本發(fā)明屬于藥用植物基因工程領(lǐng)域，主要涉及丹參酮代謝途徑相關(guān)細(xì)胞色素P450基因CYP76AH12的篩選，鑒定及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

次生代謝產(chǎn)物是藥用植物生物活性成分的主要來源。近年來，藥用植物基因組學(xué)研究的快速發(fā)展為次生代謝產(chǎn)物合成相關(guān)基因的發(fā)掘與鑒定奠定了前期研究基礎(chǔ)。次生代謝產(chǎn)物合成相關(guān)基因的克隆及功能驗證將為天然產(chǎn)物的代謝工程和合成生物學(xué)研究提供必需的生物元件，同時將也為藥用植物的選種育種及品質(zhì)改良提供指導(dǎo)。

丹參(Salvia miltiorrhiza Bunge)為唇形科鼠尾草屬多年生草本植物，具有活血通經(jīng)，祛疲止痛，清心除煩等功效。丹參酮為二萜醌類化合物，是丹參的主要脂溶性活性成分，主要包括丹參酮IIA、丹參酮IIB、丹參酮I、隱丹參酮、二氫丹參酮、異隱丹參酮等，具有擴(kuò)張血管、抗腫瘤、抗菌消炎以及抗血栓、抗氧化等多種藥理作用。目前研究認(rèn)為丹參酮的合成途徑可分為三步：第一步合成萜類的前體物質(zhì)，第二步形成丹參酮骨架結(jié)構(gòu)，第三步對丹參酮骨架結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，包括氧化、甲基化、芳香化等修飾。根據(jù)丹參酮合成途徑推測，細(xì)胞色素P450是參與丹參酮骨架結(jié)構(gòu)修飾的主要酶類。

細(xì)胞色素P450在生物界中廣泛存在，其為含血紅素的膜蛋白，具有單加氧酶活性。細(xì)胞色素P450可催化多種類型的反應(yīng)，主要包括羥基化、環(huán)氧化、異構(gòu)化、脫烷基化、脫硫、脫鹵、脫氫作用等。盡管細(xì)胞色素P450可催化多種類型的反應(yīng)，但卻具有相同的催化機制，即通過NADPH或者NADH為細(xì)胞色素P450傳遞電子，激活氧分子，將其中的一個氧插入到底物上，同時生成一分子水。近年來利用異源表達(dá)及RNA干擾等技術(shù)相繼在黃花蒿、長春花、人參等多種藥用植物中鑒定出參與次生代謝途徑的細(xì)胞色素P450。

本發(fā)明通過基因篩選，異源表達(dá)，酶活性檢測等技術(shù)對一個丹參的P450進(jìn)行了功能鑒定，該酶可以在鐵銹醇及其衍生物的7位加一個羰基，依據(jù)細(xì)胞色素P450基因命名法則命名為CYP76AH12，該基因可應(yīng)用于二萜類化合物的生物合成與調(diào)控及丹參育種。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一個參與丹參酮合成途徑的細(xì)胞色素P450基因CYP76AH12，其編碼的蛋白能在鐵銹醇及其衍生物的7位加一個羰基。

本發(fā)明提供了一個與丹參酮類化合物合成代謝有關(guān)的基因：CYP76AH12，它是下列核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID No.1所示的cDNA序列；或

2)SEQ ID No.1所示的核苷酸序列經(jīng)取代、缺失或增加一個或多個核苷酸，且表達(dá)相同功能蛋白質(zhì)的核苷酸序列：或

3)在嚴(yán)格條件下與SEQ ID No.1所示序列雜交的核苷酸序列；所述嚴(yán)格條件為：在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下雜交，并用該溶液洗膜。

一種由上述基因編碼的蛋白質(zhì)，其特征為：

i)具有序列表中SEQ ID No.2的氨基酸殘基序列；或

ii)SEQ ID No.2所示氨基酸序列經(jīng)取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸產(chǎn)生的具有相同功能的蛋白。

本發(fā)明SEQ ID No.1的DNA序列由1494個堿基組成，編碼序列表SEQ ID No.2中的蛋白質(zhì)由497個氨基酸殘基組成。

含有本發(fā)明基因的表達(dá)載體、細(xì)胞系、轉(zhuǎn)基因植株及宿主菌和使用該基因在調(diào)節(jié)和生產(chǎn)植物二萜類化合物及丹參育種中的應(yīng)用也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。將SEQ ID No.1所示基因克隆到表達(dá)載體pYES2-URA(pYES2)的BamHI和EcoRI兩個限制性內(nèi)切酶之間，構(gòu)建帶有CYP76AH12基因的重組表達(dá)載體pYES2-CYP76AH12；轉(zhuǎn)化釀酒酵母菌株WAT11，半乳糖誘導(dǎo)基因表達(dá)，并在培養(yǎng)液中加入底物鐵銹醇或其衍生物。誘導(dǎo)24小時后用正己烷對其表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行提取并進(jìn)行GC-MS分析。分析結(jié)果表明CYP76AH12可以在鐵銹醇或其衍生物的7位加一個羰基。

本發(fā)明還提供用于PCR擴(kuò)增所述CYP76AH12編碼基因cDNA序列的特異性引物對，包括：

正向引物：ATGGATTCCTTCTTCTTAT

反向引物：TTAAATTTTAAATGGAATA

附圖說明

圖1 CYP76AH12基因編碼蛋白催化鐵銹醇酶促反應(yīng)產(chǎn)物的GC-MS分析結(jié)果(色譜圖)

圖2 CYP76AH12基因編碼蛋白催化鐵銹醇酶促反應(yīng)產(chǎn)物和標(biāo)準(zhǔn)品柳杉酚的質(zhì)譜圖

圖3 CYP76AH12基因編碼蛋白催化鐵銹醇至柳杉酚的圖示

具體實施方式

以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例均按照常規(guī)實驗條件，如Sambrook等分子克隆實驗手冊(Sambrook J&Russell DW，Molecular cloning：a laboratory manual，2001)，或按照制造廠商說明書建議的條件。

實施例1丹參中細(xì)胞色素P450基因的克隆

1、根據(jù)已測序的丹參BAC(bacterial artificial chromosome)數(shù)據(jù)，通過拼接、注釋、篩選等操作，獲得丹參酮合成途徑中的候選細(xì)胞色素P450基因cDNA序列。

2、使用引物設(shè)計軟件Lasergene PrimerSelect設(shè)計該候選細(xì)胞色素P450基因的引物，引物序列為：

正向引物：ATGGATTCCTTCTTCTTAT

反向引物：TTAAATTTTAAATGGAATA

引物由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。

3、取生長旺盛的丹參植株葉片，使用QIAGENMini試劑盒提取總RNA，利用PROMEGA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲得eDNA，以cDNA為模板擴(kuò)增CYP76AH12的基因序列。

4、瓊脂糖凝膠電泳在1500bp處出現(xiàn)特異性條帶，對目標(biāo)條帶進(jìn)行切膠回收，膠回收產(chǎn)物連接到pMD18T載體(TaKaRa)，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，挑取陽性克隆進(jìn)行測序(北京農(nóng)業(yè)科學(xué)院測序中心)，選擇和保存序列正確的CYP76AH12基因克隆用于后續(xù)表達(dá)載體的構(gòu)建。

實施例2、CYP76AH12基因序列的生物信息學(xué)

本發(fā)明涉及的丹參二萜合成代謝途徑細(xì)胞色素P450基因CYP76AH12，該基因全長開放讀碼框(ORF)的長度為1494核苷酸，編碼497個氨基酸，詳細(xì)序列見序列表中的SEQ ID No.1和SEQ ID No.2。將CYP76AH12全長開放讀碼框用BLAST程序在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源性檢索，該基因在氨基酸水平上比對分析顯示，丹參CYP76AH12基因編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列與其它物種的同源性較低。

實施例3、CYP76AH12基因真核表達(dá)及功能分析

1、酵母表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)基因CYP76AH12的編碼序列及酶切位點分析結(jié)果，對CYP76AH12設(shè)計帶有BamHI和EcoRI酶切位點的引物，用帶酶切位點的引物對CYP76AH12的ORF進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物連接到pMD18T后進(jìn)行測序驗證，最后通過酶切的方法將目的基因CYP76AH12連接到酵母表達(dá)載體pYES2上，通過測序確定載體pYES2-CYP76AH12的正確性。

2、酵母轉(zhuǎn)化

利用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將pYES2-CYP76AH12載體轉(zhuǎn)入釀酒酵母菌株WAT11中，通過菌落PCR法挑選陽性克隆。

3、誘導(dǎo)表達(dá)

挑取陽性單克隆接種于5ml SD液體培養(yǎng)基中，30℃，200rmin^-1培養(yǎng)24h；按照1∶50的接種量接入50ml SD液體培養(yǎng)基中，30℃，200rmin^-1，培養(yǎng)2-4h至對數(shù)中期，2000g離心去上清，用去離子水洗滌菌體兩次后轉(zhuǎn)接入含半乳糖的SD誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，30℃，200rmin^-1，誘導(dǎo)兩小時后加入鐵銹醇作為底物，繼續(xù)培養(yǎng)24h。

4、催化產(chǎn)物的提取與鑒定

加入等體積正己烷對催化產(chǎn)物進(jìn)行渦旋提取。提取的產(chǎn)物進(jìn)行GC-MS分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)含有CYP76AH12基因重組表達(dá)載體pYES2-CYP76AH12的催化組與含空載pYES2對照組相比有新物質(zhì)產(chǎn)生，經(jīng)分析顯示該新產(chǎn)物為柳杉酚。