本發(fā)明涉及大腸桿菌甲醇代謝途徑的組裝與調(diào)控，具體涉及一種增強(qiáng)甲醇代謝通路中限速酶甲醇脫氫酶活性的方法，從而提高甲醇在大腸桿菌中的代謝量。
背景技術(shù)：
：隨著代謝工程的迅猛發(fā)展及生物合成學(xué)的崛起，人類改造微生物作為細(xì)胞工廠進(jìn)行生物制造的能力顯著提高。當(dāng)前生物制造的原料仍以糧食為主，隨著糧食危機(jī)日益家具以及其價(jià)格不斷攀升，以糧食為原料的生物制造正面臨嚴(yán)峻考驗(yàn)。因此，為了解決原料來(lái)源問(wèn)題，實(shí)現(xiàn)生物制造可持續(xù)發(fā)展，目前逐漸將“甲醇經(jīng)濟(jì)”發(fā)展為合理的可替代能源——以甲醇為原料，緩解化石能源的緊缺。與其他原料相比，甲醇具備以下優(yōu)勢(shì)：1)價(jià)格低廉，當(dāng)前甲醇的價(jià)格是葡萄糖價(jià)格的1/3；2)來(lái)源廣泛，從天然氣、煤化工、生物質(zhì)等均可合成；3)含能高，為目標(biāo)產(chǎn)物的合成提供充足還原力。因此，以甲醇替代糧食作為原料，可以大幅度降低生物制造的而成本，實(shí)現(xiàn)生物制造的可持續(xù)發(fā)展。自然界中存在能夠代謝甲醇的微生物，如甲基桿菌(methylobacteriumextorquens)、甲醇芽孢桿菌(bacillusmethanolicus)、甲醇營(yíng)養(yǎng)型酵母(methylotrophicyeasts)等。盡管這些微生物可以利用甲醇作為原料，但其利用效率較低，究其原因，一方面是大部分的甲醇營(yíng)養(yǎng)菌是好氧型，另一方面，菌株遺傳操作低效落后。故，在模式菌株中構(gòu)建甲醇代謝途徑是實(shí)現(xiàn)甲醇高效生物轉(zhuǎn)化的有效途徑。在甲醇營(yíng)養(yǎng)菌株中，甲醇經(jīng)甲醇脫氫酶(mdh)氧化為甲醛，后經(jīng)過(guò)磷酸核酮糖途徑(rump途徑)完成中心糖代謝。其中，甲醇代謝的rump途徑由兩個(gè)模塊組成，第1模塊由異源基因組成，第2模塊由內(nèi)源磷酸戊糖途徑的相關(guān)基因組成。甲醇經(jīng)第1模塊中的甲醇脫氫酶作用氧化為甲醛，與第2模塊中的5-磷酸核酮糖一起經(jīng)第1模塊生成6-磷酸果糖，進(jìn)而部分通過(guò)模塊1流向糖酵解路徑生成產(chǎn)品，另一部分通過(guò)模塊2再生5-磷酸核酮糖促進(jìn)甲醛同化。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種提高大腸桿菌甲醇代謝途徑中限速酶活性的方法，來(lái)提高菌株對(duì)甲醇利用率。為實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：一種提高大腸桿菌甲醇代謝途徑中限速酶活性的方法，將大腸桿菌過(guò)表達(dá)基因mdh和hps-phi后，通過(guò)添加激活蛋白nudf，增強(qiáng)甲醇脫氫酶的酶活，從而提高甲醇的代謝量；其中，所述基因mdh和hps-phi為來(lái)源于甲醇芽孢桿菌mga3的mdh2和hps-phi；所述激活蛋白nudf來(lái)源于e.colimg1655。本發(fā)明所述的方法，其具體包括如下步驟：(1)將來(lái)源于甲醇芽孢桿菌mga3的mdh2和hps-phi，合成基因后通過(guò)基因克隆至質(zhì)粒petduet，構(gòu)建得到質(zhì)粒petduet-mdh2-rump；(2)將質(zhì)粒petduet-mdh2-rump導(dǎo)入大腸桿菌bl21(de3)，獲得菌株bl21(de3)/petduet-mdh2-rump；(3)添加來(lái)源于e.colimg1655的同源激活蛋白nudf，構(gòu)建菌株bl21(de3)/petduet-nudf-mdh2-rump。本發(fā)明的另一目的在于提供上述方法制備的菌株。本發(fā)明的又一目的在于提供上述方法制備的菌株在甲醇代謝中的應(yīng)用。上述應(yīng)用中，采用菌株發(fā)酵代謝甲醇，培養(yǎng)基成分為：17.1g/lna2hpo4·12h2o、3g/lkh2po4、10g/lnh4cl、0.5g/lnacl，微量元素；其中添加50mm甲醇和10g/l葡萄糖為混合碳源。優(yōu)選的，采用菌株發(fā)酵代謝甲醇，在培養(yǎng)基中添加有機(jī)氮源，所述有機(jī)氮源選自為麥芽浸出粉、酵母粉、蛋白胨、玉米漿中的一種，其終濃度均為1g/l。本發(fā)明在大腸桿菌中進(jìn)行甲醇代謝路徑的組裝，實(shí)現(xiàn)甲醇代謝，并通過(guò)分子手段改造提高甲醇脫氫酶mdh的酶活，以實(shí)現(xiàn)甲醇代謝的提高。本發(fā)明中高通量篩選甲醇脫氫酶所用培養(yǎng)基為m9培養(yǎng)基，并在其中添加一定量的甲醇，即以葡萄糖和甲醇為混合碳源，通過(guò)甲醇轉(zhuǎn)化為甲醛的量表達(dá)甲醇脫氫酶的活力。另本發(fā)明中，定量測(cè)定甲醇消耗所用的培養(yǎng)基為m9培養(yǎng)基，在搖瓶發(fā)酵過(guò)程中添加一定量的葡萄糖和甲醇作為碳源，通過(guò)檢測(cè)甲醇的消耗量表達(dá)大腸桿菌內(nèi)甲醇代謝能力。本發(fā)明還對(duì)菌株發(fā)酵的培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，采用麥芽浸出粉氮源進(jìn)一步提高了菌株的甲醇代謝效果。附圖說(shuō)明圖1是甲醛濃度隨時(shí)間變化曲線圖；圖2是菌株生長(zhǎng)狀況隨時(shí)間變化曲線圖；圖3是菌株甲醇消耗量柱形圖；圖4是不同氮源下甲醇消耗量柱形圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖說(shuō)明對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式做進(jìn)一步闡述。實(shí)施例中選用的載體質(zhì)粒為petduet，購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)公司；所用表達(dá)基因的宿主菌為大腸桿菌bl21(de3)，購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。實(shí)施例1：大腸桿菌甲醇代謝路徑組裝本發(fā)明在大腸桿菌中組裝依賴nad甲醇脫氫酶和rump途徑的甲醇代謝途徑。通過(guò)對(duì)比不同來(lái)源的甲醇脫氫酶mdh和3-己糖-6-磷酸合酶hps以及3-己糖-6-磷酸異構(gòu)酶phi，選定來(lái)源于甲醇芽孢桿菌(bacillusmethanolicus)mga3的mdh2和hps-phi，合成基因后通過(guò)基因克隆至質(zhì)粒petduet，構(gòu)建得到質(zhì)粒petduet-mdh2和質(zhì)粒petduet-mdh2-rump。將該質(zhì)粒通過(guò)常規(guī)方法分別導(dǎo)入大腸桿菌bl21(de3)中，獲得的菌株分別命名為m和mr，并以甘油管形式保存，其中菌株m只過(guò)表達(dá)基因mdh2，且連接至載體的酶切位點(diǎn)為ncoi和bamhi；菌株mr過(guò)表達(dá)基因mdh2、hps-phi，且mdh2的酶切位點(diǎn)與上述相同，hps-phi的酶切位點(diǎn)為ndei和xhoi，均以t7為啟動(dòng)子。實(shí)施例2：增強(qiáng)甲醇脫氫酶酶活為了增強(qiáng)甲醇脫氫酶mdh的活力，本實(shí)施例中采取了三種方案：方案一為通過(guò)定向進(jìn)化增強(qiáng)甲醇脫氫酶的酶活，但酶活提高不明顯；方案二為通過(guò)添加激活蛋白增強(qiáng)甲醇脫氫酶的酶活，其中激活蛋白采用兩種來(lái)源：一是添加來(lái)源于e.colimg1655的同源激活蛋白nudf，構(gòu)建成菌株bl21(de3)/petduet-nudf-mdh2和bl21(de3)/petduet-nudf-mdh2-rump，菌株分別命名為nudf-m和nudf-mr；二是添加來(lái)源于bacillus.methanolicuspb1異源激活蛋白act，構(gòu)建成菌株bl21(de3)/petduet-act-mdh2，菌株命名為act-m；方案三為替換甲醇脫氫酶mdh2，替換的甲醇脫氫酶來(lái)源于cupriavidusnecatorn-1，且在第26、31、169位點(diǎn)進(jìn)行點(diǎn)突變，構(gòu)建成菌株bl21(de3)/petduet-mdh2，菌株命名為mdh2-m。其中添加激活蛋白的目的是促進(jìn)甲醇脫氫酶mdh的輔因子nadh的氧化，從而提高甲醇脫氫酶mdh的轉(zhuǎn)化速率。在進(jìn)行甲醇脫氫酶酶活定量檢測(cè)時(shí)，以空菌bl21(de3)/petduet為對(duì)照，該空菌命名為b。實(shí)施例3：甲醇脫氫酶酶活的檢測(cè)本發(fā)明中檢測(cè)甲醇脫氫酶mdh的酶活采用nash試劑(即乙酰丙酮試劑)與甲醛的顯色反應(yīng)，通過(guò)生成的甲醛的量檢測(cè)甲醇脫氫酶的活力(即甲醇氧化為甲醛的能力)。m9培養(yǎng)基：17.1g/lna2hpo4·12h2o、3g/lkh2po4、10g/lnh4cl、0.5g/lnacl，微量元素，及10g/lglucose。nash試劑：150g/l醋酸銨、3ml/l乙酸、2ml/l乙酰丙酮。甘油管中菌株接至搖管使菌株復(fù)壯，37℃，200rpm，過(guò)夜培養(yǎng)，收集菌，5000g，7min離心，m9重懸，轉(zhuǎn)接至9ml的m9培養(yǎng)基中，添加0.5m甲醇開(kāi)始反應(yīng)，不同時(shí)間取樣，與nash試劑1:1反應(yīng)混合，在58℃反應(yīng)10min，于412nm檢測(cè)吸光度，對(duì)應(yīng)標(biāo)曲計(jì)算甲醛濃度。結(jié)果如圖1所示，在相同時(shí)間90min，添加同源激活蛋白nudf的菌株nudf-m生成0.056mm甲醛，添加異源激活蛋白act的菌株act-m生成0.019mm，而未經(jīng)改造的菌株m生成甲醛0.014mm，即添加同源激活蛋白nudf的菌株生成甲醛是未經(jīng)改造菌株生成甲醛的4倍。更直觀地比較甲醇脫氫酶mdh的變化，將定義1u定義為每分鐘生成1μmol甲醛的量，即酶活，酶活結(jié)果如表3。表3菌株activity(mu)b0m166.42act-m219.29nudf-m593.25實(shí)施例4：甲醇代謝菌株搖瓶發(fā)酵m9培養(yǎng)基：17.1g/lna2hpo4·12h2o、3g/lkh2po4、10g/lnh4cl、0.5g/lnacl，微量元素。本實(shí)施例中，定量檢測(cè)甲醇消耗采用搖瓶發(fā)酵，以m9培養(yǎng)基添加50mm甲醇和10g/l葡萄糖為混合碳源，其步驟具體如下：將上述實(shí)施例1、2構(gòu)建的菌株b、mr、nudf-mr在lb種子培養(yǎng)液中過(guò)夜培養(yǎng)，檢測(cè)其od600，轉(zhuǎn)接至50mlm9培養(yǎng)基中，且該培養(yǎng)基中葡萄糖濃度為10g/l，使其初始o(jì)d600為0.3，取其相應(yīng)的種子液，5000rpm，離心7min，于無(wú)菌條件下棄上清液，用發(fā)酵培養(yǎng)基重懸轉(zhuǎn)接至搖瓶，于37℃，200rpm恒溫培養(yǎng)搖床培養(yǎng)4小時(shí)左右，加入0.5mmiptg和50mm甲醇，于一定時(shí)間取樣測(cè)其od600以及檢測(cè)甲醇的量。菌株生長(zhǎng)狀況結(jié)果如圖2所示，在添加50mm甲醇后，一定時(shí)間采用分光光度計(jì)檢測(cè)菌株在od為600nm處的生長(zhǎng)狀況，在0-11h時(shí)，為三菌株的延滯期；11-24h，為菌株的指數(shù)生長(zhǎng)期；24-36h，為菌株的穩(wěn)定期。三株菌的生長(zhǎng)趨勢(shì)相似，在11h左右，添加激活蛋白的菌株與對(duì)照菌株及未添加激活蛋白的菌株相比，生長(zhǎng)狀況較佳，故添加激活蛋白的菌株在含甲醇的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)并未產(chǎn)生不佳影響。甲醇消耗結(jié)果如圖3所示，在甲醇添加量為3g/l時(shí)，與對(duì)照菌株b相比，未添加激活代表的菌株mr甲醇消耗為0.36g/l，添加激活蛋白后的菌株nudf-mr甲醇消耗為0.57g/l，即大腸桿菌內(nèi)甲醇代謝路徑組裝后甲醇有消耗，且在添加同源激活蛋白提高限速酶的酶活后，甲醇代謝量得以提高約1.5倍。實(shí)施例5：搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化通過(guò)實(shí)施例4中的結(jié)果顯示，菌株nudf-mr的甲醇代謝量最佳，以該菌株為基礎(chǔ)，將實(shí)施例4中的發(fā)酵培養(yǎng)基m9培養(yǎng)基添加不同的有機(jī)氮源，分別為麥芽浸出粉、酵母粉、蛋白胨、玉米漿，其終濃度均為1g/l。按照實(shí)施例4中的發(fā)酵方法，在一定時(shí)間檢測(cè)甲醇的代謝量。結(jié)果如圖4顯示，通過(guò)添加不同的無(wú)機(jī)氮源，定量檢測(cè)甲醇消耗，以確定最佳的發(fā)酵條件。結(jié)果顯示，添加1g/l麥芽浸出粉時(shí)，甲醇的消耗量為最高，約為0.6g/l，而最新報(bào)道在添加酵母粉的條件下，搖瓶發(fā)酵甲醇消耗約為0.3g/l。當(dāng)前第1頁(yè)12