技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及中藥提取物應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及藿香揮發(fā)油在抑制耐藥大腸桿菌生長(zhǎng)中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

目前，細(xì)菌耐藥性已成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生威脅和世界關(guān)注的臨床難題，耐藥菌的產(chǎn)生使得臨床上現(xiàn)有的抗菌藥物的療效不斷下降，藥物的選擇范圍越來(lái)越有限。實(shí)際上，控制抗菌藥物的使用，只能緩解細(xì)菌的耐藥，但不能從根本上阻斷或解決耐藥問(wèn)題。這就需要人們不斷地去發(fā)展新型抗生素，但研發(fā)新型抗生素的速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)趕不上細(xì)菌產(chǎn)生耐藥的速度。中藥作為人類(lèi)與疾病斗爭(zhēng)的經(jīng)驗(yàn)結(jié)晶，因其成分復(fù)雜，作用機(jī)理廣泛，在感染性疾病防治中發(fā)揮著重要的作用，一直被用作尋求抗生素替代藥物的重要資源庫(kù)。新疆中藥資源豐富，中草藥的種植開(kāi)發(fā)具有廣闊的應(yīng)用與發(fā)展前景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的就是針對(duì)上述現(xiàn)有臨床耐藥難題，從現(xiàn)存的中藥資源庫(kù)入手，篩選出新疆種植的藿香作為潛在的耐藥抑制劑，其揮發(fā)油提取物具有較好的抑菌活性，首次從藿香中篩選出耐藥抑制成分—胡薄荷酮，填補(bǔ)中藥耐藥抑制劑的篩選研究空白，為解決耐藥大腸桿菌的耐藥難題提供了詳細(xì)的研究依據(jù)。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：藿香揮發(fā)油在抑制耐藥大腸桿菌生長(zhǎng)中的應(yīng)用。

進(jìn)一步的，上述的應(yīng)用，所述藿香揮發(fā)油為新疆種植的藿香花部位提取得到的揮發(fā)油。

進(jìn)一步的，上述的應(yīng)用，所述藿香揮發(fā)油的活性成分為胡薄荷酮。

進(jìn)一步的，上述的應(yīng)用，所述耐藥大腸桿菌為人源產(chǎn)ESBLs大腸桿菌。

進(jìn)一步的，上述的應(yīng)用，所述藿香揮發(fā)油的制備方法為：將采摘的新疆種植的藿香花部位分離并陰干后，取100g裝入5000 ml的蒸餾瓶中，加水量為3500 ml, 浸泡1h后以水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油，提取6-8h；在所獲得的餾出物中加入3g無(wú)水氯化鈉進(jìn)行干燥，置冰箱4℃冷藏24 h，使水、油兩相分層，再用分液濾斗進(jìn)行分離，濾得黃色透明的、具有濃郁芳香氣味的濾液，即得到新疆種植的藿香花部位的揮發(fā)油，所述新疆種植的藿香花部位的揮發(fā)油的產(chǎn)率按照重量百分比計(jì)為0.29%；所述新疆種植的藿香花部位的揮發(fā)油的密度為0.84 mg/ml。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供了胡薄荷酮在抑制耐藥大腸桿菌生長(zhǎng)中的應(yīng)用。

進(jìn)一步的，上述的應(yīng)用，所述胡薄荷酮分離自權(quán)利要求2所述的新疆種植的藿香花部位的揮發(fā)油。

進(jìn)一步的，上述的應(yīng)用，所述耐藥大腸桿菌為人源產(chǎn)ESBLs大腸桿菌。

本發(fā)明的有益效果為：為進(jìn)一步明確藿香對(duì)人源產(chǎn)ESBLs大腸桿菌耐藥性的作用，首次研究了藿香揮發(fā)油對(duì)耐藥大腸桿菌的作用，發(fā)現(xiàn)能夠抑制耐藥大腸桿菌的生長(zhǎng)。從藿香揮發(fā)油中篩選主要的成分作為耐藥抑制劑進(jìn)行研究，數(shù)據(jù)表明藿香揮發(fā)油的主要單體成分胡薄荷酮能夠抑制產(chǎn)ESBLs大腸桿菌的生長(zhǎng)，并影響其生物被膜的形成。

同時(shí)，結(jié)合中草藥研究耐藥病原菌的抑制與治療問(wèn)題，考慮新疆地區(qū)特有的中藥資源藿香，獲得其揮發(fā)油提取物及主要的活性單品成分胡薄荷酮，直接與臨床主要的耐藥病原菌產(chǎn)ESBLs大腸桿菌的抑制相結(jié)合，旨在緩解或解決大腸桿菌的耐藥感染，降低病死率，為解決與治療人源耐藥大腸桿菌提出來(lái)新的思路，具有重要的研究意義。

附圖說(shuō)明

圖1為新疆種植的藿香花部位揮發(fā)油未加正構(gòu)烷烴譜圖。

圖2為新疆種植的藿香花部位揮發(fā)油加正構(gòu)烷烴譜圖。

圖3為新疆種植的藿香花部位揮發(fā)油未加正構(gòu)烷烴和加正構(gòu)烷烴譜圖比較（紅色為加正構(gòu)烷烴，黑色為未加正構(gòu)烷烴）。

圖4為硫酸慶大霉素對(duì)產(chǎn)ESBLs大腸桿菌的抑制率。

圖5為胡薄荷酮對(duì)產(chǎn)ESBLs大腸桿菌的抑制率。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：

1、新疆種植的藿香揮發(fā)油的提取與產(chǎn)率的測(cè)定：

將采摘的新疆種植的藿香花部位分離并陰干后, 取100 g裝入5000 ml的蒸餾瓶中，加水量低于3500 ml, 浸泡1 h。按《中國(guó)藥典》2005版(一部)附錄XD水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油，提取6-8 h。由于所獲得的餾出物含有少量的水分，加少許氯化鈉，置冰箱冷藏24 h，使水、油兩相分層，再用分液濾斗進(jìn)行分離，濾得黃色透明的、具有濃郁芳香氣味的液體，即新疆種植的藿香花部位的揮發(fā)油，計(jì)算揮發(fā)油產(chǎn)率為0.29 % (w/w)。毛細(xì)管比重法，求得新疆種植的藿香花部位的揮發(fā)油密度為0.84 mg/ml。

2、新疆種植的藿香揮發(fā)油提取物的含量測(cè)定（GC-MS）：

利用GC-MS聯(lián)用技術(shù)與分析，通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)匹配的方式，確定新疆種植的藿香揮發(fā)油提取物的化合物結(jié)構(gòu)。

2.1、GC-MS聯(lián)用技術(shù)與分析條件：

（1）氣相條件：進(jìn)樣口溫度 250 ℃, 柱溫 40 ℃; 以5 ℃/min 升到250 ℃保持10 min；

（2）流速：恒壓模式 1.0 ml/min , 分流進(jìn)樣:分流比為100:1;

（3）質(zhì)譜條件：EI源離子源溫度：200 ℃；接口溫度：250 ℃；溶劑切除時(shí)間：4min；檢測(cè)器電壓：1.08 KV。檢索譜庫(kù)：NIST05、NIST05s；進(jìn)樣量：0.5 μl（莖部位揮發(fā)油進(jìn)樣1.0 μl）；檢索譜庫(kù)：NIST05、NIST05s.

2.2、新疆種植的藿香花部位揮發(fā)油成分GC-MS分析結(jié)果：

通過(guò)GC-MS聯(lián)用技術(shù)分析，與標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)匹配得譜圖，如圖1-圖3所示，通過(guò)表1分析：從新疆種植的藿香揮發(fā)油提取物中共鑒定出21種化合物，根據(jù)積分面積可得其主要化學(xué)成分為pulegone (胡薄荷酮，34.10 %)、estragole (草蒿腦，29.54 %)、p-Menthan-3-one，(1R,4R)-(+)（16.70 %）。表1顯示為新疆種植花部位揮發(fā)油的化學(xué)成分。

表1

。

3、藿香揮發(fā)油中耐藥抑制活性成分篩選：

3.1、藿香揮發(fā)油對(duì)產(chǎn)ESBLs大腸桿菌的耐藥抑制作用：

采用肉湯稀釋法研究藿香揮發(fā)油對(duì)產(chǎn)ESBLs大腸桿菌的耐藥抑制作用，與對(duì)照品比較，發(fā)現(xiàn)藿香揮發(fā)油提取物能明顯的抑制耐藥大腸桿菌的生長(zhǎng)，如表2所示為藿香揮發(fā)油對(duì)產(chǎn)ESBLs大腸桿菌的抑制作用。

表2

。

抑菌活性單位: mg/ml。

表2中藿香揮發(fā)油對(duì)產(chǎn)ESBLs大腸桿菌具有一定的抑制作用，雖然與對(duì)照品比較，MIC值和MBC值存在一定的差距，但試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)植物提取物的確能夠抑制產(chǎn)ESBLs大腸桿菌的生長(zhǎng)，這一點(diǎn)是值得去深思和深入研究的。

3.2、藿香揮發(fā)油中胡薄荷酮的耐藥抑制作用：

產(chǎn)ESBLs大腸桿菌的抑制作用，結(jié)合其主要的化學(xué)成分胡薄荷酮 (34.10 %)、草蒿腦 (29.54 %)、p-Menthan-3-one (1R,4R)-(+) (16.70 %)、檸檬油精 (8.18 %)。其中，胡薄荷酮和草蒿腦的含量較高，考慮草蒿腦疑似致癌，雖沒(méi)有證實(shí)，也缺乏相關(guān)的研究資料，為了充分考慮用藥安全，篩選胡薄荷酮為藿香揮發(fā)油的主要活性成分，進(jìn)行耐藥性抑制作用的研究。

利用肉湯稀釋法研究胡薄荷酮單品成分對(duì)產(chǎn)ESBLs大腸桿菌的抑制作用結(jié)果：

MIC: 23.68 μg/ml。

MBC: 47.35 μg/ml。

胡薄荷酮對(duì)產(chǎn)ESBLs大腸桿菌的抑制作用較好。

3.3、藿香揮發(fā)油中胡薄荷酮的產(chǎn)ESBLs大腸桿菌生物被膜形成的影響：

通過(guò)96孔微孔板技術(shù)，在600 nm下檢測(cè)胡薄荷酮對(duì)產(chǎn)ESBLs大腸桿菌生物被膜形成的影響，以抑制率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，結(jié)果如表3，圖4-圖5所示，表3為胡薄荷酮對(duì)產(chǎn)ESBLs大腸桿菌的抑制率。

表3

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通過(guò)對(duì)每個(gè)藥液組的不同濃度的抑制率進(jìn)行組內(nèi)方差分析，得硫酸慶大霉素、胡薄荷酮每個(gè)不同濃度內(nèi)的抑制率的差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即濃度的變化不影響抑制率，抑制率并不隨濃度的增大而產(chǎn)生變化。通過(guò)多重比較 (LSD法)，得硫酸慶大霉素的C1和C3的抑制率的差異具有顯著性意義，P =0.026。

最后應(yīng)說(shuō)明的是：以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，盡管參照前述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說(shuō)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，其依然可以對(duì)前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。