本發(fā)明涉及基因檢測技術領域，尤其涉及一種干擾素刺激基因TRIM69抗登革病毒的應用。

背景技術：

登革病毒(DENV)是一種借助于蚊媒傳播的病毒，感染人后容易引起登革熱及發(fā)病率和死亡率很高的登革出血熱和登革休克綜合征。這些疾病廣泛流行于熱帶和亞熱帶地區(qū)，分布廣、發(fā)病多，是一種危害較大的人類傳染病。對亞洲、太平洋群島及中、南美洲的許多國家均已造成嚴重的威脅。我國于1978年在廣東佛山首次發(fā)現(xiàn)本病，后來在海南島及廣西等地均有發(fā)現(xiàn)。2014年6月份，在廣東省也爆發(fā)了特別嚴重的登革熱疫情，給當?shù)鼐用駧韲乐氐臑暮Α?/p>

目前對DENV的感染機制的了解尚不明確，至今都沒有安全有效的疫苗來預防登革熱的感染，也沒有十分有效的抗DENV藥物治療感染該病毒的患者。因而進一步闡明DENV感染宿主的分子機制，以及宿主抗DENV的免疫機制具有重要意義，并為更好地了解登革熱的發(fā)病過程，開發(fā)相應的藥物奠定基礎。

天然免疫是宿主對抗外來病原體的第一道防線，是高等動物及人類生命得以維系和延續(xù)的必要組成部分。細胞被病毒刺激后，會產(chǎn)生干擾素，干擾素結(jié)合干擾素受體，激活一系列干擾素刺激基因(ISG)。盡管已發(fā)現(xiàn)成百上千的ISG，但已被研究發(fā)現(xiàn)有關抗病毒作用的為數(shù)不多。

鑒于上述缺陷，本設計人積極加以研究創(chuàng)新，以期公開干擾素刺激基因TRIM69抗登革病毒的應用，使其更具有產(chǎn)業(yè)上的利用價值。

技術實現(xiàn)要素：

為解決上述技術問題，本發(fā)明的目的是提供一種干擾素刺激基因TRIM69抗登革病毒的應用。我們利用RNA Seq技術篩選到152個受DENV感染明顯變化的基因，并利用軟件分析相關基因是否為ISG，然后構建相關過表達質(zhì)粒驗證其抗DENV的能力。其中，TRIM69是一個受IFN-β(β干擾素)刺激誘導的ISG，在感染DENV后明顯上調(diào)。分別過表達和敲除該基因，檢測對DENV復制的影響。

本發(fā)明公開了干擾素刺激基因TRIM69抗登革病毒的應用。

進一步的，干擾素刺激基因TRIM69受β干擾素的刺激誘導。

進一步的，干擾素刺激基因TRIM69能夠抑制登革病毒的復制。

進一步的，TRIM69通過自身的E3泛素連接酶抑制登革病毒的復制。

進一步的，登革病毒感染HEK293T細胞以建立感染模型。

進一步的，TRIM69的NCBI序列號為NM_182985.4。

進一步的，TRIM69的篩選過程如下：

(1)利用RNA Seq分析DNEV感染HEK293T細胞明顯受影響的基因

利用DENV感染HEK293T細胞，然后與未感染細胞比較轉(zhuǎn)錄本變化，發(fā)現(xiàn)共有152個基因的轉(zhuǎn)錄本發(fā)生變化，有99個明顯上調(diào)，53個下調(diào)。這其中包含很多RIG-I信號通路、JAK-STAT信號通路，以及趨化因子信號通路分子，如說明書附圖的圖7所示。

DENV感染細胞后，上述三條信號通路都會被激活，這些信號通路分子在信號傳遞過程中都發(fā)揮著重要的作用。說明RNA seq篩選途徑真實可靠，可以用來鑒定一些未知功能的基因。

(2)ISG基因分析

針對上述篩選到的152個基因，利用生物信息學分析網(wǎng)站Interferome V2.01(http://interferome.its.monash.edu.au/interferome/search/showSearch.jspx)進行分析，共發(fā)現(xiàn)其中有52個是潛在的ISG，比例占到差異表達基因總數(shù)的約34％。其中43個發(fā)生上調(diào)，9個下調(diào)。其中TRIM69的抗病毒功能尚不明確，因此決定研究其抗DENV功能。

借由上述方案，本發(fā)明具有以下優(yōu)點：

首次發(fā)現(xiàn)TRIM69是一個受IFN-β刺激誘導的ISG基因，且驗證其具有抗DENV感染的作用，發(fā)現(xiàn)其E3泛素連接酶活性為抗DENV感染所必需。

附圖說明

圖1是本發(fā)明DENV感染HEK293細胞后，TRIM69的表達結(jié)果；

圖2是本發(fā)明IFN-β刺激HEK293細胞后，TRIM69的表達結(jié)果；

圖3是本發(fā)明TRIM69對DENV復制的影響；

圖4是本發(fā)明TRIM69對DENV蛋白表達的影響；

圖5是本發(fā)明TRIM69敲除細胞系對DENV復制的影響；

圖6是本發(fā)明HEK293細胞中加入MG132后對DENV蛋白降解的影響；

圖7是DNEV感染HEK293T細胞明顯受影響的基因。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖和實施例，對本發(fā)明的具體實施方式作進一步詳細描述。以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。

實施例1

在HEK293T細胞中，感染DENV 48h，分別利用RT-PCR和Western blot進一步確定TRIM69的表達變化。如圖1所示，TRIM69受DENV感染而明顯 上調(diào)。

在HEK293T細胞中，加入IFN-β刺激，分別于12h、24h收集細胞，利用RT-PCR檢測TRIM69的表達變化。如圖2所示，TRIM69的表達明顯上調(diào)，說明TRIM69是一個受IFN-β誘導的ISG基因。

構建TRIM69WT及其突變體TRIM69CA(E3泛素連接酶活性喪失)，在HEK293T細胞中分別過表達TRIM69WT及其突變體TRIM69CA，然后感染DENV，分別檢測上清液及細胞中的病毒含量。將培養(yǎng)基上清液轉(zhuǎn)移到正在培養(yǎng)中的Vero細胞(非洲綠猴腎細胞)中，三天后觀察發(fā)現(xiàn)，過表達TRIM69WT的細胞中產(chǎn)生的子代DENV明顯降低。如圖3所示，與對照(圖3A)相比，TCID50實驗顯示的Vero細胞病變減輕(圖3B)，而過表達TRIM69CA產(chǎn)生的子代DENV(圖3D)與對照MOCK(圖3C)比較，沒有明顯變化。利用收集的細胞，檢測TRIM69對DENV蛋白表達的影響。如圖4所示，TRIM69WT能夠抑制DENVNS4B的表達，而TRIM69CA卻不能。

構建TRIM69敲除HEK293T細胞系，檢測TRIM69對DENV復制的影響。如圖5所示，在TRIM69敲除細胞系中，DENV的NS蛋白NS3、NS4B的表達明顯增加，說明DENV的復制量明顯上調(diào)。

為驗證DENV的復制量降低是否與TRIM69的泛素化作用相關，將蛋白酶體抑制劑MG132加入到感染DENV的HEK293T細胞中。如圖6所示，加入MG132后，DENV的NS4B蛋白的降解受到明顯抑制。這說明TRIM69依賴于自身的E3泛素連接酶活性降解目標蛋白，從而有效抑制DENV的復制。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，并不用于限制本發(fā)明，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明技術原理的前提下，還可以做出若干改進和變型，這些改進和變型也應視為本發(fā)明的保護范圍。