專利名稱：一種檢測(cè)s1核酸酶及其抑制劑的熒光方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物傳感及分析領(lǐng)域，特別涉及一種利用寡核苷酸和氧化石墨烯檢測(cè)核酸酶及其抑制劑的熒光檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
核酸酶是指作用于核酸的磷酸二酯鍵的酶。依據(jù)底物不同分類，可分為DNA酶和 RNA酶；依據(jù)切割部位不同，又可分為核酸內(nèi)切酶、限制性內(nèi)切酶和核酸外切酶。生物體內(nèi)的核酸酶負(fù)責(zé)細(xì)胞內(nèi)外催化核酸的降解，對(duì)生命過(guò)程起著非常重要的作用。核酸酶的用途包括參與DNA的合成與修復(fù)及RNA轉(zhuǎn)錄后的剪切、修飾和降解等重要基因復(fù)制和基因表達(dá)過(guò)程；負(fù)責(zé)清除多余的、結(jié)構(gòu)和功能異常的核酸，同時(shí)也可以清除侵入細(xì)胞的外源性核酸； 在消化液中降解食物中的核酸以利吸收；是體外重組DNA技術(shù)中的重要工具酶。由于核酸酶生理功能的重要意義，近年來(lái)受到科學(xué)家們?cè)絹?lái)越多的關(guān)注，因此迫切需要尋找快速、簡(jiǎn)便、高靈敏度的方法來(lái)檢測(cè)核酸酶。隨之，對(duì)核酸酶的檢測(cè)材料和方法的開發(fā)研究成為一個(gè)熱點(diǎn)。目前針對(duì)于核酸酶檢測(cè)的新型分析方法已經(jīng)在生命科學(xué)研究和疾病分子診斷等領(lǐng)域得到迅速發(fā)展。對(duì)核酸酶研究的不斷深入，必將對(duì)生命本質(zhì)的探索和人類的未來(lái)作出更大的貢獻(xiàn)。近年來(lái)氧化石墨烯以其特殊的力學(xué)、量子學(xué)和電學(xué)性質(zhì)，頗受物理和材料學(xué)界重視。由于其具有優(yōu)異的電學(xué)性能、導(dǎo)熱性好、水溶性好、比表面積大等優(yōu)點(diǎn)，也為生物分子的檢測(cè)提供了新的思路。目前隨著單壁碳納米管在生物傳感中的成功應(yīng)用，氧化石墨烯也逐漸成為傳感領(lǐng)域青睞的對(duì)象。由于氧化石墨烯的特殊性質(zhì)，使得檢測(cè)過(guò)程操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)快速，這樣大大減少了實(shí)驗(yàn)的步驟，同時(shí)可以顯著的提高檢測(cè)的靈敏度和特異性。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問(wèn)題本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)現(xiàn)有的核酸酶檢測(cè)方法存在的不足， 提供一種利用寡核苷酸和氧化石墨烯檢測(cè)Si核酸酶及其抑制劑的熒光方法，其具有較高的特異性和靈敏度。技術(shù)方案本發(fā)明檢測(cè)Sl核酸酶及其抑制劑的熒光方法，其特征在于該方法包括以下步驟a.將染料標(biāo)記的寡核苷酸熒光探針加入到緩沖溶液中，以480nm為激發(fā)波長(zhǎng)，進(jìn)行熒光檢測(cè)，記錄該探針的熒光發(fā)射譜帶；b.將氧化石墨烯加入到上述溶液中，氧化石墨烯作為固相載體吸附自由卷曲狀態(tài)的寡核苷酸探針，形成寡核苷酸/氧化石墨烯復(fù)合物，此時(shí)染料的熒光被氧化石墨烯猝滅；c.經(jīng)Sl核酸酶切割的寡核苷酸互補(bǔ)鏈，加入到寡核苷酸/石墨烯復(fù)合物中進(jìn)行反應(yīng)；d.寡核苷酸互補(bǔ)鏈經(jīng)過(guò)Sl核酸酶的特異性降解作用形成小的堿基片段，無(wú)法與氧化石墨烯表面的寡核苷酸鏈探針形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，從而寡核苷酸探針不能脫離氧化石墨烯的表面，染料的熒光信號(hào)不能恢復(fù)；根據(jù)熒光信號(hào)恢復(fù)的程度實(shí)現(xiàn)對(duì)Sl核酸酶的定性及定量檢測(cè)；e.寡核苷酸互補(bǔ)鏈在抑制劑腺苷三磷酸存在下經(jīng)Sl核酸酶降解作用，加入寡核苷酸/氧化石墨烯復(fù)合物中進(jìn)行反應(yīng)；f.寡核苷酸互補(bǔ)鏈在抑制劑腺苷三磷酸存在下不會(huì)被Sl核酸酶降解，與寡核苷酸探針形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，寡核苷酸探針脫離氧化石墨烯的表面，染料的熒光信號(hào)得以恢復(fù)； 根據(jù)熒光信號(hào)恢復(fù)的程度實(shí)現(xiàn)對(duì)抑制劑腺苷三磷酸的定性及定量檢測(cè)。其中步驟a)所述的將染料標(biāo)記的寡核苷酸熒光探針加入到緩沖溶液中，用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)，所用染料為熒光素；染料標(biāo)記在寡核苷酸探針的5’端；寡核苷酸探針堿基組成為5，-FAM-ATCTTGACTATGTGGGTGCT-3，；所用緩沖溶液為 20mM Tris-HCl, IOOmM NaCl, 5mM KCl,5mM MgCl2, pH = 7. 4 ；所用熒光檢測(cè)方法為將探針溶液加入到1. 6mL緩沖溶液中進(jìn)行熒光發(fā)射光譜的掃描，激發(fā)波長(zhǎng)為480nm，發(fā)射波長(zhǎng)掃描范圍為490-650nm。步驟b)所述的寡核苷酸/氧化石墨烯復(fù)合物的形成，是通過(guò)非共價(jià)鍵相互作用使寡核苷酸探針吸附到氧化石墨烯表面；寡核苷酸吸附到氧化石墨烯表面后，染料的熒光被氧化石墨烯猝滅，將氧化石墨烯加入到含有寡核苷酸探針的緩沖溶液中后，室溫放置5分鐘，然后進(jìn)行熒光檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)為480nm，掃描范圍為490-650nm。步驟c)經(jīng)Sl核酸酶切割的寡核苷酸互補(bǔ)鏈，加入到寡核苷酸/石墨烯復(fù)合物中進(jìn)行反應(yīng)，所用的寡核苷酸互補(bǔ)鏈探針堿基組成為5’ -AGCACCCACATAGTCAAGAT-3’ ；加入含有S 1酶的寡核苷酸互補(bǔ)鏈溶液或其它等體積的對(duì)照溶液后熒光信號(hào)恢復(fù)所用的時(shí)間為室溫，25分鐘左右。所述的熒光信號(hào)用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)為480nm，發(fā)射波長(zhǎng)掃描范圍為490-650nm。所述的熒光探針為任意一段單鏈寡核苷酸，染料標(biāo)記在5’端，或是3’端。 所述的染料標(biāo)記是熒光素或異硫氰酸熒光素。步驟d)所述的寡核苷酸互補(bǔ)鏈經(jīng)Sl核酸酶降解作用，是通過(guò)Sl核酸酶對(duì)單鏈 DNA或RNA特異性的降解作用，形成5’磷酸結(jié)構(gòu)。Sl核酸酶對(duì)寡核苷酸互補(bǔ)鏈的酶切過(guò)程所用酶切溶液為2mM CH3COONa, 15mMNaCl,0. ImMZnSO4, pH = 4. 6 ；酶切溫度為 37°C，時(shí)間為 30 分鐘。步驟e)所述的寡核苷酸互補(bǔ)鏈在抑制劑腺苷三磷酸存在下經(jīng)Sl核酸酶降解作用，是腺苷三磷酸能夠抑制Sl核酸酶對(duì)單鏈DNA或RNA切割的特異性降解作用；當(dāng)抑制劑腺苷三磷酸存在時(shí)，Sl核酸酶對(duì)寡核苷酸互補(bǔ)鏈的作用條件與上述酶切條件相同。有益效果根據(jù)本發(fā)明所述的熒光檢測(cè)方法，可同時(shí)實(shí)現(xiàn)對(duì)Sl核酸酶及其抑制劑腺苷三磷酸的檢測(cè)。當(dāng)體系中含有其它核酸酶及抑制劑時(shí)，仍然可以實(shí)現(xiàn)對(duì)其高靈敏度檢測(cè)。因此，本發(fā)明方法有望為實(shí)際臨床樣品中核酸酶的檢測(cè)提供一種簡(jiǎn)便、快速的方法。


圖1為本發(fā)明利用寡核苷酸和氧化石墨烯檢測(cè)核酸酶及其抑制劑的熒光檢測(cè)方法的工作原理圖。圖2為本發(fā)明利用寡核苷酸和氧化石墨烯檢測(cè)檢測(cè)未經(jīng)Sl酶降解的DNA鏈的熒光檢測(cè)結(jié)果圖。a為寡核苷酸探針；b為寡核苷酸探針+氧化石墨烯；c為寡核苷酸探針+ 互補(bǔ)鏈+氧化石墨烯；d為寡核苷酸探針+非互補(bǔ)鏈+氧化石墨烯。圖3為Sl酶及其抑制劑檢測(cè)過(guò)程中不同反應(yīng)體系熒光檢測(cè)結(jié)果對(duì)比圖。a為寡核苷酸探針；b為寡核苷酸探針+氧化石墨烯；c為寡核苷酸探針+Sl核酸酶+互補(bǔ)鏈+氧化石墨烯；d為寡核苷酸探針+Sl核酸酶+腺苷三磷酸+互補(bǔ)鏈+氧化石墨烯。
具體實(shí)施例方式一種利用寡核苷酸和氧化石墨烯檢測(cè)Sl核酸酶及其抑制劑的熒光檢測(cè)方法，包括以下步驟1)將染料標(biāo)記的寡核苷酸探針加入到緩沖溶液中，對(duì)溶液進(jìn)行熒光檢測(cè)，記錄該探針的熒光發(fā)射譜帶；該探針為任意序列的一段單鏈核酸，一端標(biāo)記有熒光素。2)將氧化石墨烯作為固相載體加入到緩沖溶液中，由于氧化石墨烯表面具有能與寡核苷酸探針進(jìn)行非共價(jià)鍵結(jié)合的化學(xué)基團(tuán)，可以使染料標(biāo)記的寡核苷酸探針吸附到氧化石墨烯的表面，從而形成寡核苷酸/氧化石墨烯復(fù)合物，此時(shí)染料與氧化石墨烯之間發(fā)生高效的能量轉(zhuǎn)移，染料的熒光被氧化石墨烯有效猝滅。3)在寡核苷酸/氧化石墨烯復(fù)合物中加入寡核苷酸互補(bǔ)鏈進(jìn)行反應(yīng)，通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)作用，兩條單鏈核苷酸雜交形成雙螺旋結(jié)構(gòu)。4)互補(bǔ)鏈介導(dǎo)的雙螺旋結(jié)構(gòu)的形成使其從氧化石墨烯表面脫離，此時(shí)染料基團(tuán)與氧化石墨烯之間的距離較遠(yuǎn)，不能發(fā)生有效的能量轉(zhuǎn)移，標(biāo)記在探針末端的染料的熒光信號(hào)得到恢復(fù)，可以檢測(cè)到較強(qiáng)的熒光信號(hào)。5)當(dāng)寡核苷酸互補(bǔ)鏈經(jīng)Sl核酸酶降解形成小的堿基片段后，加入到寡核苷酸/石墨烯復(fù)合物中進(jìn)行反應(yīng)，降解后的堿基片段不能與寡核苷酸鏈形成雙螺旋結(jié)構(gòu)。6)寡核苷酸互補(bǔ)鏈由于受到Sl核酸酶降解作用無(wú)法與寡核苷酸形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，從而寡核苷酸探針不能從氧化石墨烯的表面脫離，染料的熒光信號(hào)也不能恢復(fù)。7)當(dāng)寡核苷酸互補(bǔ)鏈在抑制劑腺苷三磷酸存在下經(jīng)Sl核酸酶作用后，加入到寡核苷酸/石墨烯復(fù)合物中進(jìn)行反應(yīng)，互補(bǔ)鏈在抑制劑腺苷三磷酸存在下不會(huì)被Si核酸酶降解，因此能夠與寡核苷酸形成雙螺旋結(jié)構(gòu)。8)寡核苷酸互補(bǔ)鏈由于在抑制劑腺苷三磷酸作用下不被Sl核酸酶降解，能夠與寡核苷酸探針形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，從而使寡核苷酸探針脫離氧化石墨烯的表面，染料的熒光信號(hào)得以恢復(fù)。根據(jù)本發(fā)明，步驟1)為將染料標(biāo)記的寡核苷酸探針加入到緩沖溶液中，對(duì)溶液進(jìn)行熒光檢測(cè)；其中，本發(fā)明所述的寡核苷酸探針是任意序列的一段單鏈核酸。根據(jù)本發(fā)明，步驟2、中所述的將氧化石墨烯作為固相載體加入到緩沖溶液中，染料標(biāo)記寡核苷酸探針吸附到氧化石墨烯表面的溫度可以是室溫，優(yōu)選的是25°C。根據(jù)本發(fā)明，步驟2、中所述的寡核苷酸探針吸附到氧化石墨烯表面的速度非?？欤^察到熒光猝滅的時(shí)間約為2分鐘。根據(jù)本發(fā)明，步驟幻中所述的在寡核苷酸/氧化石墨烯復(fù)合物中加入互補(bǔ)鏈進(jìn)行反應(yīng)的溫度可以是室溫，優(yōu)選的是25°C。通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)作用，形成雙螺旋結(jié)構(gòu)。根據(jù)本發(fā)明，步驟4)中所述的寡核苷酸與其互補(bǔ)鏈形成雙螺旋結(jié)構(gòu)后，從氧化石墨烯表面脫離的時(shí)間約為25分鐘。根據(jù)本發(fā)明，步驟5)中所述的寡核苷酸互補(bǔ)鏈經(jīng)Sl核酸酶的降解作用的反應(yīng)溫度可以是四°C 39 °C，優(yōu)選的是37 °C。根據(jù)本發(fā)明，步驟幻中所述的寡核苷酸互補(bǔ)鏈經(jīng)過(guò)Sl核酸酶的降解作用的時(shí)間為30分鐘。根據(jù)本發(fā)明，步驟6)中所述的經(jīng)過(guò)Sl核酸酶降解后的寡核苷酸互補(bǔ)鏈，加入寡核苷酸/石墨烯復(fù)合物中進(jìn)行反應(yīng)的時(shí)間為25分鐘。根據(jù)本發(fā)明，步驟7)中所述的當(dāng)抑制劑腺苷三磷酸存在時(shí)，在寡核苷酸互補(bǔ)鏈中加入Sl核酸酶進(jìn)行作用，反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間同步驟5)。根據(jù)本發(fā)明，步驟8)中所述的當(dāng)抑制劑腺苷三磷酸存在時(shí)，經(jīng)過(guò)Sl核酸酶作用后的寡核苷酸互補(bǔ)鏈，加入寡核苷酸/石墨烯復(fù)合物中進(jìn)行反應(yīng)的時(shí)間約為25分鐘。下面結(jié)合附圖，用Sl核酸酶的檢測(cè)實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。但本發(fā)明并不僅限于檢測(cè)核酸酶及其抑制劑，也并不受實(shí)施例中其他條件的限制。熒光檢測(cè)所用的儀器為熒光分光度計(jì)(RF-5301，日本)。熒光光譜測(cè)量條件氙燈激發(fā)，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度為5. Onm和10. Onm,電壓為950V，響應(yīng)時(shí)間2S，激發(fā)波長(zhǎng)為 480nm，發(fā)射波長(zhǎng)掃描范圍490 650nm ；用3mL石英比色皿進(jìn)行測(cè)量，樣品體積1. 60mL ；室本發(fā)明實(shí)施例中所用的氧化石墨烯是根據(jù)文獻(xiàn)(W. S. Hummers, R. Ε. Offeman， J. Am. Chem. Soc. 1958，80，1339-1339)中 Hummers 的方法合成的。本發(fā)明實(shí)施例中所用的寡核苷酸探針及互補(bǔ)鏈均購(gòu)自上海生物工程技術(shù)有限公司，序列分別為(5，-FAM-ATCTTGACTATGTGGGTGCT-3，)和(5，-AGCACCCACATAGTCAAGAT-3，)； Sl核酸酶和腺苷三磷酸購(gòu)自上海生物工程技術(shù)有限公司；酶切液成分為OmM CH3COONa, 15mM NaCl,0. ImMZnSO4, pH 4. 6 ；所用的緩沖溶液成分為20mM Tris-HCl, IOOmM NaCl, 5mMKCl,5mM MgCl2, pH 7· 4。實(shí)施例1制備寡核苷酸/氧化石墨烯復(fù)合物將1 μ L濃度為2 μ M的熒光素標(biāo)記的寡核核苷酸探針加入到ImL的Tris-HCl緩沖溶液中，再加入0. 6mL水進(jìn)行熒光檢測(cè)；然后再加入1. 8 μ L濃度為lmg/mL的氧化石墨烯溶液，該探針會(huì)迅速吸附到氧化石墨烯表面，并將熒光素的信號(hào)猝滅。實(shí)施例2寡核苷酸互補(bǔ)鏈的檢測(cè)檢測(cè)1 將1 μ L濃度為30 μ M的寡核苷酸互補(bǔ)鏈加入到寡核苷酸/氧化石墨烯復(fù)合物中，互補(bǔ)鏈與寡核苷酸探針形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，從氧化石墨烯表面脫離，進(jìn)行熒光檢測(cè) (激發(fā)波長(zhǎng)480nm，發(fā)射波長(zhǎng)490 650nm)，可以觀察到熒光的恢復(fù)現(xiàn)象。同時(shí)將1 μ L濃度為50μΜ的非互補(bǔ)鏈加入作為對(duì)照，其它條件相同。實(shí)施例3核酸酶及其抑制劑的檢測(cè)檢測(cè)2 將IyL濃度為1.6μ M的熒光素標(biāo)記的寡核核苷酸探針加入到ImL的 Tris-HCl緩沖溶液中，再加入0. 6mL的水進(jìn)行熒光檢測(cè)；然后再加入1. 5 μ L濃度為lmg/mL 的氧化石墨烯溶液，該探針會(huì)迅速吸附到氧化石墨烯表面，并將熒光素的信號(hào)猝滅。將3uL濃度為0. OlU的Sl核酸酶和1 μ L濃度為30 μ M的寡核苷酸互補(bǔ)鏈加入到 3uL 酶切液 QmM CH3COONa, 15mM NaCl, 0. ImM ZnSO4,pH 4.6)中，37°C下反應(yīng) 30 分鐘；再將反應(yīng)后的混合液加入到寡核苷酸/氧化石墨烯復(fù)合物中，作為對(duì)照，其它條件與檢測(cè)1中相同。同時(shí)，做如下試驗(yàn)作為對(duì)比。檢測(cè)3 將2. 5 μ L濃度為150mM的腺苷三磷酸和1 μ L濃度為30 μ M的寡核苷酸互補(bǔ)鏈加入到 3uL 酶切液中(pH 4. 6,2mM CH3COONa, 15mM NaCl，0. ImM ZnSO4)，再加入 3uL 濃度為0. OlU的Sl核酸酶，37°C下反應(yīng)30分鐘；將反應(yīng)后的混合液加入到寡核苷酸/氧化石墨烯復(fù)合物中，作為對(duì)照，其它條件與檢測(cè)1中相同。結(jié)果檢測(cè)1中寡核苷酸互補(bǔ)鏈和非互補(bǔ)鏈的熒光信號(hào)恢復(fù)強(qiáng)度相比相差很大?？梢妼?shí)驗(yàn)的選擇性很強(qiáng)。檢測(cè)2和3中寡核苷酸互補(bǔ)鏈經(jīng)Sl核酸酶降解作用及當(dāng)腺苷三磷酸存在時(shí)的降解作用相比，熒光強(qiáng)度相差很大?？梢姳景l(fā)明對(duì)核酸酶及其抑制劑的檢測(cè)具有高度的特異性。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)Sl核酸酶及其抑制劑的熒光方法，其特征在于該方法包括以下步驟a.將染料標(biāo)記的寡核苷酸熒光探針加入到緩沖溶液中，以480nm為激發(fā)波長(zhǎng)，進(jìn)行熒光檢測(cè)，記錄該探針的熒光發(fā)射譜帶；b.將氧化石墨烯加入到上述溶液中，氧化石墨烯作為固相載體吸附自由卷曲狀態(tài)的寡核苷酸探針，形成寡核苷酸/氧化石墨烯復(fù)合物，此時(shí)染料的熒光被氧化石墨烯猝滅；c.經(jīng)Sl核酸酶切割的寡核苷酸互補(bǔ)鏈，加入到寡核苷酸/石墨烯復(fù)合物中進(jìn)行反應(yīng)；d.寡核苷酸互補(bǔ)鏈經(jīng)過(guò)Sl核酸酶的特異性降解作用形成小的堿基片段，無(wú)法與氧化石墨烯表面的寡核苷酸鏈探針形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，從而寡核苷酸探針不能脫離氧化石墨烯的表面，染料的熒光信號(hào)不能恢復(fù)；根據(jù)熒光信號(hào)恢復(fù)的程度實(shí)現(xiàn)對(duì)Si核酸酶的定性及定量檢測(cè)；e.寡核苷酸互補(bǔ)鏈在抑制劑腺苷三磷酸存在下經(jīng)Sl核酸酶降解作用，加入寡核苷酸/ 氧化石墨烯復(fù)合物中進(jìn)行反應(yīng)；f.寡核苷酸互補(bǔ)鏈在抑制劑腺苷三磷酸存在下不會(huì)被Sl核酸酶降解，與寡核苷酸探針形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，寡核苷酸探針脫離氧化石墨烯的表面，染料的熒光信號(hào)得以恢復(fù)；根據(jù)熒光信號(hào)恢復(fù)的程度實(shí)現(xiàn)對(duì)抑制劑腺苷三磷酸的定性及定量檢測(cè)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)Sl核酸酶及其抑制劑的熒光方法，其特征是步驟a) 所述的將染料標(biāo)記的寡核苷酸熒光探針加入到緩沖溶液中，用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)，所用染料為熒光素；染料標(biāo)記在寡核苷酸探針的5’端；寡核苷酸探針堿基組成為 5，-FAM-ATCTTGACTATGTGGGTGCT-3，；所用緩沖溶液為 20mOTris-HCl，IOOmM NaCl, 5mM KCl, 5mM MgCl2,pH = 7.4 ；所用熒光檢測(cè)方法為將探針溶液加入到1. 6mL緩沖溶液中進(jìn)行熒光發(fā)射光譜的掃描，激發(fā)波長(zhǎng)為480nm，發(fā)射波長(zhǎng)掃描范圍為490-650nm。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)Sl核酸酶及其抑制劑的熒光方法，其特征是步驟b)所述的寡核苷酸/氧化石墨烯復(fù)合物的形成，是通過(guò)非共價(jià)鍵相互作用使寡核苷酸探針吸附到氧化石墨烯表面；寡核苷酸吸附到氧化石墨烯表面后，染料的熒光被氧化石墨烯猝滅，將氧化石墨烯加入到含有寡核苷酸探針的緩沖溶液中后，室溫放置5分鐘，然后進(jìn)行熒光檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)為480nm，掃描范圍為490-650nm。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)Sl核酸酶及其抑制劑的熒光方法，其特征是步驟c)經(jīng) Sl核酸酶切割的寡核苷酸互補(bǔ)鏈，加入到寡核苷酸/石墨烯復(fù)合物中進(jìn)行反應(yīng)，所用的寡核苷酸互補(bǔ)鏈探針堿基組成為5’ -AGCACCCACATAGTCAAGAT-3’ ；加入含有S 1酶的寡核苷酸互補(bǔ)鏈溶液或其它等體積的對(duì)照溶液后熒光信號(hào)恢復(fù)所用的時(shí)間為室溫，25分鐘左右。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)Sl核酸酶及其抑制劑的熒光方法，其特征是所述的熒光信號(hào)用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)為480nm，發(fā)射波長(zhǎng)掃描范圍為490-650nm。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)Sl核酸酶及其抑制劑的熒光方法，其特征是所述的熒光探針為任意一段單鏈寡核苷酸，染料標(biāo)記在5’端，或是3’端。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)Sl核酸酶及其抑制劑的熒光方法，其特征是所述的染料標(biāo)記是熒光素或異硫氰酸熒光素。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)Sl核酸酶及其抑制劑的熒光方法，其特征是步驟d)所述的寡核苷酸互補(bǔ)鏈經(jīng)Sl核酸酶降解作用，是通過(guò)Sl核酸酶對(duì)單鏈DNA或RNA特異性的降解作用，形成5’磷酸結(jié)構(gòu)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的檢測(cè)Sl核酸酶及其抑制劑的熒光方法，其特征是Sl核酸酶對(duì)寡核苷酸互補(bǔ)鏈的酶切過(guò)程所用酶切溶液為2mM CH3COONa, 15mMNaCl,0. ImM ZnSO4,pH = 4. 6 ；酶切溫度為37°C，時(shí)間為30分鐘。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)Sl核酸酶及其抑制劑的熒光方法，其特征是步驟e)所述的寡核苷酸互補(bǔ)鏈在抑制劑腺苷三磷酸存在下經(jīng)Si核酸酶降解作用，是腺苷三磷酸能夠抑制Sl核酸酶對(duì)單鏈DNA或RNA切割的特異性降解作用；當(dāng)抑制劑腺苷三磷酸存在時(shí)， Sl核酸酶對(duì)寡核苷酸互補(bǔ)鏈的作用條件與上述酶切條件相同。
全文摘要
本發(fā)明是一種利用寡核苷酸和氧化石墨烯檢測(cè)S1核酸酶及其抑制劑的熒光方法。該方法以氧化石墨烯為固相載體，通過(guò)其與核酸堿基之間的相互作用使染料標(biāo)記的寡核苷酸探針吸附在表面并將其熒光猝滅。未被降解的互補(bǔ)鏈可以與探針雜交形成雙螺旋結(jié)構(gòu)并從氧化石墨烯表面脫離，體系熒光得以恢復(fù)；當(dāng)有S1核酸酶存在時(shí)，互補(bǔ)鏈被降解成小的堿基片段，不能與探針形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，探針仍然吸附在氧化石墨烯表面，熒光呈猝滅狀態(tài)；腺苷三磷酸可有效抑制核酸酶對(duì)互補(bǔ)鏈的降解作用，從而使體系的熒光恢復(fù)。因此，通過(guò)檢測(cè)體系熒光強(qiáng)度的變化即可實(shí)現(xiàn)對(duì)S1核酸酶及其抑制劑的檢測(cè)。本發(fā)明方法簡(jiǎn)便、快速、具有較高的靈敏度和選擇性，在核酸酶檢測(cè)方面具有重要的意義。
文檔編號(hào)C12Q1/44GK102321759SQ20111024534
公開日2012年1月18日 申請(qǐng)日期2011年8月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月25日
發(fā)明者劉興奮, 苗麗坤, 范曲立, 馬延文, 黃維 申請(qǐng)人:南京郵電大學(xué)