǎng)基具有改善細(xì)胞生長狀況及提高抗體表達(dá)量的優(yōu)勢，進(jìn)行了3L生物反應(yīng)器上細(xì)胞批次補(bǔ)料培養(yǎng)對比試驗(yàn)。

試驗(yàn)條件如表6所示，共培養(yǎng)4批，2批采用優(yōu)化后基礎(chǔ)與補(bǔ)料培養(yǎng)基，2批采用未優(yōu)化培養(yǎng)基，除培養(yǎng)基不同外，其它培養(yǎng)條件一致，試驗(yàn)結(jié)果分別見圖13-15。

表6培養(yǎng)基優(yōu)化前后對比試驗(yàn)條件

由圖13可見基礎(chǔ)和補(bǔ)料培養(yǎng)基優(yōu)化前后細(xì)胞的生長狀況，優(yōu)化后的培養(yǎng)基更能促進(jìn)細(xì)胞生長，并利于細(xì)胞活率維持，優(yōu)化培養(yǎng)基后的PVCD平均為3.84×10⁷cells/mL，優(yōu)化培養(yǎng)基前的PVCD平均為2.31×10⁷cells/mL，優(yōu)化后PVCD提高了66.2％；培養(yǎng)結(jié)束時細(xì)胞活率由優(yōu)化前的61.9％提高至優(yōu)化后的81.5％，細(xì)胞活率提高后細(xì)胞狀態(tài)一直處于較優(yōu)的生長狀態(tài)，更利于PD-1抗體的表達(dá)。

由圖14可見優(yōu)化基礎(chǔ)和補(bǔ)料培養(yǎng)基前后的抗體表達(dá)量情況，優(yōu)化后的培養(yǎng)基中抗體表達(dá)量平均為3.88g/L，相對于優(yōu)化前的2.35g/L，提高了約65.1％，說明優(yōu)化后的培養(yǎng)基更能促進(jìn)PD-1抗體的表達(dá)。

分別取優(yōu)化培養(yǎng)基前后各一批細(xì)胞液進(jìn)行Protein A純化，純化后的樣品進(jìn)行抗PD-1單克隆抗體的生物學(xué)活性檢測，檢測方法采用以轉(zhuǎn)基因細(xì)胞為基礎(chǔ)的生物發(fā)光試驗(yàn)方法，結(jié)果見圖15?？梢姡囵B(yǎng)基優(yōu)化后與優(yōu)化前的最大發(fā)光值均為1.5×10⁵RTU，說明優(yōu)化前后細(xì)胞表達(dá)的抗PD-1單克隆抗體的生物學(xué)活性結(jié)果一致，沒有明顯的差異。

綜上所述，由搖瓶中優(yōu)化的基礎(chǔ)和補(bǔ)料培養(yǎng)基在放大應(yīng)用于3L生物反應(yīng)器上后，與優(yōu)化前相比不僅改善了細(xì)胞生長狀況，且更能促進(jìn)抗PD-1單克隆抗體的表達(dá)，優(yōu)化后所表達(dá)抗PD-1單克隆抗體的生物學(xué)活性與優(yōu)化前一致。由此可見基礎(chǔ)培養(yǎng)基和補(bǔ)料培養(yǎng)基優(yōu)化成功，且可進(jìn)行進(jìn)一步放大，應(yīng)用在抗PD-1單克隆抗體生產(chǎn)后不僅可以保證產(chǎn)品質(zhì)量，且可以大大提高抗體產(chǎn)量，減少生產(chǎn)成本。