本發(fā)明涉及動(dòng)物用病毒活疫苗制造領(lǐng)域，具體涉及到一種豬偽狂犬病毒基因缺失株c1201/δge株及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

豬皰疹病毒i型(suidherpesvirusi)亦稱偽狂犬病病毒(pseudorabiesvirus，prv)能夠引起多種家畜、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和野生動(dòng)物高熱、奇癢及不同程度神經(jīng)癥狀(jakubik,1977)。豬是prv唯一的自然宿主，各年齡段均可感染。仔豬感染后往往發(fā)展為神經(jīng)系統(tǒng)疾病(如嘔吐，顫抖，共濟(jì)失調(diào)，癱瘓和抽搐)，并可能死于嚴(yán)重的腦脊髓炎；成年豬主要出現(xiàn)發(fā)熱和呼吸道癥狀(打噴嚏和肺炎)；懷孕母豬感染后可導(dǎo)致流產(chǎn)或產(chǎn)死胎，任何年齡的豬在耐過(guò)急性感染后均能形成潛伏感染(mettenleiter,2000)。因此，本病對(duì)許多國(guó)家的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，引起了世界各國(guó)獸醫(yī)工作者的高度重視。

通過(guò)加大控制力度和實(shí)施根除計(jì)劃(在大規(guī)模接種ge缺失疫苗以區(qū)分野毒感染與疫苗接種的基礎(chǔ)上撲殺野毒感染的豬只)，歐洲許多國(guó)家已經(jīng)在家養(yǎng)豬群中根除此病，這些國(guó)家包括奧地利、丹麥、芬蘭、德國(guó)、荷蘭、瑞典、瑞士、挪威等。近年來(lái)，加拿大、新西蘭和美國(guó)也已報(bào)道在家養(yǎng)豬中消除此病。

我國(guó)對(duì)本病的防控主要采用免疫接種ge基因缺失疫苗結(jié)合ge-elisa檢測(cè)方法，但偽狂犬病仍常有發(fā)生。2011年以來(lái)，我國(guó)多省份規(guī)?；i場(chǎng)母豬出現(xiàn)流產(chǎn)、產(chǎn)死胎，初生仔豬出現(xiàn)神經(jīng)癥狀后死亡等疑似偽狂犬病的疫情，個(gè)別省份較為嚴(yán)重，發(fā)病豬場(chǎng)數(shù)量多，損失較大。經(jīng)調(diào)查這些豬場(chǎng)均已進(jìn)行過(guò)偽狂犬病疫苗的免疫接種，這一現(xiàn)象可能是由一種抗原性發(fā)生變異的偽狂犬病病毒引起的(楊漢春，2013)。我們從prv疫苗免疫豬場(chǎng)采集疑似豬偽狂犬病病料接種pk-15細(xì)胞，分離得到1株prv，命名為bj-11株。全基因組序列分析結(jié)果顯示，該分離毒株是新流行毒株。bj-11株對(duì)免疫仔豬具有較強(qiáng)的致病性，致死率達(dá)40％，現(xiàn)有的barthak61疫苗已不能為仔豬提供完全的免疫保護(hù)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷而提供一種豬偽狂犬基因缺失毒株(pseudorabiesvirus,prv)c1201/δge株，其微生物保藏號(hào)是：cctccno:v201721；保藏時(shí)間：2017.05.04；保藏單位：中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，chinacenterfortypeculturecollection(cctcc)；保藏地址：湖北省武漢市武昌區(qū)武漢大學(xué)保藏中心。

上述的豬偽狂犬基因缺失毒株，其中，該病毒株ge蛋白的us8基因完全缺失，以及gi蛋白的us7基因缺失872-1101位堿基，也就是說(shuō)，豬偽狂犬病毒c1201/δge株的基因序列缺失全部的ge和部分的gi，其中，gi蛋白的us7基因缺失872-1101位堿基。

本發(fā)明還可以包括：一種豬偽狂犬病毒基因缺失株c1201/δge株的應(yīng)用，可應(yīng)用于斷奶仔豬對(duì)新流行毒株的免疫，保護(hù)率不低于80％。斷奶仔豬免疫使用c1201/δge配制的滅活疫苗能抵御豬偽狂犬新流行強(qiáng)毒hb-1201株的攻擊。

本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：

1、本發(fā)明構(gòu)建的豬偽狂犬病毒c1201/δge株的在細(xì)胞上連續(xù)傳代，具有很好的穩(wěn)定性，不發(fā)生變異，為豬偽狂犬基因缺失滅活疫苗的研制提供了很好的資源。

附圖說(shuō)明

通過(guò)閱讀參照以下附圖對(duì)非限制性實(shí)施例所作的詳細(xì)描述，本發(fā)明及其特征、外形和優(yōu)點(diǎn)將會(huì)變得更明顯。在全部附圖中相同的標(biāo)記指示相同的部分。并未刻意按照比例繪制附圖，重點(diǎn)在于示出本發(fā)明的主旨。

圖1為本發(fā)明prvc1201/δge構(gòu)建流程。

圖2為本發(fā)明prvc1201/δge缺失部分的基因序列。

圖3為本發(fā)明中轉(zhuǎn)移載體構(gòu)建示意圖。

圖4a、圖4b為本發(fā)明中純化的重組病毒接種pk-15細(xì)胞后的熒光觀察及其細(xì)胞病變示意圖。

圖5a為rprv-gfp-ge-在vero細(xì)胞上的cpe結(jié)果示意圖、圖5b為rprv-gfp-ge-在vero細(xì)胞上的ifa結(jié)果示意圖、圖5c為prvc1201/δge在vero細(xì)胞上的cpe結(jié)果示意圖、圖5d為prvc1201/δge在vero細(xì)胞上的ifa結(jié)果示意圖。

圖6為本發(fā)明實(shí)施例中斷奶仔豬免疫攻毒試驗(yàn)結(jié)果示意圖。

圖7為本發(fā)明實(shí)施例中斷奶仔豬免疫攻毒后的體溫記錄示意圖。

圖8a-圖8f為本發(fā)明實(shí)施例中攻毒對(duì)照組wn16和免疫組wn12剖檢結(jié)果示意圖。

圖9a-圖9d為本發(fā)明實(shí)施例中攻毒對(duì)照組wn16和免疫組wn12腦、脾ihc結(jié)果示意圖。

圖10為f1代c1201/δge電泳圖。

圖11為f1、f2、f7、f12、f16代c1201/δge電泳圖。

圖12為f0代c1201/δge正向測(cè)序的峰圖。

圖13為f0代c1201/δge反向測(cè)序的峰圖。

圖14為正向測(cè)序的遺傳距離結(jié)果。

圖15為正向測(cè)序的序列比對(duì)結(jié)果。

圖16為反向測(cè)序的遺傳距離結(jié)果。

圖17為反向測(cè)序的序列比對(duì)結(jié)果。

具體實(shí)施方式

在下文的描述中，給出了大量具體的細(xì)節(jié)以便提供對(duì)本發(fā)明更為徹底的理解。然而，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言顯而易見(jiàn)的是，本發(fā)明可以無(wú)需一個(gè)或多個(gè)這些細(xì)節(jié)而得以實(shí)施。在其他的例子中，為了避免與本發(fā)明發(fā)生混淆，對(duì)于本領(lǐng)域公知的一些技術(shù)特征未進(jìn)行描述。

為了徹底理解本發(fā)明，將在下列的描述中提出詳細(xì)的步驟以及詳細(xì)的結(jié)構(gòu)，以便闡釋本發(fā)明的技術(shù)方案。本發(fā)明的較佳實(shí)施例詳細(xì)描述如下，然而除了這些詳細(xì)描述外，本發(fā)明還可以具有其他實(shí)施方式。

參照?qǐng)D1-圖17所示，本發(fā)明提供了一種豬偽狂犬病毒基因缺失株c1201/δge株，豬偽狂犬病毒(pseudorabiesvirus,prv)為ge基因缺失株，其微生物保藏名稱為：豬偽狂犬病毒基因缺失株c1201/δge株；保藏號(hào)為：cctccno:v201721；保藏單位：中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心；保藏地址：湖北省武漢市武昌區(qū)武漢大學(xué)保藏中心，保藏日期：20170504，進(jìn)一步，該病毒株ge蛋白的us8基因完全缺失，以及gi蛋白的us7基因缺失872-1101位堿基。

實(shí)施例1

(1)ge基因轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建

以genbank收錄號(hào)為bk001744.1的prv毒株及pegfp-n1序列為參考模板，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增prvge基因、prvgc基因及egfp基因，應(yīng)用融合pcr方法，按照?qǐng)D3所示策略構(gòu)建轉(zhuǎn)移載體，在圖3中，a表示融合片段區(qū)域；b表示loxp位點(diǎn)。

用kodfxdnapolymerase擴(kuò)增目的片段，構(gòu)建50μl反應(yīng)體系，擴(kuò)增條件為：94℃10min；98℃20s，56-66℃45s，68℃1kb/min共38個(gè)循環(huán)；68℃7min。1)提取prvc1201/δge基因組，以提取的基因組為模板，用引物ge-lf/r、ge-rf/r分別擴(kuò)增us8(ge)基因左右兩端的同源臂ge-l、ge-r，其中g(shù)e-l末端以及ge-r起始端各添加13bp的融合片段。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳檢查后，用svgelandpcrclean-upsystem試劑盒進(jìn)行純化回收。純化回收后的pcr產(chǎn)物連接到pjet1.2/bluntcloningvector載體中，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入trans10感受態(tài)細(xì)胞，以pjet1.2f/r為引物進(jìn)行pcr，鑒定單克隆菌，進(jìn)行序列測(cè)定。質(zhì)粒提取使用pureyieldplasmidmidiprepsystem試劑盒，獲得的重組質(zhì)粒經(jīng)pcr和酶切鑒定后，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度，置-20℃保存。2)以pegfp-n1為模板，egfpf/r為引物，擴(kuò)增egfp表達(dá)盒。擴(kuò)增產(chǎn)物純化回收后與pjet1.2/bluntcloningvector連接、轉(zhuǎn)化trans10感受態(tài)細(xì)胞后，pcr鑒定為陽(yáng)性的單克隆菌進(jìn)行序列測(cè)定。提取重組質(zhì)粒，pcr和酶切鑒定后用紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度，置-20℃保存。3)首先，以序列測(cè)定驗(yàn)證正確的ge-l、egfp重組質(zhì)粒為模板，ge-lf和egfpr為引物，進(jìn)行融合pcr，擴(kuò)增獲得融合片段ge-l-egfp。pcr反應(yīng)條件為：94℃5min；98℃10s，63℃45s，68℃1min共11個(gè)循環(huán)；加入引物及模板后繼續(xù)進(jìn)行26個(gè)循環(huán)；68℃7min。其次，以序列測(cè)定驗(yàn)證正確的ge-r重組質(zhì)粒及純化回收后的融合片段ge-l-egfp作為模板，ge-lf和ge-rr為引物，進(jìn)行融合pcr，擴(kuò)增獲得融合片段ge-l-egfp-ge-r。將融合片段ge-l-egfp-ge-r純化回收后，連接入pjet1.2/bluntcloningvector并轉(zhuǎn)化trans10感受態(tài)細(xì)胞，pcr鑒定為陽(yáng)性的單克隆菌進(jìn)行序列測(cè)定。提取轉(zhuǎn)移載體重組質(zhì)粒，pcr和酶切鑒定后用紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度，置-20℃保存。

(2)重組病毒的篩選與純化

共轉(zhuǎn)染：使用pureyieldplasmidmidiprepsystem試劑盒進(jìn)行轉(zhuǎn)移載體重組質(zhì)粒的提取。選擇形態(tài)正常、生長(zhǎng)旺盛的pk-15細(xì)胞，使用promegamammaliantransfectionsystem進(jìn)行轉(zhuǎn)染。具體操作方法如下：管1中分別加入20μgprv基因組，10μg轉(zhuǎn)移載體，62μl2mcacl2，最后用滅菌水補(bǔ)充至500μl；管2中加入2×pbs500μl；輕輕搖晃管2，將管1中的液體逐滴加入管2中并充分混勻；混合液體在室溫條件下孵育30分鐘；再次震蕩混勻后，立即逐滴均勻加入細(xì)胞培養(yǎng)皿中，充分混勻，置37℃5％co2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

重組病毒的篩選與噬斑純化：待出現(xiàn)帶有陽(yáng)性熒光信號(hào)的細(xì)胞病變時(shí)，反復(fù)凍融細(xì)胞培養(yǎng)液，4℃4500r/min離心l0min后，吸取上清。將上清液用無(wú)血清無(wú)抗生素的dmem培養(yǎng)基進(jìn)行10倍倍比稀釋。取1ml稀釋度10-2-10-7的病毒液接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中生長(zhǎng)良好的pk-15細(xì)胞單層，37℃5％co2條件下作用1h。用無(wú)血清無(wú)抗生素的dmem培養(yǎng)基洗滌3次。將2％低熔點(diǎn)瓊脂糖加熱融化，并置于37℃水浴鍋中冷卻，同時(shí)將20％2×dmem培養(yǎng)基也置于37℃水浴鍋中，待溫度一致后，按1:1比例混合。每孔加入2ml混合后的瓊脂糖膠，4℃放置10min，待瓊脂糖膠凝固后將細(xì)胞培養(yǎng)板轉(zhuǎn)移至37℃co2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。于倒置熒光顯微鏡下觀察并標(biāo)記出帶有綠色熒光信號(hào)的單個(gè)噬斑，吸取最大稀釋倍數(shù)下呈現(xiàn)綠色熒光信號(hào)的噬斑，將其吹打于1ml無(wú)血清不含抗生素的dmem營(yíng)養(yǎng)液中并進(jìn)行反復(fù)凍融。重復(fù)以上操作，將獲得的噬斑液進(jìn)行多輪噬斑純化。將獲得的重組病毒命名為rprv-gfp-ge-。參照?qǐng)D4a、圖4b為重組病毒在pk-15細(xì)胞上產(chǎn)生的cpe及熒光顯微鏡下觀察到的綠色熒光信號(hào).其中圖4a中可以看出，重組病毒進(jìn)入到pk-15細(xì)胞內(nèi)，表示有活性。

(3)prvge基因缺失株c1201/δge的獲得與純化

提取重組病毒rprv-gfp-ge-的基因組，按照如下體系進(jìn)行cre重組酶處理：2μl10×crebuffer，10μg目標(biāo)dna，5μlcre酶(1ui/μl)，補(bǔ)充超純水至30μl。混勻，置37℃水浴1h，再置70℃處理10min。

提取cre酶處理后的病毒dna，具體操作方法如下：在cre酶處理后的反應(yīng)體系中加入200μl酚：氯仿：異戊醇(25:24:1)抽提2次，離心后取上清；加入500μl預(yù)冷的無(wú)水乙醇，置-20℃沉淀10min，12000rpm/min離心15min，棄上清；加入70％乙醇洗滌沉淀后置溫箱中干燥。所得沉淀溶解于適量te溶液中，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度，置-20℃保存。

在滅菌ep管中加入500μlopti-mem、6μlcre酶處理過(guò)的病毒dna及6μlplus，混勻后靜置5min；再加入12μlltx，混勻后靜置30min。選擇生長(zhǎng)旺盛的vero細(xì)胞。將混合液全部加入細(xì)胞培養(yǎng)液中，置37℃5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。12h后更換5％dmem培養(yǎng)液。觀察cpe，并在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光產(chǎn)生情況，標(biāo)記出cpe明顯但未觀察到明顯熒光信號(hào)的區(qū)域。吸取選定區(qū)域的細(xì)胞，置5％dmem培養(yǎng)液中。將得到的病毒液進(jìn)行噬斑純化，獲得的基因缺失毒株命名為prvc1201/δge。參照?qǐng)D5a-圖5d所示為純化后的prvc1201/δge在vero細(xì)胞上的cpe及間接免疫熒光檢測(cè)結(jié)果。

(4)prvc1201/δge的序列測(cè)定

提取prvc1201/δge的基因組并以之為模板，以ge-lf和ge-rr為引物，進(jìn)行pcr擴(kuò)增。pcr產(chǎn)物純化回收后，連接入pjet1.2/bluntcloningvector并轉(zhuǎn)化trans10感受態(tài)細(xì)胞，pcr鑒定為陽(yáng)性的單克隆菌進(jìn)行序列測(cè)定。測(cè)序結(jié)果顯示，與親本毒株相比，prvc1201/δge的基因缺失區(qū)域包括編碼gi蛋白的us7基因的872-1101位堿基、us7與us8之間的gap區(qū)和編碼ge蛋白的整個(gè)us8基因。

2.遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)：

接種細(xì)胞，克隆純化得來(lái)的毒株為原代，即為p0代。用p0通過(guò)測(cè)序比較6個(gè)代次的基因變化。

結(jié)果顯示，6個(gè)代次病毒的臨床癥狀和病理剖檢差異不顯著。臨床動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果表明，c1201/δge株連續(xù)回歸動(dòng)物，毒性沒(méi)有返強(qiáng)。

與經(jīng)典的自然弱毒株bartha-k61類(lèi)似，偽狂犬病病毒基因缺失株c1201/δge存在大量核苷酸缺失，缺失區(qū)域包括部分gi和全部ge，具體為編碼gi蛋白的us7基因的872-1101位堿基、us7與us8之間的gap區(qū)和編碼ge蛋白的整個(gè)us8基因。該基因缺失株經(jīng)豬體內(nèi)傳代5次后，擴(kuò)增目的序列未發(fā)現(xiàn)任何序列插入。

為進(jìn)一步驗(yàn)證5個(gè)代次的疫苗毒是否發(fā)生變異，對(duì)所擴(kuò)增的pcr產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收，pcr產(chǎn)物直接送測(cè)序公司進(jìn)行正反兩個(gè)方向測(cè)序。結(jié)果顯示，p0病毒與其他各代次正方向的序列同源性在99.9-100％，反方向的序列同源性在99.8-100％。p0代基因缺失株c1201/δge與bartha-k61株相應(yīng)位置的序列比較結(jié)果顯示，3’端的相似性為56.6％，而5’端只有54.5％的相似性，說(shuō)明c1201/δge和bartha-k61株不是同一毒株。p0代病毒正反向測(cè)序的峰圖如圖12和圖13所示，正向測(cè)序的遺傳距離結(jié)果如圖14所示，正向測(cè)序的序列比對(duì)結(jié)果如圖15所示，反向測(cè)序的遺傳距離結(jié)果如圖16所示，反向測(cè)序的序列比對(duì)結(jié)果如圖17所示。

3.滅活免疫效力試驗(yàn)

3.1分組：將試驗(yàn)用斷奶仔豬隨機(jī)分成3個(gè)免疫組(每組5頭)，另外設(shè)置1個(gè)攻毒對(duì)照組(5頭)和1個(gè)空白對(duì)照組(5頭)。

3.2滅活疫苗配制：將滅活前的病毒含量調(diào)整為107.5tcid50/ml，和免疫佐劑5:1配制對(duì)仔豬進(jìn)行免疫。

3.3免疫：將配制好的滅活疫苗按照分組進(jìn)行免疫每頭豬頸部肌肉注射疫苗2ml。

3.5攻毒：于免疫后28日對(duì)3個(gè)免疫組及攻毒對(duì)照組進(jìn)行prvbj-11株強(qiáng)毒(104.0tcid50/ml)攻擊，攻毒方法為：每頭仔豬頸部肌肉注射3.0ml，同時(shí)滴鼻3.0ml?？瞻讓?duì)照組不攻毒。

3.6攻毒后觀察：仔豬攻毒后連續(xù)觀察21日，每日測(cè)量體溫，觀察試驗(yàn)仔豬的食欲、精神狀態(tài)、呼吸困難、拉稀、流涕、死亡及有無(wú)臨床癥狀表現(xiàn)。

3.8判定標(biāo)準(zhǔn)

3.8.1攻毒后發(fā)病判定標(biāo)準(zhǔn)：出現(xiàn)以下第(3)項(xiàng)，或者同時(shí)出現(xiàn)情形(1)和(2)判為發(fā)病。

(1)精神沉郁、食欲減退或出現(xiàn)呼吸困難(含咳嗽、喘氣、張嘴呼吸、腹式呼吸)、流涕、拉??；

(2)體溫≥40.5℃，持續(xù)至少3日；

(3)明顯神經(jīng)癥狀(共濟(jì)失調(diào)、麻痹、四肢亂劃、角弓反張等)或死亡。

4、結(jié)果

4.1疫苗對(duì)斷奶仔豬的免疫效力結(jié)果免疫后28日攻毒，連續(xù)觀察21日，3批疫苗免疫組保護(hù)率大于80％。而未免疫攻毒對(duì)照組仔豬發(fā)病率為5/5(100％)，其中有2頭出現(xiàn)共濟(jì)失調(diào)、麻痹、四肢亂劃等神經(jīng)癥狀；另有1頭豬死亡。空白對(duì)照組無(wú)任何不良反應(yīng)。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖6，測(cè)溫記錄見(jiàn)圖7所示。

參照?qǐng)D8a-圖8f、圖9a-圖9d所示，其中圖8a、圖8c、圖8e分別為肺臟、脾臟、扁桃體的攻毒組，圖8b、圖8d、圖8f為免疫組，圖9a、圖9c分別為攻毒組腦ihc和攻毒組脾ihc，圖9b、圖9d分別為免疫組腦ihc和免疫組脾ihc，剖檢結(jié)果為：攻毒對(duì)照組發(fā)病豬解剖后，肺部有嚴(yán)重的灰白色壞死結(jié)節(jié)、出血、水腫，脾臟有壞死灶，扁桃體出血，腦、脾ihc結(jié)果呈陽(yáng)性。其它免疫豬剖檢肺、脾、扁桃體均沒(méi)有明顯病理變化。

5、結(jié)論

試驗(yàn)結(jié)果表明，該疫苗免疫斷奶仔豬后對(duì)新流行毒株的保護(hù)率不低于80％。斷奶仔豬免疫使用c1201/δge配制的滅活疫苗能抵御豬偽狂犬新流行強(qiáng)毒hb-1201株的攻擊。

以上對(duì)本發(fā)明的較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述。需要理解的是，本發(fā)明并不局限于上述特定實(shí)施方式，其中未盡詳細(xì)描述的設(shè)備和結(jié)構(gòu)應(yīng)該理解為用本領(lǐng)域中的普通方式予以實(shí)施；任何熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明技術(shù)方案范圍情況下，都可利用上述揭示的方法和技術(shù)內(nèi)容對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案做出許多可能的變動(dòng)和修飾，或修改為等同變化的等效實(shí)施例，這并不影響本發(fā)明的實(shí)質(zhì)內(nèi)容。因此，凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案的內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例所做的任何簡(jiǎn)單修改、等同變化及修飾，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案保護(hù)的范圍內(nèi)。

序列表

<110>上海創(chuàng)宏生物科技有限公司

<120>一種豬偽狂犬病毒基因缺失株c1201/δge株及其應(yīng)用

<210>1

<211>2081

<212>dna

<213>pseudorabiesvirus

<400>1

tcgttgccgcgcccgcctcggcgccggcgcacgtcgccccgggtcacgatctgggagtgc60

agggcctccgtccactcgccggcgtggcgccaggagcggttgtggacccgcgcgaacatg120

gcgcgggtcgcctggatcccggcgacgatcacgtccagggcgtcggcgtccgtcagcccg180

ggccggcgccgggtcaggcgcgcgcccgtctgggcgtgggaggctccggcggcggtgctg240

cgggaggcggccaggagcacctggtcgcagaggtcggcggcgcccaggatccacaggtgg300

acgggggccgtgccccgggcccccgagttcaggtactggatcccgttcaggacggacgac360

cactccgtgtccagccgcgggggtgggctgatcctgaggggctccccgggcttcgagccg420

tccgccggggggcgccgcgtcagctcgtgcgtctcggtggtgatgtagaacggcgccgtg480

gggtcggaccgcgtccgcacgacggggcgcacggcgcgcggcagcagggccagcgagccg540

ggggagatctccgaggagcgcagcaccacgtgctgccgcggcgagttctcgtcggcggcg600

cgccgctgctgcaccatcgacgcgtagcaccactcggtgagcaccttccacaggtccggg660

tgcgcctcgcccacgaaggcggggatgcgcccggccccgtccatcagcgtgaccacggtg720

atggccgtcacccccatggtgcgaacgcgctcgcgacaactgcgacggtggaggcggtgg780

agaagaagagtccggcgagagacgggcggaacagagacgcggaggagaggacggctgctg840

tgtgcgcccggacacgccggggcccatttattgtgacaagtccgagtccgtgcccacacc900

acgtggcgcgcccaaccccccgctctctcccccctctcctgggcgcggcggatgggggcg960

ggcccccgctcccggtcgctcgctcgctcgctacacgtgcctggcgacgatgcccccgag1020

tagcgcggacagcgagcagatgaccagcgcggcggcgctgatcgcgacgcccatcaggca1080

gcggcggcgtctccgacgcgccgcctgccggcgtcccacgcggcgcaggaactcgctggg1140

cgtctcgttgtcgctctcgctgtagtagcagtccgagtcgtcctgggggcgcagcgggga1200

gcggggtcccttgggggccagcaggacgtcggcggccgggttcgagacgctcgtcgggac1260

gggggcgctggggtcaaacgtgtccatgtcgacggaggcggcgccgggcatgtcggaatg1320

cgggcggaccggttctcccggtatataacttcgtatagcatacattatacgaagttatcc1380

agcaccatggctatcttcccggggctccgggcgcccgccgtggcgttggcggcggcgagc1440

aggacgcgcgacacgacgctggcgttcagcaccatcgtgccgttcgcgtccagggtcccg1500

ggcgccggggtcagcgtcggcgtcgtcgtctccgcgtcaccctcctcctcctcgtccgat1560

cggggctcgggggtggcgccggtcccccgggggggcgcgggggtcgtcggcggctcgggc1620

tcgggcgggggctgggtggtgaacacggcgtcctcggcggggtccacgacgcgcaggctg1680

tcgtgccacgatccgacgacgggccggcactcgtccgcgggcggcgatgtggggacgggg1740

cgccccctcggcggcaccagggccgtcagcacaaagaggtccgtggtcccgttcacgcgg1800

acccgcagcacgtacgaccccgcgtcccccgaggccgggcgcgagacgaacagcagccgg1860

cgcgcctccaccgcggcggacgcgcgccgggcgagcggctcgcgcttgcgcaggcagccg1920

cggaaggcttcgtggtgcacgcggggggcagaggtcgtactcggcggcgtactcgcgcgt1980

gtagcaggcgcgcttggggtcgaggcgcagcagctccacgcgcccgctgtagttgctcgg2040

cgagggcccctccagaaacagcagcgtcccgtctatcgtca2081