轉(zhuǎn)AtMYC2基因提高丹參毛狀根中丹參酮和丹酚酸含量的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種轉(zhuǎn)AtMYC2基因提高丹參毛狀根中丹參酮和丹酚酸含量的方法， 屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 心腦血管疾病是目前威脅全人類健康與生命的"頭號(hào)殺手"。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界每年 大約有1700萬(wàn)人死于心腦血管疾病，約占全球總死亡人數(shù)的1/3 ;我國(guó)每年大約有300萬(wàn) 人死于心腦血管疾病。因此積極研宄高效、低毒和廉價(jià)的治療心腦血管疾病的臨床藥物對(duì) 提高人類健康水平具有十分深遠(yuǎn)的意義。
[0003] 丹參（Salvia miltiorrhiza Bunge)是唇形科（Lamiaceae)鼠尾草屬（Salvia)多 年生草本植物，其根色紅形狀似參而得名"丹參"，是臨床治療心、腦血管疾病的常用中藥。 丹參有效成分主要包括脂溶性丹參酮類成分和水溶性酚酸類成分，其中丹參酮在抗氧化、 消炎抑菌及抗腫瘤等方面具有顯著療效，還具有抑制血小板聚集，提高耐缺氧能力，改善冠 狀動(dòng)脈供血等藥理作用；丹酚酸具有抗肝纖維化、抗動(dòng)脈粥樣硬化、改善記憶功能障礙等藥 理作用，臨床應(yīng)用潛力十分巨大。除用于醫(yī)藥行業(yè)（復(fù)方丹參滴丸、丹參注射液、復(fù)方丹參 含片等）以外，開始滲透到保健品行業(yè)（丹參茶等）、化妝品行業(yè)等其他領(lǐng)域中，具有廣闊的 應(yīng)用前景。而目前丹參酮、丹酚酸主要依賴于從丹參中提取獲得。然而由于丹參長(zhǎng)期栽培 品質(zhì)退化嚴(yán)重；活性成分含量降低；且生長(zhǎng)周期長(zhǎng)及受栽培區(qū)域和環(huán)境等因素制約。因此， 為了緩解具有重要臨床需求的丹參酮和丹酚酸藥源的緊缺性問題，發(fā)明一種可同時(shí)提高丹 參酮和丹酚酸含量的新方法。
[0004] 已有技術(shù)表明，擬南芥中bHLH類轉(zhuǎn)錄因子MYC2 (AtMYC2)在調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育 等過程中具有重要作用。但擬南芥中并不產(chǎn)生丹參酮和丹酚酸類物質(zhì)，AtMYC2是否對(duì)丹參 酮和丹酚酸的合成具有促進(jìn)作用尚未見公開報(bào)道。
[0005] 本發(fā)明利用基因工程手段，將擬南芥轉(zhuǎn)錄因子基因 AtMYC2遺傳轉(zhuǎn)化丹參葉片獲 得AtMYC2過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因丹參毛狀根，同時(shí)上調(diào)丹參酮和丹酚酸的生物合成，獲得丹參酮 和丹酚酸均高產(chǎn)的丹參毛狀根株系，為商業(yè)化生產(chǎn)丹參酮和丹酚酸提供新型優(yōu)質(zhì)藥源。目 前尚未發(fā)現(xiàn)與本發(fā)明主題所提及的AtMYC2基因過表達(dá)策略提高丹參毛狀根丹參酮和丹酚 酸含量的相關(guān)報(bào)道。因此，本發(fā)明在實(shí)際解決丹參酮和丹酚酸藥源緊缺性的問題上具有積 極意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的就是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷而提供一種轉(zhuǎn)AtMYC2基因 提高丹參毛狀根中丹參酮和丹酚酸含量的方法。
[0007] 本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)：
[0008] 本發(fā)明從擬南芥中分離克隆出1872bp的AtMYC2基因，構(gòu)建植物表達(dá)載體，以發(fā)根 農(nóng)桿菌C58C1為介導(dǎo)，遺傳轉(zhuǎn)化丹參葉片獲得毛狀根；PCR檢測(cè)目的基因 AtMYC2的整合情 況；qRT-PCR分析插入目的基因 AtMYC2及丹參酮和丹酚酸生物合成相關(guān)基因在毛狀根中的 表達(dá)情況；高效液相色譜測(cè)定轉(zhuǎn)基因毛狀根中丹參酮和丹酚酸的含量；DPPH清除自由基實(shí) 驗(yàn)測(cè)定轉(zhuǎn)基因丹參毛狀根中丹參酮的抗氧化活性。
[0009] -種轉(zhuǎn)AtMYC2基因提高丹參毛狀根中丹參酮和丹酚酸含量的方法，包括以下步 驟：
[0010] (1)采用基因克隆方法從擬南芥中克隆獲得轉(zhuǎn)錄因子基因 AtMYC2,所述AtMYC2基 因序列為SEQ ID: 1的DNA序列；
[0011] ⑵把AtMYC2基因可操作性地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成含AtMYC2基因的植物表達(dá) 載體；
[0012] (3)將含AtMYC2基因的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化發(fā)根農(nóng)桿菌，獲得用于轉(zhuǎn)化丹參的含 AtMYC2基因植物表達(dá)載體的發(fā)根農(nóng)桿菌菌株；
[0013] (4)利用所構(gòu)建的發(fā)根農(nóng)桿菌菌株遺傳轉(zhuǎn)化丹參葉片，獲得經(jīng)PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的 轉(zhuǎn)基因毛狀根克隆；
[0014] (5)定量RT-PCR測(cè)定丹參轉(zhuǎn)基因毛狀根中AtMYC2基因及丹參酮和丹酚酸生物合 成相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量；
[0015] (6)高效液相色譜法測(cè)定丹參轉(zhuǎn)AtMYC2基因毛狀根中丹參酮和丹酚酸含量，篩選 丹參酮和丹酚酸含量顯著提高的丹參轉(zhuǎn)基因毛狀根株系；
[0016] (7) DPPH清除自由基法測(cè)定丹參轉(zhuǎn)AtMYC2基因毛狀根中丹參酮的抗氧化活性。
[0017] 作為優(yōu)選，所述的發(fā)根農(nóng)桿菌選自菌株C58C1。
[0018] 步驟⑷所述的PCR檢測(cè)方法如下：
[0019] (4. 1)分別設(shè)計(jì)發(fā)根位點(diǎn)基因 BrolB、卡那霉素抗性基因 kan的特異PCR引物；
[0020] (4. 2)啟動(dòng)插入基因 AtMYC2表達(dá)的組成型啟動(dòng)子為CaMV35S啟動(dòng)子；
[0021] (4. 3)插入基因內(nèi)部及NOS終止子內(nèi)部設(shè)計(jì)上游及下游特異性引物，進(jìn)行DNA擴(kuò) 增；
[0022] (4. 4)紫外線下觀察目的條帶株系，出現(xiàn)目的條帶則為陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因丹參毛狀根株 系。
[0023] 步驟（5)所述定量RT-PCR檢測(cè)方法如下：
[0024] (5. 1)對(duì)PCR鑒定為陽(yáng)性的毛狀根克隆進(jìn)行總RNA的提取，統(tǒng)一定量到0. 5 μ g RNA 反轉(zhuǎn)錄成25 μ 1體系的cDNA ;
[0025] (5. 2)分別設(shè)計(jì)插入目的基因及看家基因 Actin的引物，以相同量的cDNA為模板 進(jìn)行定量RT-PCR分析；
[0026] (5. 3)分析基因 AtMYC2及丹參酮和丹酚酸生物合成相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量情況。
[0027] 步驟（6)所述的高效液相色譜法如下：
[0028] (6. 1)丹參酮：色譜柱C-18反相硅膠柱，流動(dòng)相為體積比65 :35的乙腈和水；檢測(cè) 波長(zhǎng)220nm，柱溫30°C，流速lml/min，進(jìn)樣量20 μ 1 ;
[0029] (6. 2)丹酚酸：色譜柱C-18反相硅膠柱，流動(dòng)相為體積比30 :70的乙腈和水，并用 磷酸調(diào)節(jié)pH至2. 03 ;檢測(cè)波長(zhǎng)281nm，柱溫35°C，流速lml/min，進(jìn)樣量20 μ 1。
[0030] 步驟（7)中，丹參酮和丹酚酸的抗氧化活性的測(cè)定方法為：
[0031] (7. 1)丹參轉(zhuǎn)AtMYC2基因毛狀根中提取丹參酮及丹酚酸；
[0032] (7. 2)將步驟（7. 1)所得樣品稀釋為濃度梯度：0· 25 μ g/ml、0. 5 μ g/ml、l μ g/ml， 2 μ g/ml，4 μ g/ml的甲醇溶液各Iml ;
[0033] (7· 3)取步驟（7· 2)所得溶液200 μ I，分別加入800 μ I 0· ImM的DPPH溶液，充分 混勻；
[0034] (7. 4)步驟（7. 3)所得產(chǎn)物25°C下暗室放置30min ;
[0035] (7. 5)將步驟（7. 4)產(chǎn)物在分光光度計(jì)下517nm處測(cè)吸收值；
[0036] 其中，DPPH 自由基清除率（％) = [(Aq-A1VAqX 100]，
[0037] 式中，Atl是對(duì)照樣品（DPPH)的吸光度值；A 1是樣品或標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值。
[0038] 本發(fā)明綜合應(yīng)用生物學(xué)和基因技術(shù)方法如載體構(gòu)建、遺傳轉(zhuǎn)化、分子檢測(cè)、定量 qRT-PCR分析、丹參酮和丹酚酸的提取及含量測(cè)定等，發(fā)明了一種利用擬南芥AtMYC2轉(zhuǎn)錄 子同時(shí)提高丹參中兩大類活性成分丹參酮和丹酚酸的方法。本發(fā)明獲得的過表達(dá)AtMYC2 轉(zhuǎn)基因丹參毛狀根中總丹參酮（二氫丹參酮、隱丹參酮、丹參酮I、丹參酮IIA)含量顯著提 高，其中丹參酮含量最高株系為14. 06mg/g DW，是對(duì)照組（2. 18mg/g DW)的6. 45倍；同時(shí) 該株系丹酚酸含量為95.90mg/g DW，是對(duì)照組（22. 32mg/g DW)的4. 30倍。本發(fā)明為商業(yè) 化大量生產(chǎn)丹參酮和和丹酚酸及降低藥品價(jià)格提供了可能，也為大量生產(chǎn)丹參酮和丹酚酸 臨床藥物的大量需求提供了重要來源。
[0039] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：
[0040] 1、可同時(shí)顯著提高丹參毛狀根中總丹參酮和丹酚酸的含量。
[0041] 2、發(fā)明方法效果可靠。
[0042] 3、獲取丹參酮和丹酚酸的成本低。
[0043] 4、生產(chǎn)過程無(wú)環(huán)境污染。
【附圖說明】
[0044] 圖 1 為 pCAMBIA2300+: : AtMYC2 載體構(gòu)建示意圖。
[0045] 圖2為轉(zhuǎn)基因毛狀根的PCR鑒定結(jié)果圖。圖2上方為AtMYC2基因的PCR檢 測(cè)，下方為毛狀根rolB基因鑒定圖。M，DL-2000 Marker(100 - 2,000bp) ;PC，陽(yáng)性對(duì)照 (pCAMBIA2300+::AtMYC2質(zhì)粒為模板）；NC，陰性對(duì)照（空農(nóng)桿菌C58C1遺傳轉(zhuǎn)化丹參獲得 的毛狀根）。
[0046] 圖3-1為AtMYC2在轉(zhuǎn)基因丹參毛狀根中的表達(dá)分析結(jié)果圖；
[0047] 圖3-2為丹參酮生物合成相關(guān)基因的表達(dá)分析結(jié)果圖；
[0048] 圖3-3為丹酷酸生物合成相關(guān)基因的表達(dá)分析結(jié)果圖；Empty vector是空載體 PCAMBIA2300+遺傳轉(zhuǎn)化丹參獲得的毛狀根。
[0049] 圖4-1為AtMYC2轉(zhuǎn)基因丹參毛狀根中丹參酮的含量檢測(cè)結(jié)果圖；其中DH-TI為二 氫丹參酮，CT為隱丹參酮，T-I為丹參酮I，T-IIA為丹參酮IIA，TT為總丹參酮含量。
[0050] 圖4-2為AtMYC2轉(zhuǎn)基因丹參毛狀根中丹酚酸的含量檢測(cè)結(jié)果圖；其中CA為咖啡 酸，RA為迷迭香酸，SA A為丹酷酸A, SA B為丹酷酸B, TS為總丹酷酸，Empty vector是空 載體PCAMBIA2300+遺傳轉(zhuǎn)化丹參獲得的毛狀根。
【具體實(shí)施方式】
[0051] 下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0052] 下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆 (Sambrook等）中所述的條件，或按照制造廠商所提供的試劑或試劑盒所附帶的說明書建 議的條件。
[0053] 實(shí)施例1
[0054] 擬南芥AtMYC2基因的克隆
[0055] I. 1.擬南芥總RNA的提取
[0056] 取少量擬南芥幼嫩葉片，用液氮速凍后，迅速用研缽研碎，然后按照TIANGEN公司 提供的RNAprep Pure Plant Kit使用說明書提取總RNA。用普通瓊脂糖凝膠電泳（電泳條 件：膠濃度1. 2% ;0. 5 X TBE電泳緩沖液；150v，15min)檢測(cè)RNA的完整性。用Nano Drop 2000c超微量分光光度計(jì)檢測(cè)其純度和濃度。
[0057] 1. 2.擬南芥AtMYC2基因的克隆
[0058] 以所獲的0. 5 μ g擬南芥總RNA為起始量，用反轉(zhuǎn)錄酶XL (AMV)進(jìn)行第一鏈cDNA的 合成（操作步驟參照Promega公司提供的相關(guān)說明書）。根據(jù)所述AtMYC2基因的編碼序列 (SEQ ID NO. 1)，設(shè)計(jì)擴(kuò)增出完整編碼框的上下游引物，并在上游和下游引物上分別引入限 制性內(nèi)切酶位點(diǎn)（這可視選用的載體而定），以便構(gòu)建表達(dá)載體。以所述的第一鏈cDNA為 模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后進(jìn)行測(cè)序。DNA序列測(cè)定由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。 測(cè)序結(jié)果表明，所克隆的序列與在NCBI上公布的AtMYC2編碼序列（SEQ ID: 1)完全一致。
[0059] 實(shí)施例2
[0060] 含擬南芥AtMYC2基因的植物過表達(dá)載體的構(gòu)建
[0061] 載體構(gòu)建模式圖見圖1。以PCAMBIA2300+為中間表達(dá)載體，用從擬南芥克 隆的At