本發(fā)明涉及一株降鈣素原單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株cs12-1及其應(yīng)用，涉及降鈣素原（pct）單克隆抗體的制備方法，以及臨床血清中pct的雙抗體夾心酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法的建立，屬于醫(yī)學(xué)免疫檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
降鈣素原（pct）編碼基因定位于人類第11號(hào)染色體，該基因由6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子組成，總長(zhǎng)7600bp，其中編碼區(qū)長(zhǎng)度為2800bp.基因轉(zhuǎn)錄后在甲狀腺濾泡旁細(xì)胞粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)翻譯成降鈣素原前體，進(jìn)而在內(nèi)源多肽酶的作用下修飾加工，生成116個(gè)氨基酸的終產(chǎn)物pct。pct可由細(xì)胞內(nèi)特殊蛋白酶分解生成降鈣素，這種肽類激素對(duì)人體有重要的調(diào)節(jié)作用。正常情況下，pct在血清中的含量非常低，僅為10~50pg/ml，然而在系統(tǒng)炎癥反應(yīng)綜合癥、敗血癥、急慢性肺炎、急性胰腺炎等細(xì)菌性感染的患者血清中pct水平顯著升高，其濃度可達(dá)正常水平的幾千倍甚至上萬倍，而在局部感染、病毒感染、慢性非特異性炎癥等患者的血清中pct濃度不增加或輕微增加，這就決定了pct相較于其他血清標(biāo)志物而言具有高度的特異性可作為細(xì)菌感染的特異性指標(biāo)，用于細(xì)菌類疾病的鑒別診斷，為醫(yī)生是否使用抗生素提供有價(jià)值的參考。由于pct的濃度和疾病的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，并隨著病情的發(fā)展變化而變化，因此pct又可作為判斷病情與愈后以及療效觀察的可靠指標(biāo)，醫(yī)生可以通過監(jiān)測(cè)pct的變化從而觀察抗生素的治療效果，使患者及時(shí)得到針對(duì)性治療，縮短治療周期、減少治療費(fèi)用，因此早期pct的定量檢測(cè)臨床意義重大。
與其他pct檢測(cè)方法相比，elisa檢測(cè)方法具有較高的敏感性和特異性、成本低、檢測(cè)時(shí)間短、無污染，可在大多數(shù)基層醫(yī)院使用。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供降鈣素原單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株及其應(yīng)用，建立檢測(cè)降鈣素原的雙抗體夾心elisa法。
本發(fā)明的技術(shù)方案：一株降鈣素原特異性單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株cs12-1，已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，簡(jiǎn)稱cgmcc，保藏編號(hào)cgmccno.13082，保藏日期2016年10月31日，分類命名單克隆細(xì)胞株。
降鈣素原特異性單克隆抗體，它由所述保藏編號(hào)為cgmccno.13082的降鈣素原特異性單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株cs12-1分泌產(chǎn)生，命名為6f4。
所述降鈣素原特異性單克隆抗體的應(yīng)用，以細(xì)胞株cs12-1分泌的抗體6f4為包被抗體，抗體6f4標(biāo)記hrp后即6f4-hrp為酶標(biāo)抗體，建立檢測(cè)天然pct的雙抗體夾心elisa法，在制備治療臨床早期細(xì)菌感染的藥物中的應(yīng)用。
提供的pct雜交瘤細(xì)胞株的制備方法基本步驟為：
（1）免疫原的制備：采用碳化二亞胺法，將pct與牛血清蛋白（bsa）偶聯(lián)得到的pct-bsa作為包被抗原。pct-bsa的具體合成步驟如下：稱取5mgbsa，溶于2ml0.1mph7.4磷酸鹽緩沖溶液中，在不斷攪拌下，分別加入1mg1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基-碳二亞胺），5mgpct；室溫下，攪拌反應(yīng)4h即可。
（2）動(dòng)物免疫與效價(jià)測(cè)定：采用小劑量短周期方案免疫健康balb/c雌性小鼠，首次免疫用100μgpct-bsa與等量弗氏完全佐劑混勻后進(jìn)行皮下注射，間隔3周后，再用100μgpct-bsa與等量弗氏不完全佐劑加強(qiáng)免疫，此后每隔3周用半量pct-bsa加強(qiáng)免疫一次；沖刺免疫劑量減半，與等體積的生理鹽水混合后采用腹腔免疫，用pct作為包被抗原，通過直接elisa法檢測(cè)血清效價(jià)；
其具體elisa程序如下：
1)包被：將包被抗原用0.05mph9.6碳酸鹽緩沖液梯度稀釋，100μl/孔，37℃孵育2h；
2)洗滌：將板內(nèi)溶液傾去，每孔注入200μlpbst溶液，置于搖床上振蕩3min，甩干，洗滌3次；以下洗滌方法相同；
3)封閉：拍干后，加入200μl/孔封閉液，37℃孵育2h，洗滌后烘干備用；
4)加樣：將抗血清從1:1000開始梯度稀釋，100μl/孔，37℃孵育30min；充分洗滌后，加入1:3000稀釋的鼠二抗，100μl/孔，37℃孵育30min，洗滌后拍干；
5)顯色：將酶標(biāo)板取出，充分洗滌后，每孔加入100μl的顯色液（tmb與底物液體積比例1:5），37℃避光反應(yīng)15min；
6)終止和測(cè)定：取出酶標(biāo)板，每孔加入50μl終止液（2mol/l的硫酸）終止反應(yīng)，然后用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的吸光值od450nm。
（3）細(xì)胞融合與篩選：在沖擊免疫三天后，按照常規(guī)peg（聚乙二醇，分子量為1450）方法進(jìn)行細(xì)胞融合，具體步驟如下：
a、無菌取小鼠脾臟，研磨并通過200目細(xì)胞篩網(wǎng)得到脾細(xì)胞懸液，并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)；
b、收集sp2/0細(xì)胞，懸浮于rpmi-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)；
c、將脾細(xì)胞和sp2/0細(xì)胞按照10:1（數(shù)量比）的比例混合，離心后用50%peg融合，時(shí)間1min，之后按照從慢到快，加入rpmi-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液，離心后懸浮于含20%胎牛血清、2%的50×hat的rpmi-1640篩選培養(yǎng)液中，加到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，置于37℃、5%co2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在細(xì)胞融合的第三天對(duì)融合細(xì)胞進(jìn)行rpmi-1640篩選培養(yǎng)液半換液，第6天用含20%胎牛血清、1%100×ht的rpmi-1640過渡培養(yǎng)液進(jìn)行全換液，在第9天取細(xì)胞上清進(jìn)行篩選。
篩選：用天然pct作為包被抗原，用直接elisa進(jìn)行檢測(cè)，選取細(xì)胞團(tuán)數(shù)少且陽性高的孔，采用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆，用同樣的方法進(jìn)行檢測(cè)。重復(fù)三次，即得到能穩(wěn)定分泌pct單克隆抗體的細(xì)胞株。
（4）單克隆抗體的制備與鑒定：取8-10周齡balb/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蠟油1ml；7天后每只小鼠腹腔注射1×106雜交瘤細(xì)胞，從第七天開始收集腹水，將腹水通過辛酸-硫酸銨法純化，獲得的單抗置于-20℃保存。
本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明獲得了能夠分泌pct單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，建立了檢測(cè)天然pct的雙抗體夾心elisa法，在制備治療臨床早期細(xì)菌感染的藥物中的應(yīng)用。
生物材料樣品保藏：降鈣素原特異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株cs12-1，已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，簡(jiǎn)稱cgmcc，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)為cgmccno.13082，保藏日期2016年10月31日，分類命名單克隆細(xì)胞株。
附圖說明
圖1是本發(fā)明獲得的pct檢測(cè)曲線方程y=0.5876+0.06x(r2=0.9898)的示意圖。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明下面的實(shí)施例僅作為本發(fā)明內(nèi)容的進(jìn)一步說明，不能作為本發(fā)明的限定內(nèi)容或范圍。下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
本發(fā)明通過將完全抗原免疫小鼠，通過細(xì)胞融合，hat選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)，通過直接elisa篩選細(xì)胞上清，將篩選得到的效價(jià)高的降鈣素原細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)，并經(jīng)過腹水制備以及純化，并用雙抗體夾心法兩兩配對(duì)，最終建立了pct的雙抗體夾心elisa檢測(cè)方法。
實(shí)施例1檢測(cè)pct的雙抗體夾心elisa方法的建立
1、免疫原的制備：采用碳化二亞胺法，將pct與牛血清蛋白（bsa）偶聯(lián)得到的pct-bsa作為包被抗原。
pct-bsa的具體合成步驟如下：稱取5mgbsa，溶于2ml0.1mph7.4磷酸鹽緩沖溶液中，在不斷攪拌下，分別加入1mg1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基-碳二亞胺），5mgpct；室溫下，攪拌反應(yīng)4h即可。
2、動(dòng)物免疫：采用小劑量短周期方案免疫健康balb/c雌性小鼠，首次免疫用100μgpct-bsa與等量弗氏完全佐劑混勻后進(jìn)行皮下注射，間隔3周后，再用100μgpct-bsa與等量弗氏不完全佐劑加強(qiáng)免疫，此后每隔3周用半量pct-bsa加強(qiáng)免疫一次；沖刺免疫劑量減半，與等體積的生理鹽水混合后采用腹腔免疫，用pct作為包被抗原，通過直接elisa法檢測(cè)血清效價(jià)；
其具體elisa程序如下：
（1）包被：將包被抗原用0.05mph9.6碳酸鹽緩沖液梯度稀釋，100μl/孔，37℃孵育2h；
（2）洗滌：將板內(nèi)溶液傾去，每孔注入200μlpbst溶液，置于搖床上振蕩3min，甩干，洗滌3次；以下洗滌方法相同；
（3）封閉：拍干后，加入200μl/孔封閉液，37℃孵育2h，洗滌后烘干備用；
（4）加樣：將抗血清從1:1000開始梯度稀釋，100μl/孔，37℃孵育30min；充分洗滌后，加入1:3000稀釋的鼠二抗，100μl/孔，37℃孵育30min，洗滌后拍干；
（5）顯色：將酶標(biāo)板取出，充分洗滌后，每孔加入100μl的顯色液（tmb與底物液體積比例1:5），37℃避光反應(yīng)15min；
（6）終止和測(cè)定：取出酶標(biāo)板，每孔加入50μl終止液（2mol/l的硫酸）終止反應(yīng)，然后用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的吸光值od450nm。
3、細(xì)胞融合：在沖擊免疫三天后，按照常規(guī)peg（聚乙二醇，分子量為1450）方法進(jìn)行細(xì)胞融合，具體步驟如下：
（1）無菌取小鼠脾臟，研磨并通過200目細(xì)胞篩網(wǎng)得到脾細(xì)胞懸液，并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)；
（2）收集sp2/0細(xì)胞，懸浮于rpmi-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)；
（3）將脾細(xì)胞和sp2/0細(xì)胞按照10:1（數(shù)量比）的比例混合，離心后用50%peg融合，時(shí)間1min，之后按照從慢到快，加入rpmi-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液，離心后懸浮于含20%胎牛血清、2%的50×hat的rpmi-1640篩選培養(yǎng)液中，加到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，置于37℃、5%co2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
4、細(xì)胞篩選與細(xì)胞株建立：在細(xì)胞融合的第三天對(duì)融合細(xì)胞進(jìn)行rpmi-1640篩選培養(yǎng)液半換液，第6天用含20%胎牛血清、1%的100×ht的rpmi-1640過渡培養(yǎng)液進(jìn)行全換液，在第9天取細(xì)胞上清進(jìn)行篩選。
篩選：用天然pct作為包被抗原，用直接elisa進(jìn)行檢測(cè)，選取細(xì)胞團(tuán)數(shù)少且陽性高的孔，采用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆，用同樣的方法進(jìn)行檢測(cè)。重復(fù)三次，即可得到能穩(wěn)定分泌pct單克隆抗體的細(xì)胞株。
5、單克隆抗體的制備與鑒定：取8～10周齡balb/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蠟油1ml；7天后每只小鼠腹腔注射1×106雜交瘤細(xì)胞，從第七天開始收集腹水，將腹水通過辛酸-硫酸銨法純化，獲得的單抗6f4置于-20℃保存。
6、雙抗體夾心elisa的建立：
1）包被：用濃度為2μg/ml的細(xì)胞株編號(hào)為cs12-1的抗體6f4包被酶標(biāo)板，100μl/孔，4℃過夜；
2）洗滌：用pbst洗滌反應(yīng)板三次，每次3min，200μl/孔，然后甩干反應(yīng)板；
3）封閉：含0.2%pvp的碳酸鹽緩沖液，200μl/孔，37℃封閉2h；
4）洗滌：同2）；
5）樣品：用pbst將天然pct稀釋成1μg/ml，再三倍進(jìn)行梯度稀釋；另設(shè)一個(gè)pbst空白對(duì)照。每孔加入100μl樣品，于37℃溫育1h；
6）洗滌：同2）；
7）加酶標(biāo)抗體(6f4-hrp，3μg/ml)，100μl/孔，37℃反應(yīng)1h；
8）洗滌：同2）；
9）顯色：加底物tmb100μl/孔，顯色10min；
10）終止：加終止液50μl/孔；
11）測(cè)定：用酶標(biāo)儀檢測(cè)od450nm。
試驗(yàn)結(jié)果如下：
本發(fā)明所獲得的pct檢測(cè)曲線方程為y=0.5876+0.06x(r2=0.9898)，具體請(qǐng)見圖1。
綜上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非用來限定本發(fā)明的實(shí)施范圍。即凡依本發(fā)明專利范圍的內(nèi)容所作的等效變化與修飾，都應(yīng)為本發(fā)明的技術(shù)范疇。