BCR?ABL抑制劑抗性相關突變的檢測方法及使用該檢測方法用于預測BCR?ABL抑制劑抗性的數據獲得方法與流程

文檔序號：11528850閱讀：369來源：國知局

本發(fā)明涉及一種慢性髓細胞性白血病等中的bcr-abl抑制劑抗性相關突變的檢測方法和使用該檢測方法用于預測bcr-abl抑制劑抗性的數據獲得方法。

背景技術：

慢性髓細胞性白血病(cml)在幾乎所有的病例中可確認到稱為ph染色體(費城染色體)的基因突變。ph染色體的9號染色體與22號染色體的各自長臂發(fā)生易位。由于該易位，22號染色體上的bcr(breakpointclusterregion，斷裂點集簇區(qū))與9號染色體的abl基因區(qū)域重疊而產生bcr-abl融合(嵌合)基因。該融合基因所編碼的融合蛋白bcr-abl使酪氨酸激酶活性持續(xù)性亢進，是導致慢性髓細胞性白血病發(fā)生的根本原因。

另一方面，以伊馬替尼(imatinib)為代表的bcr-abl抑制劑目前作為融合蛋白bcr-abl的分子靶向治療藥物，用作針對慢性髓細胞性白血病(cml)、ph染色體陽性急性淋巴細胞白血病(ph+all)、kit(cd117)陽性胃腸道間質瘤(gist)的治療藥物。但是，對于bcr-abl抑制劑治療，已知雖然在慢性髓細胞性白血病的進展期很多患者有良好應答，bcr-abl融合基因的表達量減少，但如果治療中在bcr-abl融合基因中發(fā)生突變，則表現出治療抗性。該突變的例子，作為表現出伊馬替尼治療抗性的突變，可舉出253位酪氨酸(野生型)突變?yōu)楸奖彼峄蚪M氨酸(突變型)、255位谷氨酸(野生型)突變?yōu)橘嚢彼峄蚶i氨酸(突變型)、315位酪氨酸(野生型)突變?yōu)楫惲涟彼?突變型)(非專利文獻1)。

根據非專利文獻1，顯示出上述突變中除了315位酪氨酸(野生型)突變?yōu)楫惲涟彼?突變型)之外的bcr-abl激酶結構域(kinasedomain)的突變對作為bcr-abl抑制劑的尼洛替尼(nilotinib)及達沙替尼(dasatinib)表現出敏感性，如果能對與bcr-abl抑制劑抗性相關的bcr-abl激酶結構域有無突變進行一次性評價，則能夠采取包括治療策略的制定及治療方法的變更在內的對策。因此，需要對與上述的bcr-abl抑制劑抗性相關的突變進行簡單準確地檢測。

現有技術文獻

非專利文獻

非專利文獻1：o'haret、eideca、deiningermw.bcr-ablkinasedomainmutations,drugresistance,andtheroadtoacureforchronicmyeloidleukemia.blood2007；110:2242-2249.

技術實現要素：

發(fā)明所要解決的問題

但是，由于從受試者采集的生物樣品中表達bcr-abl融合基因的細胞與沒發(fā)生上述易位但表達abl基因的(正常)細胞混合存在，因此在對與bcr-abl抑制劑抗性相關的突變進行檢測時，有時對生物樣品中所含有的來源于(正常)細胞的9號染色體上的abl激酶結構域所存在的該突變也進行檢測，由于該abl激酶結構域的上述突變并不直接有助于bcr-abl抑制劑抗性，因此存在著對與bcr-abl抑制劑抗性相關的突變不能準確地進行檢測的問題。所以，本發(fā)明目的在于提供能夠對慢性髓細胞性白血病等中與bcr-abl抑制劑抗性相關的突變進行更高精度地檢測的bcr-abl抑制劑抗性相關突變的檢測方法，以及使用該檢測方法用于預測bcr-abl抑制劑抗性的數據獲得方法。

解決問題的技術方案

本發(fā)明人為了解決上述問題進行了專心研究，結果發(fā)現，通過對由易位而產生的bcr-abl融合基因進行特異性擴增，并對擴增的核酸中所含有的與bcr-abl抑制劑抗性相關的突變進行檢測，能夠特異性檢測該突變，從而完成了本發(fā)明。

本發(fā)明包含以下內容。

(1)一種bcr-abl抑制劑抗性相關突變的檢測方法，其包括如下步驟：

使用從受試者采集的生物樣品，對包括bcr-abl融合基因中所含有的融合位點和與bcr-abl抑制劑抗性相關的突變位點的區(qū)域進行擴增的步驟，

使用在上述步驟擴增的核酸，對所述與bcr-abl抑制劑抗性相關的突變位點的基因型進行確定的步驟。

(2)如(1)所述的bcr-abl抑制劑抗性相關突變的檢測方法，其特征在于，在確定所述基因型的步驟中，對于所述突變位點使用對應于野生型的野生型探針和對應于突變型的突變型探針，計算所述擴增的核酸中所含有的野生型和/或突變型的豐度比。

(3)如(2)所述的bcr-abl抑制劑抗性相關突變的檢測方法，其特征在于，所述豐度比為：以與所述野生型探針特異性雜交的核酸量和與所述突變型探針特異性雜交的核酸量作為總量，將與所述野生型探針特異性雜交的核酸量相對于該總量的比作為野生型的豐度比，將與所述突變型探針特異性雜交的核酸量相對于該總量的比作為突變型的豐度比。

(4)如(2)所述的bcr-abl抑制劑抗性相關突變的檢測方法，其特征在于，所述豐度比為：將與所述野生型探針特異性雜交的核酸量相對于使用在所述突變位點以外與所述擴增的核酸特異性雜交的探針測定的核酸量的比作為野生型的豐度比，將與所述突變型探針特異性雜交的核酸量相對于使用在所述突變位點以外與所述擴增的核酸特異性雜交的探針測定的核酸量的比作為突變型的豐度比。

(5)如(3)或(4)所述的bcr-abl抑制劑抗性相關突變的檢測方法，其特征在于，在所述擴增的步驟中，使用具有熒光標記的引物進行核酸擴增反應，將與所述野生型探針特異性雜交的核酸量、與所述突變型探針特異性雜交的核酸量和所述擴增的核酸量表示為基于熒光強度的絕對值的值。

(6)如(1)所述的bcr-abl抑制劑抗性相關突變的檢測方法，其特征在于，所述突變位點對應于所述bcr-abl融合基因所編碼的蛋白中的bcr-abl激酶結構域。

(7)如(1)所述的bcr-abl抑制劑抗性相關突變的檢測方法，其特征在于，所述突變位點對應于bcr-abl激酶結構域的315位蘇氨酸(野生型)至異亮氨酸(突變型)的取代突變位點和該bcr-abl激酶結構域的253位酪氨酸(野生型)至組氨酸(突變型)的取代突變位點中的任一個或兩個。

(8)如(7)所述的bcr-abl抑制劑抗性相關突變的檢測方法，其特征在于，對于所述bcr-abl激酶結構域的315位的取代突變位點，使用含有對應于野生型的ctatatcatcactgagttcatg(序列號1)的野生型探針和含有對應于突變型的ctatatcatcattgagttcatg(序列號2)的突變型探針，

對于所述bcr-abl激酶結構域的253位的取代突變位點，使用含有對應于野生型的gccagtacggggaggtgtac(序列號3)的野生型探針和含有對應于突變型的gccagcacggggaggtgtac(序列號4)的突變型探針。

(9)一種用于預測bcr-abl抑制劑抗性的數據獲得方法，其包括如下步驟：通過如(1)至(8)中任一項所述的bcr-abl抑制劑抗性相關突變的檢測方法，根據對從受試者采集的生物樣品中所含的bcr-abl融合基因而確定的基因型對所述受試者的bcr-abl抑制劑抗性進行判定。

本說明書包含作為本申請的優(yōu)先權基礎的日本專利申請第2014-212228號中的公開內容。

發(fā)明效果

本發(fā)明的bcr-abl抑制劑抗性相關突變的檢測方法是對包括bcr-abl融合基因中所含有的融合位點和與bcr-abl抑制劑抗性相關的突變位點的區(qū)域進行擴增，并對于擴增的核酸確定基因型。由此，根據本發(fā)明的bcr-abl抑制劑抗性相關突變的檢測方法能夠高精度地確定上述突變位點的基因型。

另外，根據本發(fā)明的用于預測bcr-abl抑制劑抗性的數據獲得方法，由于利用對于與上述bcr-abl抑制劑抗性相關的突變位點能夠高精度地確定的基因型信息，由此能夠高精度地進行與bcr-abl抑制劑抗性相關的預測。

具體實施方式

本發(fā)明的bcr-abl抑制劑抗性相關突變的檢測方法及使用該方法用于預測bcr-abl抑制劑抗性的數據獲得方法(以下，統(tǒng)稱為本方法)中，首先使用從受試者采集的生物樣品，對包括bcr-abl融合基因中所含有的融合位點和與bcr-abl抑制劑抗性相關的突變位點(例如，bcr-abl激酶結構域的突變位點)的區(qū)域進行擴增。而且，本方法中使用擴增的核酸確定與上述bcr-abl抑制劑抗性相關的突變位點基因型，根據確定的基因型對上述受試者的bcr-abl抑制劑抗性進行判定。

這里，受試者是指可以是正常者，也可以是患有bcr-abl抑制劑所適用的各種疾病的患者。作為bcr-abl抑制劑所適用的各種疾病，并沒有特別限定，例如bcr-abl抑制劑如果為伊馬替尼，則可舉出慢性髓細胞性白血病(cml)、ph染色體陽性急性淋巴細胞白血病(ph+all)、kit(cd117)陽性胃腸道間質瘤(gist)。特別優(yōu)選受試者為患有慢性髓細胞性白血病的患者。此外，作為受試者，可以是開始進行bcr-abl抑制劑給藥的患者，也可以是bcr-abl抑制劑給藥開始前的患者。予以說明，作為bcr-abl抑制劑，并不限定于伊馬替尼，也可舉出例如尼洛替尼和達沙替尼等。

特別地，本方法是對于具有9號染色體與22號染色體的一部分發(fā)生易位而形成bcr-abl融合基因的受試者評價該bcr-abl融合基因中因bcr-abl激酶結構域的突變導致的bcr-abl抑制劑抗性的方法。所以，作為受試者具有9號染色體與22號染色體發(fā)生易位而形成的bcr-abl融合基因。

另外，作為來源于受試者的生物樣品，并沒有特別限定，可舉出血液、血漿、血清、腦脊髓液、胰液、尿、糞便、組織液等。特別是作為生物樣品，優(yōu)選使用血液、血漿、血清。

“使用生物樣品對包括bcr-abl融合基因中所含有的融合位點和與bcr-abl抑制劑抗性相關的突變位點的區(qū)域進行擴增”是指從生物樣品中所含的細胞提取總rna或mrna，將提取的總rna或mrna逆轉錄而產生的cdna作為模板進行核酸擴增反應。作為核酸的提取手段，并沒有特別限定。例如可利用使用苯酚/氯仿、乙醇、氫氧化鈉、ctab等的rna提取法。

在該核酸擴增反應中對包括bcr-abl融合基因中所含有的融合位點和與bcr-abl抑制劑抗性相關的突變位點的區(qū)域進行擴增，同時也可以對其他區(qū)域進行擴增。作為核酸擴增反應，并沒有特別限定，可適宜使用聚合酶鏈反應(pcr)法及l(fā)amp(loop-mediatedisothermalamplification，環(huán)介導等溫擴增)法、tma(transcription-mediatedamplification，轉錄介導擴增)法、trc(transcription-reversetranscriptionconcertedreaction，轉錄逆轉錄協(xié)調反應)法、sda(stranddisplacementamplification，鏈置換擴增)法、ican(isothermalandchimericprimer-initiatedamplificationofnucleicacids，等溫和嵌合引物引發(fā)核酸擴增)法等。例如pcr法中設計擴增目的區(qū)域側翼的一對引物，準備含有聚合酶和底物等的試劑。而且，將由上述生物樣品提取的總rna或mrna逆轉錄而產生的cdna作為模板，按照規(guī)定的溫度循環(huán)條件進行核酸擴增反應，以便能夠由一對引物特異性擴增目的區(qū)域。予以說明，核酸擴增反應是含有核酸擴增與標記所需的緩沖劑、耐熱dna聚合酶、對擴增區(qū)域特異的引物、標記的核苷三磷酸(具體地是附加熒光標記等的核苷三磷酸)、核苷三磷酸和氯化鎂等的反應系。

特別是希望附加標記以能夠在核酸擴增反應中鑒別擴增區(qū)域。這時，作為對擴增的核酸進行標記的方法，并沒有特別限定，例如可以使用對擴增反應中使用的引物進行預先標記的方法，使用在擴增反應中將標記核苷酸用作底物的方法。作為標記物質，并沒有特別限定，可以使用放射性同位素及熒光色素、或者地高辛配基(dig)及有機化合物如生物素等等。

即，應用pcr法時，通過使用設計為在“包括bcr-abl融合基因中所含有的融合位點和與bcr-abl抑制劑抗性相關的突變位點的區(qū)域”側翼的一對引物，能夠按照規(guī)定方法對該區(qū)域進行特異性擴增。予以說明，也可以應用除了pcr法之外的其他核酸擴增方法，按照各核酸擴增反應的原理能夠對該區(qū)域進行特異性擴增。

更具體地，作為pcr法中使用的一對引物，可根據來源于bcr-abl融合基因中的bcr基因的區(qū)域和來源于bcr-abl融合基因中的abl基因的區(qū)域分別設計。予以說明，一對引物中可含有所謂的正向引物與反向引物(與雙鏈dna中相互不同的鏈雜交)，可根據來源于bcr-abl融合基因中的bcr基因的區(qū)域和來源于abl基因的區(qū)域中任一個設計正向引物，根據另外一個設計反向引物。

另外，與bcr-abl抑制劑抗性相關的突變位點是指例如存在于bcr-abl激酶結構域，與bcr-abl抑制劑導致的治療效果下降的現象相關的氨基酸突變所伴有的突變位點。bcr-abl抑制劑導致的治療效果下降的現象是指換言之為bcr-abl抑制劑導致的bcr-abl融合蛋白中的酪氨酸激酶活性抑制效果下降。作為與bcr-abl抑制劑抗性相關的突變，可舉出bcr-abl激酶結構域的氨基酸取代突變。具體地，作為與bcr-abl抑制劑抗性相關的bcr-abl激酶結構域的突變，可舉出m237v、i242t、m244v、k247r、l248v、g250e/r、q252r/h、y253f/h、e255k/v、e258d、w261l、l273m、e275k/q、d276g、t277a、e279k、v280a、v289a/i、e292v/q、i293v、l298v、v299l、f311l/i、t315i、f317l/v/i/c、y320c、l324q、y342h、m343t、a344v、a350v、m351t、e355d/g/a、f359v/i/c/l、d363y、l364i、a365v、a366g、l370p、v371a、e373k、v379i、a380t、f382l、l384m、l387m/f/v、m388l、y393c、h396p/r/a、a397p、s417f/y、i418s/v、a433t、s438c、e450k/g/a/v、e453g/k/v/q、e459k/v/g/q、m472i、p480l、f486s、e507g等。予以說明，在上述突變的記載中，數值表示突變的位點，是以bcr-abl融合蛋白n末端的甲硫氨酸計數為1的值。

特別是，作為與bcr-abl抑制劑抗性相關的bcr-abl激酶結構域的突變位點，優(yōu)選使用t315i和y253h。換言之優(yōu)選一對引物設計為在bcr-abl融合基因中所含有的融合位點和包含與伊馬替尼抗性相關的t315i和/或y253h的區(qū)域的側翼。

予以說明，ph染色體是由t(9；22)(q34；q11)形成的小染色體，其中位于9q34的c-abl基因融合到位于22q11的bcr(breakpointclusterregion，斷裂點集簇區(qū))基因。bcr基因的斷裂位點集中于內含子1(次要bcr，m-bcr)或內含子2或3(主要bcr，m-bcr)，以首尾連接(headtotail)與c-abl的一部分融合。m-bcr上有斷裂點時，bcr外顯子2(b2)或外顯子3(b3)與a2連接而成的b2-a2mrna或b3-a2mrna轉錄并產生融合蛋白p210bcr-abl。另一方面，m-bcr上有斷裂點時，外顯子1(b1)與c-abl的exon2(a2)連接而成的b1-a2mrna轉錄并產生融合蛋白p190bcr-abl。

予以說明，將b2-a2mrna的一部分序列作為dna序列示于序列號5中，將b3-a2mrna的一部分序列作為dna序列示于序列號6中，將b1-a2mrna的一部分序列作為dna序列示于序列號7中。此外，將編碼b2-a2mrna中所含有的bcr-abl融合蛋白的區(qū)域所含有的dna序列示于序列號8中。

根據上述的見解，可以適當設計用于“對包括bcr-abl融合基因中所含有的融合位點和與bcr-abl抑制劑抗性相關的突變位點的區(qū)域進行擴增”的引物。詳細地例如可如下所述設計引物。

首先，確定檢測對象的突變(例如t315i)。接著，對于設計位置，由在bcr基因序列(序列號9或10)中形成bcr-abl融合基因的區(qū)域設計正向引物。予以說明，序列號9和10中由5’末端到3304位為形成bcr-abl融合基因的區(qū)域。此外，在abl基因序列(序列號11)中在形成bcr-abl融合基因的區(qū)域且自突變位點(例如t315i)起到3’末端側作為互補鏈設計反向引物。予以說明，序列號11中自445位到3’末端為形成bcr-abl融合基因的區(qū)域。也可以由abl基因序列設計正向引物，由bcr基因序列設計反向引物。

作為引物的設計方法，可使用一般的設計方法，將堿基長、tm和gc含量等作為參數。

予以說明，由一對引物擴增的區(qū)域長度只要包含融合位點與突變位點則沒有特別限定，例如可以為10～10k堿基，優(yōu)選為50～6k堿基，更優(yōu)選為500～3k堿基，最優(yōu)選為800～2k堿基。通過將擴增的區(qū)域長度在此范圍內，能夠包括bcr-abl融合基因中所含有的融合位點和與bcr-abl抑制劑抗性相關的突變位點。

通過使用如上所述設計的一對引物，能夠對“包括bcr-abl融合基因中所含有的融合位點和與bcr-abl抑制劑抗性相關的突變位點的區(qū)域”進行特異性擴增。換言之，使用如上所述設計的一對引物時，如果9號染色體與22號染色體未發(fā)生易位，則核酸擴增反應不進行，不能確認到擴增片段。

接著，本發(fā)明的數據獲得方法中使用擴增的核酸，對上述與bcr-abl抑制劑抗性相關的突變位點基因型進行確定?；蛐偷拇_定方法并沒有特別限定，基于何種的方法、原理均可。例如，作為基因型的確定方法，可舉出對于突變位點的野生型等位基因、突變型等位基因利用特異性雜交探針的方法。作為基因型的確定方法，利用探針的方法并沒有限定，例如可舉出確定擴增片段的堿基序列的方法、利用pcr法等核酸擴增反應的方法等。

特別優(yōu)選使用在基板上固定探針而成的dna微陣列(microarray)(有時也稱為dna芯片)，對擴增的核酸中所含有的上述與bcr-abl抑制劑抗性相關的突變位點基因型進行確定。這是因為通過利用固定探針而成的dna微陣列，能夠用簡單且簡便的步驟準確地確定基因型。

更具體地，作為用于確定突變位點的t315i基因型的探針，可示例為包含對應于野生型的ctatatcatcactgagttcatg(序列號1)的野生型探針和包含對應于突變型的ctatatcatcattgagttcatg(序列號2)的突變型探針。此外，作為用于確定突變位點的y253h基因型的探針，可示例為包含對應于野生型的gccagtacggggaggtgtac(序列號3)的野生型探針和包含對應于突變型的gccagcacggggaggtgtac(序列號4)的突變型探針。予以說明，這些野生型探針和突變型探針為22mer或20mer，堿基長并未作任何限定。作為探針的長度，例如，可以為10mer～50mer，優(yōu)選為15mer～40mer，更優(yōu)選為20mer～30mer，最優(yōu)選為20mer～25mer。這樣用于確定基因型的探針，即使為任何長度也可以根據上述abl基因的堿基序列進行適當設計。

予以說明，用于確定基因型的探針，優(yōu)選為核酸，更優(yōu)選為dna。dna中可包含雙鏈和單鏈二者，優(yōu)選為單鏈dna。用于確定基因型的探針，例如，可以通過核酸合成裝置進行化學合成而獲得。作為核酸合成裝置，可以使用稱為dna合成儀、全自動核酸合成裝置、核酸自動合成裝置等的裝置。

用于確定基因型的探針，優(yōu)選將其5'末端在載體上固定化，以微陣列(例如dna芯片)的形式使用。作為載體的材料，可以使用本技術領域內公知的材料，并沒有特別限制。此外，作為載體，優(yōu)選使用在表面上有碳層和化學修飾基團的載體。

特別優(yōu)選使用具有微細平板狀結構的載體。形狀為長方形、正方形和圓形等并不限定，通常使用1～75mm正方形的載體，優(yōu)選為1～10mm正方形的載體、更優(yōu)選為3～5mm正方形的載體。從容易制造微細平板狀結構的載體出發(fā)，優(yōu)選使用由硅材料、樹脂材料形成的基板，特別更優(yōu)選在由單結晶硅形成的基板表面上具有碳層和化學修飾基團的載體。

將探針在載體上固定并沒有特別限定，可適用如下方法：將探針溶解于點樣用緩沖劑來配制點樣用溶液，將其分注到96孔或384孔塑料板，通過點樣裝置等將分注的溶液點樣到載體上。此外，也可以用微量移液器對點樣溶液手動進行點樣。

點樣后，為了使探針與載體結合的反應進行，優(yōu)選進行孵育。孵育通常在-20～100℃、優(yōu)選為0～90℃的溫度，通常0.5～16小時、優(yōu)選為在1～2小時內進行。孵育希望在高濕度的環(huán)境中，例如，在濕度50～90％的條件下進行。孵育之后，為了除去未與載體結合的dna，優(yōu)選用清洗液(例如，50mmtbs/0.05％tween20、2×ssc/0.2％sds溶液、超純水等)進行清洗。

通過使用如上所述制作的dna微陣列，能夠確定受試者中與bcr-abl抑制劑抗性相關的突變位點基因型。具體地，如上所述進行擴增的核酸與探針的雜交反應，對與探針雜交的核酸量，例如通過檢測標記進行測定。來自標記的信號，例如使用熒光標記時，使用熒光掃描儀進行熒光信號檢測，對其通過圖像分析軟件進行分析而能夠將信號強度轉換為數值化。此外，例如，通過使用含有已知量dna的試樣制作校準曲線，也能夠對與探針雜交的擴增核酸進行定量。雜交反應優(yōu)選在嚴格條件下實施。嚴格條件是指形成特異性雜交，但不形成非特異性雜交的條件，例如是指在50℃下進行16小時雜交反應后，在2×ssc/0.2％sds、25℃、10分鐘和2×ssc、25℃、5分鐘的條件下清洗的條件。或者，作為雜交的溫度，鹽濃度為0.5×ssc時，可設定為42～54℃，在探針鏈長較短時，更優(yōu)選雜交溫度設為42～48℃，探針鏈長較長時，更優(yōu)選雜交溫度設為46～54℃。予以說明，如果鹽濃度提高則具有特異性的雜交溫度升高，反之如果鹽濃度降低則具有特異性的雜交溫度下降。

另外這時，在dna微陣列上，除了用于確定突變位點基因型的探針之外，也可以固定與擴增的核酸中除了與bcr-abl抑制劑抗性相關的突變位點以外的區(qū)域雜交的探針。無論突變位點基因型如何，該探針均能夠與擴增的核酸雜交。所以，通過使用固定該探針的dna微陣列，能夠對目標核酸是否由核酸擴增反應得到擴增進行判定。

本方法根據與對于與bcr-abl抑制劑抗性相關的突變位點而設計的探針雜交的上述擴增的核酸量，來確定該突變位點基因型。特別是在本方法中由于對包括bcr-abl融合基因中所含有的融合位點和與bcr-abl抑制劑抗性相關的突變位點的區(qū)域進行擴增，因此能夠不受到9號染色體上的abl基因中該突變位點基因型的影響，而對bcr-abl融合基因中突變位點基因型進行確定。

特別是對于使用從受試者采集的生物樣品，將逆轉錄mrna而得到的cdna作為模板擴增的核酸，通過確定突變位點基因型，能夠對于野生型的bcr-abl融合基因與突變型的bcr-abl融合基因求出表達量的比。換言之在這種情況下，對于從受試者采集的生物樣品，能夠推算出具有bcr-abl抑制劑抗性的細胞(克隆)群相對于bcr-abl抑制劑敏感性的細胞的豐度比。由此，針對bcr-abl抑制劑所適用的各種疾病(cml、ph+all和gist等)，可以恰當地判斷繼續(xù)給藥bcr-abl抑制劑還是變更為其他治療藥物的治療方針。

更具體地對于上述突變位點使用對應于野生型的野生型探針和對應于突變型的突變型探針，計算上述擴增的核酸中所含有的野生型和/或突變型的豐度比。而且，野生型的豐度比在一定值以下、或者突變型的豐度比在一定值以上時，例如，能夠判斷為疾病復發(fā)風險高。這時，作為突變型的豐度比的閾值，例如，可以適當設定判斷為疾病復發(fā)風險高的值、判斷為bcr-abl抑制劑的無給藥效果的值、判斷為bcr-abl抑制劑更換為其他藥劑的值等。

另外，野生型或者突變型的豐度比可以作為一例如下所述進行確定。即，以與上述野生型探針特異性雜交的核酸量和與上述突變型探針特異性雜交的核酸量作為總量，將與上述野生型探針特異性雜交的核酸量相對于該總量的比作為野生型的豐度比，將與上述突變型探針特異性雜交的核酸量相對于該總量的比作為突變型的豐度比?；蛘?，上述豐度比為：將與上述野生型探針特異性雜交的核酸量相對于使用在突變位點以外特異性雜交的探針測定的核酸量的比作為野生型的豐度比，將與上述突變型探針特異性雜交的核酸量相對于使用在突變位點以外特異性雜交的探針測定的核酸量的比作為突變型的豐度比。

在這兩種情況下，擴增的核酸也就是以野生型bcr-abl融合基因和突變型bcr-abl融合基因的量作為總量，將野生型bcr-abl融合基因相對于該總量的量作為野生型的豐度比，將突變型bcr-abl融合基因相對于該總量的量作為突變型的豐度比。由此，能夠合理地推算出從受試者采集的生物樣品中所含的bcr-abl抑制劑抗性克隆的豐度比。

實施例

以下，通過實施例進一步詳細地說明本發(fā)明，本發(fā)明的技術范圍并不限定于以下實施例。

〔實施例1〕

<試樣的制作>

本實施例中準備了歸納于下表中的5種試樣。

[表1]

<試樣1的制作方法>

對細胞株k562進行細胞培養(yǎng)，細胞使用tc20全自動細胞計數儀(bio-rad公司制)確認為1.25×10⁶個/ml。向15ml離心管中加入10ml的培養(yǎng)液，以300×g進行5分鐘離心操作形成沉淀。小心地完全除去上清后，用rneasyminikit(qiagen公司制)提取rna。使用nanodrop2000(賽默飛世爾科技公司制)測定rna濃度。

<試樣2的制作方法>

對細胞株hl60進行細胞培養(yǎng)，與試樣1的制作同樣地用rneasyminikit(qiagen公司制)提取rna。使用nanodrop2000(賽默飛世爾科技公司制)測定rna濃度。

<試樣3的制作方法>

將由細胞株k562提取的2mg總rna作為對象，用引物〔引物序列5(ccggaattctccgctgaccatcaataagga：序列號12)、引物序列6(ataagaatgcggccgcacgtcggacttgatggagaact：序列號13)〕進行rt-pcr。將1203bp的cdna片段用5’bcr特異的引物和3’abl特異的引物的pcr進行擴增。

將pcr產物連接到pcdna3.1(+)克隆載體(invitrogen公司制)，轉化到大腸菌dh5α感受態(tài)細胞(東洋紡株式會社)。對插入的pcr產物進行測序，以確認野生型序列已插入。

<試樣4的制作方法>

以在試樣3中得到的野生型克隆載體為對象，利用定點突變試劑盒(site-directedmutagenesis)(東洋紡株式會社制)，在315位蘇氨酸導入為異亮氨酸的點突變。pcr中使用引物序列7(ccccgttctatatcatcattgagttcatgacctacg：序列號14)和引物序列8(cgtaggtcatgaactcaatgatgatatagaacgggg：序列號15)。反應液組成示于下表2(單位為μl)中。

[表2]

pcr按照以下條件進行。即，以95℃2分鐘、98℃2分鐘和68℃10分鐘為1次循環(huán)進行10次循環(huán)。

而且，用限制性內切酶dpni(東洋紡株式會社)切斷模板野生型克隆載體，將導入目的突變的pcr產物轉化到大腸菌dh5α感受態(tài)細胞(東洋紡株式會社制)中(轉化)。對插入的pcr產物進行測序，確認t315i突變型序列已插入。

<試樣5的制作方法>

以試樣3中得到的野生型克隆載體為對象，利用定點突變試劑盒(site-directedmutagenesis)(東洋紡株式會社制)，在253位酪氨酸導入為組氨酸的點突變。pcr中使用引物序列9(caagctgggcgggggccagcacggggaggtgtacgagg：序列號16)和引物序列10(cctcgtacacctccccgtgctggcccccgcccagcttg：序列號17)。與制作試樣4的條件同樣地進行pcr，對插入的pcr產物進行測序，確認y253h突變型序列已插入。

<芯片的制作>

制作用于檢測bcr-abl融合基因的融合位點的探針(探針1)、用于檢測bcr-abl融合基因突變的t315i的探針(探針2和3)。各探針的堿基序列如下所示。

探針1(融合)：cccttcagcggccagtagcatctga(序列號18)

探針2(野生型)：ctatatcatcactgagttcatg(序列號1)

探針3(突變型)：ctatatcatcattgagttcatg(序列號2)

〔實施例1-1〕引物對的評價

本實施例中使用對包含bcr-abl融合基因的融合位點和突變位點的區(qū)域進行特異性擴增的引物對a(引物1和2)。引物1和引物2的堿基序列如下所示。予以說明，引物2中附加有cy5。

引物1：tccgctgaccatcaayaagga(序列號19、y＝c或t)

引物2：acgtcggacttgatggagaact(序列號20)

使用引物對a以下表3(單位為μl)組成的反應液進行rt-pcr，對包含bcr-abl融合基因的融合位點和突變位點的區(qū)域進行擴增。這時，本實施例中作為模板使用由試樣1提取的人rna。

[表3]

rt-pcr進行條件如下：在以42℃15分后95℃10秒的條件下進行逆轉錄反應，然后，在以95℃30秒、60℃30秒和72℃3分為1次循環(huán)進行33次循環(huán)，然后72℃5分鐘的條件下進行擴增反應。

反應完成后，將反應液與雜交緩沖液(2×ssc/0.2％sds/0.2nmcy5標記寡核苷酸dna(sigma-aldrich公司制))以1：1進行混合，取該溶液3μl，滴到原位雜交蓋玻片的中央凸起部上，將其蓋到芯片上，在設定為48℃的雜交盒裝置(東洋鋼鈑株式會社制)反應1小時。

雜交反應完成后，將清洗用不銹鋼固定器浸入在1×ssc/0.1％sds溶液中，將剝離原位雜交蓋玻片的芯片安置在固定器上。上下數次振動后，將固定器浸入在1×ssc溶液(室溫)中直到檢測芯片熒光強度。

將蓋玻片覆蓋到芯片后，用fla8000(富士膠卷株式會社制)以5μm像素、pmt80％檢測熒光強度。使用軟件(arraygaugever2.1，富士膠卷株式會社制)對fla8000得到的數據進行分析。

予以說明，用于比較，代替引物對a，使用擴增bcr-abl融合基因突變的引物對b(引物3和4)同樣地進行rt-pcr、雜交反應和熒光檢測。引物3和引物4的堿基序列如下所示。

引物3：aagaccttgaaggaggacaccat(序列號21)

引物4：acgtcggacttgatggagaact(序列號22)

分別使用引物對a、使用引物對b測定熒光強度的結果如表4所示。如下表4所示，使用引物對a時，在具有bcr-abl融合基因的試樣1中，融合位點和突變位點兩者均得到信號。與此相對，使用引物對b時，在具有bcr-abl融合基因的試樣1中，突變位點能被檢測到，但融合位點未能檢測到。由此可知，使用引物對a時，融合位點和突變位點能一并進行檢測。

予以說明，未能檢測的判定值設為43以下。予以說明，該判定值是由分析不含信號的背景區(qū)域中熒光信號的結果計算出的值。

[表4]

〔實施例1-2〕引物對的評價

本實施例中作為bcr-abl融合基因中的突變位點，使用固定有除了檢測t315i突變的探針還有檢測y253h突變的探針的dna芯片，對試樣中所含的bcr-abl融合基因中的突變位點進行檢測。本例中使用由試樣2的細胞株提取的人rna100ng和由試樣5的細胞株提取的人dna1ng作為模板。

本例中除了探針1～3，還設計用于檢測bcr-abl融合基因突變的y253h的探針(探針4和5)，制作固定化有探針1～5的dna芯片。

探針4(野生型)：gccagtacggggaggtgtac(序列號3)

探針5(突變型)：gccagcacggggaggtgtac(序列號4)

與實施例1-1同樣地，使用引物對a時測定熒光強度的結果如表5所示。如下表5所示，使用引物對a時，能夠對融合位點和多個突變位點(至少為y253h和t315i)同時進行檢查。

[表5]

〔實施例2-1〕引物對的評價

本實施例中對于引物對a和引物對b能否分別區(qū)分具有bcr-abl融合基因的試樣1和不具有bcr-abl融合基因的試樣2進行了驗證。實際中對于來自受試者的生物樣品，在確定bcr-abl融合基因中突變位點基因型時，同時對來源于正常細胞的c-abl基因中該位點的基因型進行檢測，結果有bcr-abl融合基因中突變比被低估的可能性。本實施例中驗證了在使用引物對a和引物對b時是否產生這樣的不良情況。

本實施例中使用試樣1和2，與實施例1-1同樣地測定來自dna芯片的熒光強度。其結果如表6所示。如表6所示，使用引物對a時，在具有bcr-abl融合基因的試樣1中測定到熒光信號，能夠在突變位點進行野生型的鑒別。另一方面，使用引物對a時，在不具有bcr-abl融合基因的試樣2中未測定到熒光信號，可知沒有來源于bcr-abl融合基因的突變。由以上可表明，使用引物對a時，能夠明確區(qū)分試樣1和試樣2。

與此相對，使用引物對b時，即使在不具有bcr-abl融合基因的試樣2中，突變位點也測定到熒光信號，不能區(qū)分試樣1和試樣2。

[表6]

〔實施例2-2〕引物對的評價

本實施例中試樣3和試樣4的混合總量設為10ng，分別使用以100：0、50：50和0：100的比的混合試樣作為模板。予以說明，利用pcr、dna芯片的雜交反應、隨后的熒光檢測等與實施例1-1同樣地進行。

不含有來源于正常細胞的c-abl基因的試樣3和4中，分別使用引物對a和引物對b測定熒光強度的結果如表7所示。如表7所示，使用引物對a和引物對b時兩種情況中，可得到作為模板混合的試樣混合比與基于信號強度的突變比之間有相關性。

[表7]

〔實施例2-3〕引物對的評價

本實施例中使用加入試樣41ng和試樣2100ng作為模板。予以說明，利用pcr、dna芯片的雜交反應、隨后的熒光檢測等與實施例1-1同樣地進行。

在含有具有來源于正常細胞的c-abl基因的試樣2時，使用引物對a和引物對b分別測定熒光強度的結果如表8所示。如下表8所示，使用引物對a時，可得到作為模板使用的bcr-abl融合基因的突變比(突變型100％)與檢測的信號強度有相關性。與此相對，使用引物對b時，作為模板混合的突變比與檢測的信號強度發(fā)生逆轉，可知受到不具有bcr-abl融合基因的試樣2的影響很大。由此可知，使用引物對a時，不受到來源于正常細胞的c-abl基因的影響，能夠準確地判定突變位點突變。

[表8]

本說明書中引用的全部刊物、專利和專利申請直接并入本說明書中。

序列表

<110>東洋鋼鈑株式會社

國立大學法人山口大學

<120>bcr-abl抑制劑抗性相關突變的檢測方法及用于

預測bcr-abl抑制劑抗性的數據獲得方法

<130>h088pct

<150>jp2014-212228

<151>2014-10-17

<160>22

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>22

<212>dna

<213>人工的

<220>

<223>合成dna

<400>1

ctatatcatcactgagttcatg22

<210>2

<211>22

<212>dna

<213>人工的

<220>

<223>合成dna

<400>2

ctatatcatcattgagttcatg22

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>人工的

<220>

<223>合成dna

<400>3

gccagtacggggaggtgtac20

<210>4

<211>20

<212>dna

<213>人工的

<220>

<223>合成dna

<400>4

gccagcacggggaggtgtac20

<210>5

<211>922

<212>dna

<213>智人(homosapiens)

<400>5

gcgaacaagggcagcaaggctacggagaggctgaagaagaagctgtcggagcaggagtca60

ctgctgctgcttatgtctcccagcatggccttcagggtgcacagccgcaacggcaagagt120

tacacgttcctgatctcctctgactatgagcgtgcagagtggagggagaacatccgggag180

cagcagaagaagtgtttcagaagcttctccctgacatccgtggagctgcagatgctgacc240

aactcgtgtgtgaaactccagactgtccacagcattccgctgaccatcaataaggaagaa300

gcccttcagcggccagtagcatctgactttgagcctcagggtctgagtgaagccgctcgt360

tggaactccaaggaaaaccttctcgctggacccagtgaaaatgaccccaaccttttcgtt420

gcactgtatgattttgtggccagtggagataacactctaagcataactaaaggtgaaaag480

ctccgggtcttaggctataatcacaatggggaatggtgtgaagcccaaaccaaaaatggc540

caaggctgggtcccaagcaactacatcacgccagtcaacagtctggagaaacactcctgg600

taccatgggcctgtgtcccgcaatgccgctgagtatcygctgagcagcgggatcaatggc660

agcttcttggtgcgtgagagtgagagcagtcctrgccagaggtccatctcgctgagatac720

gaagggagggtgtaccattacaggatcaacactgcttctgatggcaagctctacgtctcc780

tccgagagccgcttcaacaccctggccgagttggttcatcatcattcaacggtggccgac840

gggctcatcaccacgctccattatccagccccaaagcgcaacaagcccactgtctatggt900

gtgtcccccaactacgacaagt922

<210>6

<211>997

<212>dna

<213>智人(homosapiens)

<400>6

gcgaacaagggcagcaaagctacggagaggctgaagaagaagctgtcggagcaggagtca60

ctgctgctgcttatgtctcccagcatggccttcagggtgcacagccgcaacggcaagagt120

tacacgttcctgatctcctctgactatgagcgtgcagagtggagggagaacatccgggag180

cagcagaagaagtgtttcagaagcttctccctgacatccgtggagctgcagatgctgacc240

aactcgtgtgtgaaactccagactgtccacagcattccgctgaccatcaataaggaagat300

gatgagtctccggggctctatgggtttctgaatgtcatcgtccactcagccactggattt360

aagcagagttcaaaagcccttcagcggccagtagcatctgactttgagcctcagggtctg420

agtgaagccgctcgttggaactccaaggaaaaccttctcgctggacccagtgaaaatgac480

cccaaccttttcgttgcactgtatgattttgtggccagtggagataacactctaagcata540

actaaaggtgaaaagctccgggtcttaggctataatcacaatggggaatggtgtgaagcc600

caaaccaaaaatggccaaggctgggtcccaagcaactacatcacgccagtcaacagtctg660

gagaaacactcctggtaccatgggcctgtgtcccgcaatgccgctgagtatctgctgagc720

agcgggatcaatggcagcttcttggtgcgtgagagtgagagcagtcctggccagaggtcc780

atctcgctgagatacgaagggagggtgtaccattacaggatcaacactgcttctgatggc840

aagctctacgtctcctccgagagccgcttcaacaccctggccgagttggttcatcatcat900

tcaacggtggccgacgggctcatcaccacgctccattatccagccccaaagcgcaacaag960

cccactgtctatggtgtgtcccctaactacgacaagt997

<210>7

<211>1079

<212>dna

<213>智人(homosapiens)

<400>7

gtaccagccctaccagagcatctacgtcgggggcatgatggaaggggagggcaagggccc60

gctcctgcgcagccagagcacctctgagcaggagaagcgccttacctggccccgcaggtc120

ctactccccccggagttttgaggattgcggaggcggctataccccggactgcagctccaa180

tgagaacctcacctccagcgaggaggacttctcctctggccagtccagccgcgtgtcccc240

aagccccaccacctaccgcatgttccgggacaaaagccgctctccctcgcagaactcgca300

acagtccttcgacagcagcagtccccccacgccgcagtgccataagcggcaccggcactg360

cccggttgtcgtgtccgaggccaccatcgtgggcgtccgcaagaccgggcagatctggcc420

caacgatggcgagggcgccttccatggagacgcagaagcccttcagcggccagtagcatc480

tgactttgagcctcagggtctgagtgaagccgctcgttggaactccaaggaaaaccttct540

cgctggacccagtgaaaatgaccccaaccttttcgttgcactgtatgattttgtggccag600

tggagataacactctaagcataactaaaggtgaaaagctccgggtcttaggctataatca660

caatggggaatggtgtgaagcccaaaccaaaaatggccaaggctgggtcccaagcaacta720

catcacgccagtcaacagtctggagaaacactcctggtaccatgggcctgtgtcccgcaa780

tgccgctgagtatcygctgagcagcgggatcaatggcagcttcttggtgcgtgagagtga840

gagcagtcctrgccagaggtccatctcgctgagatacgaagggagggtgtaccattacag900

gatcaacactgcttctgatggcaagctctacgtctcctccgagagccgcttcaacaccct960

ggccgagttggttcatcatcattcaacggtggccgacgggctcatcaccacgctccatta1020

tccagccccaaagcgcaacaagcccactgtctatggtgtgtcccccaactacgacaagt1079

<210>8

<211>6104

<212>dna

<213>智人(homosapiens)

<400>8

atggtggacccggtgggcttcgcggaggcgtggaaggcgcagttcccggactcagagccc60

ccgcgcatggagctgcgctcagtgggcgacatcgagcaggagctggagcgctgcaaggcc120

tccattcggcgcctggagcaggaggtgaaccaggagcgcttccgcatgatctacctgcag180

acgttgctggccaaggaaaagaagagctatgaccggcagcgatggggcttccggcgcgcg240

gcgcaggcccccgacggcgcctccgagccccgagcgtccgcgtcgcgcccgcagccagcg300

cccgccgacggagccgacccgccgcccgccgaggagcccgaggcccggcccgacggcgag360

ggttctccgggtaaggccaggcccgggaccgcccgcaggcccggggcagccgcgtcgggg420

gaacgggacgaccggggaccccccgccagcgtggcggcgctcaggtccaacttcgagcgg480

atccgcaagggccatggccagcccggggcggacgccgagaagcccttctacgtgaacgtc540

gagtttcaccacgagcgcggcctggtgaaggtcaacgacaaagaggtgtcggaccgcatc600

agctccctgggcagccaggccatgcagatggagcgcaaaaagtcccagcacggcgcgggc660

tcgagcgtgggggatgcatccaggcccccttaccggggacgctcctcggagagcagctgc720

ggcgtcgacggcgactacgaggacgccgagttgaacccccgcttcctgaaggacaacctg780

atcgacgccaatggcggtagcaggcccccttggccgcccctggagtaccagccctaccag840

agcatctacgtcgggggcatcatggaaggggagggcaagggcccgctcctgcgcagccag900

agcacctctgagcaggagaagcgccttacctggccccgcaggtcctactccccccggagt960

tttgaggattgcggaggcggctataccccggactgcagctccaatgagaacctcacctcc1020

agcgaggaggacttctcctctggccagtccagccgcgtgtccccaagccccaccacctac1080

cgcatgttccgggacaaaagccgctctccctcgcagaactcgcaacagtccttcgacagc1140

agcagtccccccacgccgcagtgccataagcggcaccggcactgcccggttgtcgtgtcc1200

gaggccaccatcgtgggcgtccgcaagaccgggcagatctggcccaacgatgacgagggc1260

gccttccatggagacgcagatggctcgttcggaacaccacctggatacggctgcgctgca1320

gaccgggcagaggagcagcgccggcaccaagatgggctgccctacattgatgactcgccc1380

tcctcatcgccccacctcagcagcaagggcaggggcagccgggatgcgctggtctcggga1440

gccctggagtccactaaagcgagtgagctggacttggaaaagggcttggagatgagaaaa1500

tgggtcctgtcgggaatcctggctagcgaggagacttacctgagccacctggaggcactg1560

ctgctgcccatgaagcctttgaaagccgctgccaccacctctcagccggtgctgacgagt1620

cagcagatcgagaccatcttcttcaaagtgcctgagctctacgagatccacaaggagttc1680

tatgatgggctcttcccccgcgtgcagcagtggagccaccagcagcgggtgggcgacctc1740

ttccagaagctggccagccagctgggtgtgtaccgggccttcgtggacaactacggagtt1800

gccatggaaatggctgagaagtgctgtcaggccaatgctcagtttgcagaaatctccgag1860

aacctgagagccagaagcaacaaagatgccaaggatccaacgaccaagaactctctggaa1920

actctgctctacaagcctgtggaccgtgtgacgaggagcacgctggtcctccatgacttg1980

ctgaagcacactcctgccagccaccctgaccaccccttgctgcaggacgccctccgcatc2040

tcacagaacttcctgtccagcatcaatgaggagatcacaccccgacggcagtccatgacg2100

gtgaagaagggagagcaccggcagctgctgaaggacagcttcatggtggagctggtggag2160

ggggcccgcaagctgcgccacgtcttcctgttcaccgagctgcttctctgcaccaagctc2220

aagaagcagagcggaggcaaaacgcagcagtatgactgcaaatggtacattccgctcacg2280

gatctcagcttccagatggtggatgaactggaggcagtgcccaacatccccctggtgccc2340

gatgaggagctggacgctttgaagatcaagatctcccagatcaagagtgacatccagaga2400

gagaagagggcgaacaagggcagcaaggctacggagaggctgaagaagaagctgtcggag2460

caggagtcactgctgctgcttatgtctcccagcatggccttcagggtgcacagccgcaac2520

ggcaagagttacacgttcctgatctcctctgactatgagcgtgcagagtggagggagaac2580

atccgggagcagcagaagaagtgtttcagaagcttctccctgacatccgtggagctgcag2640

atgctgaccaactcgtgtgtgaaactccagactgtccacagcattccgctgaccatcaat2700

aaggaagaagcccttcagcggccagtagcatctgactttgagcctcagggtctgagtgaa2760

gccgctcgttggaactccaaggaaaaccttctcgctggacccagtgaaaatgaccccaac2820

cttttcgttgcactgtatgattttgtggccagtggagataacactctaagcataactaaa2880

ggtgaaaagctccgggtcttaggctataatcacaatggggaatggtgtgaagcccaaacc2940

aaaaatggccaaggctgggtcccaagcaactacatcacgccagtcaacagtctggagaaa3000

cactcctggtaccatgggcctgtgtcccgcaatgccgctgagtatcygctgagcagcggg3060

atcaatggcagcttcttggtgcgtgagagtgagagcagtcctrgccagaggtccatctcg3120

ctgagatacgaagggagggtgtaccattacaggatcaacactgcttctgatggcaagctc3180

tacgtctcctccgagagccgcttcaacaccctggccgagttggttcatcatcattcaacg3240

gtggccgacgggctcatcaccacgctccattatccagccccaaagcgcaacaagcccact3300

gtctatggtgtgtcccccaactacgacaagtgggagatggaacgcacggacatcaccatg3360

aagcacaagctgggcgggggccagtacggggaggtgtacgagggcgtgtggaagaaatac3420

agcctgacggtggccgtgaagaccttgaaggaggacaccatggaggtggaagagttcttg3480

aaagaagctgcagtcatgaaagagatcaaacaccctaacctagtgcagctccttggggtc3540

tgcacccgggagcccccgttctatatcatcactgagttcatgacctacgggaacctcctg3600

gactacctgagggagtgcaaccggcaggaggtgaacgccgtggtgctgctgtacatggcc3660

actcagatctcgtcagccatggagtacctagagaagaaaaacttcatccacagagatctt3720

gctgcccgaaactgcctggtaggggagaaccacttggtgaaggtagctgattttggcctg3780

agcaggttgatgacaggggacacctacacagcccatgctggagccaagttccccatcaaa3840

tggactgcacccgagagcctggcctacaacaagttctccatcaagtccgacgtctgggca3900

tttggagtattgctttgggaaattgctacctatggcatgtccccttacccgggaattgac3960

cgttcccaggtgtatgagctgctagagaaggactaccgcatgaagcgcccagaaggctgc4020

ccagagaaggtctatgaactcatgcgagcatgttggcagtggaatccctctgaccggccc4080

tcctttgctgaaatccaccaagcctttgaaacaatgttccaggaatccagtatctcagac4140

gaagtggaaaaggagctggggaaacaaggcgtccgtggggctgtgactaccttgctgcag4200

gccccagagctgcccaccaagacgaggacctccaggagagctgcagagcacagagacacc4260

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