一種基于g四聚體的熒光法檢測(cè)納米銀顆粒的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于G四聚體的熒光法檢測(cè)納米銀顆粒的方法，首先利用雙氧水在酸性環(huán)境中將銀納米顆粒轉(zhuǎn)化成單價(jià)銀離子，得到待檢測(cè)的樣品溶液；然后分別配置不同濃度的多種銀離子溶液，作為標(biāo)準(zhǔn)品溶液以便繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；配置G-DNA并分別與等體積的樣品溶液及標(biāo)準(zhǔn)品溶液混合，使其充分相互作用；隨后加入鉀離子使G-DNA折疊成G四聚體結(jié)構(gòu)；最后加入N-甲基卟啉二丙酸IX(NMM)，通過熒光法測(cè)定樣品溶液中納米銀的含量。本發(fā)明采用熒光法對(duì)納米銀進(jìn)行定量檢測(cè)，具有靈敏度高、操作簡單、用時(shí)短等優(yōu)點(diǎn)；檢測(cè)中采用的介質(zhì)為G-DNA，具有合成簡單，成本低廉，化學(xué)穩(wěn)定性好等特點(diǎn)。
【專利說明】—種基于G四聚體的熒光法檢測(cè)納米銀顆粒的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及環(huán)境檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及的是一種基于G四聚體的熒光法檢測(cè)納米銀顆粒的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]納米銀是將粒徑制備到1-1OOnm的金屬銀單質(zhì)，其粒徑大多在20nm左右，具有廣譜殺菌作用，而且不產(chǎn)生耐藥性，因此在多個(gè)領(lǐng)域中(醫(yī)療衛(wèi)生、紡織、涂料、日用品和化妝品、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)等)得到廣泛應(yīng)用。人工納米銀顆粒的大量生產(chǎn)和使用將不可避免的導(dǎo)致其進(jìn)入環(huán)境并在環(huán)境中擴(kuò)散。然而，大量研究表明，納米銀可能對(duì)生態(tài)環(huán)境和人類健康帶來潛在的負(fù)面影響。例如，納米銀在洗涮過程中很容易滲漏到廢水中，從而破壞處理廠處理廢水所用的有益細(xì)菌；還可以對(duì)湖泊或河流中的水生生物造成威脅；納米銀在殺菌的同時(shí)，其性能也會(huì)影響土壤中環(huán)境友好型菌落的生長及繁殖，從而降低土壤的使用價(jià)值；納米銀可以與一些代謝酶相互作用，從而對(duì)體內(nèi)代謝途徑造成影響；納米銀也對(duì)人體健康具有潛在的危害，研究表明，納米銀的毒性與其內(nèi)部特征及氧化狀態(tài)有關(guān)，最終導(dǎo)致炎癥、細(xì)胞毒性以及遺傳毒性等的發(fā)生。日益增加的納米銀的使用逐漸引起大家對(duì)其造成的環(huán)境危害和潛在健康威脅的重視；然而，對(duì)于納米銀的檢測(cè)很少有報(bào)到，而且大都基于傳統(tǒng)的質(zhì)譜、色譜等分析方法，耗時(shí)費(fèi)力并且費(fèi)用昂貴；因此，急需發(fā)展簡便快速的方法來檢測(cè)環(huán)境中納米銀的含量。
[0003]G-DNA是一段富含G堿基重復(fù)序列的單鏈DNA，在鉀離子存在的情況下，通過G堿基間Hoogsteen氫鍵形成G四分體,進(jìn)而通過非共價(jià)的n - Ji堆積作用形成具有更高結(jié)構(gòu)順序的G四聚體結(jié)構(gòu)。已有研究表明銀離子可以與G堿基相互作用從而破壞G四聚體的結(jié)構(gòu)。利用此特性，已經(jīng)報(bào)道了利用G四聚體生物傳感器檢測(cè)水樣中重金屬離子的方法。在我們的研究中發(fā)現(xiàn)納米銀顆粒也可以破壞G四聚體的結(jié)構(gòu)，并且納米銀粒徑越小，作用越明顯。然而通過G四聚體無法直接區(qū)分或檢測(cè)樣品中總的納米銀顆?？偭?。而在酸性條件下，雙氧水可以將納米銀轉(zhuǎn)化成銀離子。這給我們一個(gè)重要的啟示:利用雙氧水將樣品中納米銀轉(zhuǎn)化成銀離子后，再通過G四聚體檢測(cè)銀離子的量將能夠方便的得到樣品中納米銀的含量。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種基于G四聚體的熒光法檢測(cè)納米銀顆粒的方法。
[0005]本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
[0006]一種基于G四聚體的熒光法檢測(cè)納米銀顆粒的方法，包括如下步驟:
[0007](I)配置待檢測(cè)的樣品溶液:在納米銀水溶液中加入一定量的磷酸，調(diào)成酸性環(huán)境，然后加入雙氧水混合均勻，將納米銀水溶液中的納米銀顆粒完全轉(zhuǎn)化成銀離子，得到待檢測(cè)的樣品溶液；
[0008](2)配置多種標(biāo)準(zhǔn)品溶液:分別配置一定范圍內(nèi)不同濃度的多種銀離子溶液，作為標(biāo)準(zhǔn)品溶液以便繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0009](3)取多份含G堿基重復(fù)序列的單鏈DNA (G-DNA)配置G-DNA溶液，所述G-DNA序列為TGGGTAGGGCGGGTTGGGAAA，加熱變性后，分別與等體積的樣品溶液、多種標(biāo)準(zhǔn)品溶液混合并冷卻至室溫，得到多份混合溶液一；
[0010](4)分別在多份混合溶液一中加入KAC、Triton X-100溶液得到多份混合溶液二，使G-DNA折疊形成G四聚體結(jié)構(gòu)；
[0011](5)在多份混合溶液二中，分別加入N-甲基卟啉二丙酸IX(NMM)得到多份混合溶液三，使NMM與G-DNA相互作用形成穩(wěn)定的復(fù)合體；
[0012](6)通過熒光光譜儀測(cè)定多份混合溶液三的熒光光譜，根據(jù)多種標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度與其相對(duì)應(yīng)的最大熒光吸收值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線即可推算樣品溶液中納米銀顆粒的含量。
[0013]作為上述的一種基于G四聚體的熒光法檢測(cè)納米銀顆粒的方法的優(yōu)選實(shí)施方式，
[0014]所述步驟(I)中，樣品溶液的體積為0.25?lmL，樣品溶液中磷酸終濃度為I μ Μ、雙氧水的終濃度為2mM ；
[0015]所述步驟⑵中，分別配置0.5?10 μ M范圍內(nèi)不同濃度的多種銀離子溶液，作為標(biāo)準(zhǔn)品溶液；
[0016]所述步驟(3)中，配置0.25?ImL 0.2-1 μ M G-DNA溶液，并加入EDTA螯合去除其中存在干擾的其他二價(jià)金屬離子，加熱變性后，分別與等體積的樣品溶液、多種標(biāo)準(zhǔn)品溶液混合并冷卻至室溫，得到多份混合溶液一；
[0017]所述步驟(4)中，多份混合溶液二中KAC終濃度為ImM，Triton X-100終濃度為
0.05% ；
[0018]所述步驟(5)中，多份混合溶液三中NMM的終濃度為I μ Μ。
[0019]本發(fā)明的工作原理為:
[0020]G-DNA在鉀離子存在的條件下，能形成結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的G四聚體，G四聚體與NMM相互作用后，能顯著提升NMM的熒光值。而在銀離子存在的情況下，銀離子能夠與G堿基相互作用，從而破壞G-DNA形成G四聚體的能力，使G四聚體與NMM的作用減弱，NMM的熒光值降低。本發(fā)明利用雙氧水在酸性條件下將樣品溶液中的納米銀顆粒完全氧化成為銀離子，然后與G-DNA相互作用并加入鉀離子，破壞G四聚體結(jié)構(gòu)，并分別配置待檢測(cè)的樣品溶液和作為參考的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，采用熒光定量的方法，通過G-DNA與NMM復(fù)合物的熒光值變化來推算樣品溶液中納米銀的含量。
[0021]本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn):
[0022]本發(fā)明提供的一種基于G四聚體的熒光法檢測(cè)納米銀顆粒的方法，將G-DNA用于納米銀的檢測(cè)中，該方法簡單、快速，靈敏度高，不需要繁瑣的前期處理及復(fù)雜的分析儀器，且可以大批量分析樣品，能夠大大提高樣品分析的效率，具有較大的應(yīng)用前景。檢測(cè)中采用的介質(zhì)為G-DNA，具有合成簡單，成本低廉，化學(xué)穩(wěn)定性好等特點(diǎn)。此外，本發(fā)明采用熒光分析法，相比于比色法來說，不受反應(yīng)中雙氧水對(duì)G-DNA活性的影響，體系更加穩(wěn)定，檢測(cè)得到的結(jié)果更加穩(wěn)定和準(zhǔn)確。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1是本發(fā)明的的工作原理示意圖。
[0024]附圖中符號(hào)及簡寫:.納米銀顆粒；銀離子；NMM:N-甲基卟啉二丙酸IX。

【具體實(shí)施方式】
[0025]下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明，本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。
[0026]實(shí)施例一
[0027]一種基于G四聚體的熒光法檢測(cè)納米銀顆粒的方法，包括如下步驟:
[0028](I)配置待檢測(cè)的樣品溶液:在納米銀水溶液中，加入2.5μ L ΙΟΟμΜ的磷酸和5.7 μ L 88mM的雙氧水,加入后溶液總體積為250 μ L,使H3PO4和H2O2的終濃度分別為I μ M和2 mM，混勻后室溫反應(yīng)30 min，得到待檢測(cè)的的樣品溶液；
[0029](2)配置多種標(biāo)準(zhǔn)品溶液:分別配置濃度為0.5、1、2、4、6、8、10μΜ的七種硝酸銀溶液，作為七種標(biāo)準(zhǔn)品溶液以便繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0030](3)取八份2 μ L的100 μ M含G堿基重復(fù)序列的單鏈DNA (G-DNA)溶液，所述G-DNA序列為 TGGGTAGGGCGGGTTGGGAAA，分別加入到八份 248 μ L 的 20mM Tris-Ac, 2mMEDTA, pH8.0的溶液中，在90°C加熱5min變性后，分別與等體積的樣品溶液、七種標(biāo)準(zhǔn)品溶液混合并在室溫下靜置30min，得到八份混合溶液一；
[0031](4)分別在八份混合溶液一中加入5μ L 10mM KAC, 5% Triton X-100溶液，使KAc和Triton X-100的終濃度分別達(dá)到ImM和0.05 %，得到八份混合溶液二，混勻后室溫靜置30min，使G-DNA折疊形成G四聚體結(jié)構(gòu)；
[0032](5)在八份混合溶液二中，分別加入5 μ L 100 μ M的N-甲基卟啉二丙酸IX(NMM)得到八份混合溶液三，混合溶液三中NMM的終濃度為I μ Μ，使NMM與G-DNA相互作用形成穩(wěn)定的復(fù)合體；
[0033](6)通過熒光光譜儀測(cè)定八份混合溶液三的熒光光譜，激發(fā)波長:399nm ;發(fā)射波長:500-750nm，根據(jù)七種種標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度與其相對(duì)應(yīng)的608nm處最大熒光吸收值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線即可推算樣品溶液中納米銀顆粒的含量。
[0034]實(shí)施例二
[0035]一種基于G四聚體的熒光法檢測(cè)納米銀顆粒的方法，包括如下步驟:
[0036](I)配置待檢測(cè)的樣品溶液:在納米銀水溶液中，加入10μ L ΙΟΟμΜ的磷酸和20 μ L 10mM的雙氧水，加入后溶液總體積為lmL，使H3PO4和H2O2的終濃度分別為I μ M和2mM，混勻后室溫反應(yīng)30min，得到待檢測(cè)的的樣品溶液；
[0037](2)配置多種標(biāo)準(zhǔn)品溶液:分別配置濃度為0.5、1、2、4、6、8、10μΜ的七種硝酸銀溶液，作為七種標(biāo)準(zhǔn)品溶液以便繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0038](3)取八份8 μ L的100 μ M含G堿基重復(fù)序列的單鏈DNA (G-DNA)溶液，所述G-DNA序列為 TGGGTAGGGCGGGTTGGGAAA，分別加入到八份 992 μ L 的 20mM Tris-Ac, 2mMEDTA, pH
8.0的溶液中，在90°C加熱5min變性后，分別與等體積的樣品溶液、七種標(biāo)準(zhǔn)品溶液混合并在室溫下靜止30min，得到八份混合溶液一；
[0039](4)分別在八份混合溶液一中加入20 μ L 10mM KAC, 5% Triton X-100溶液，使KAc和Triton X-100的終濃度分別達(dá)到ImM和0.05%，得到八份混合溶液二，混勻后室溫靜置30min，使G-DNA折疊形成G四聚體結(jié)構(gòu)；
[0040](5)在八份混合溶液二中，分別加入20 μ L ΙΟΟμΜ的N-甲基卟啉二丙酸IX(NMM)得到八份混合溶液三，混合溶液三中NMM的終濃度為I μ Μ，使NMM與G-DNA相互作用形成穩(wěn)定的復(fù)合體；
[0041](6)通過熒光光譜儀測(cè)定八份混合溶液三的熒光光譜，激發(fā)波長:399nm ;發(fā)射波長:500-750nm，根據(jù)七種種標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度與其相對(duì)應(yīng)的608nm處最大熒光吸收值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線即可推算樣品溶液中納米銀顆粒的含量。
[0042]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種基于G四聚體的熒光法檢測(cè)納米銀顆粒的方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)配置待檢測(cè)的樣品溶液:在納米銀水溶液中加入一定量的磷酸，調(diào)成酸性環(huán)境，然后加入雙氧水混合均勻，將納米銀水溶液中的納米銀顆粒完全轉(zhuǎn)化成銀離子，得到待檢測(cè)的樣品溶液； (2)配置多種標(biāo)準(zhǔn)品溶液:分別配置一定范圍內(nèi)不同濃度的多種銀離子溶液，作為標(biāo)準(zhǔn)品溶液以便繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線； (3)取多份含G堿基重復(fù)序列的單鏈DNA(G-DNA)配置G-DNA溶液，所述G-DNA序列為TGGGTAGGGCGGGTTGGGAAA，加熱變性后，分別與等體積的樣品溶液、多種標(biāo)準(zhǔn)品溶液混合并冷卻至室溫，得到多份混合溶液一； (4)分別在多份混合溶液一中加入KAC、TritonX-100溶液得到多份混合溶液二，使G-DNA折疊形成G四聚體結(jié)構(gòu)； (5)在多份混合溶液二中，分別加入N-甲基卟啉二丙酸IX(NMM)得到多份混合溶液三，使NMM與G-DNA相互作用形成穩(wěn)定的復(fù)合體； (6)通過熒光光譜儀測(cè)定多份混合溶液三的熒光光譜，根據(jù)多種標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度與其相對(duì)應(yīng)的最大熒光吸收值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線即可推算樣品溶液中納米銀顆粒的含量。
2.如權(quán)利要求1所述的一種基于G四聚體的熒光法檢測(cè)納米銀顆粒的方法，其特征在于， 所述步驟⑴中，樣品溶液的體積為0.25?lmL，樣品溶液中磷酸終濃度為I μ Μ、雙氧水的終濃度為2mM ； 所述步驟(2)中，分別配置0.5?10 μ M范圍內(nèi)不同濃度的多種銀離子溶液，作為標(biāo)準(zhǔn)品溶液； 所述步驟(3)中，配置0.25?ImL 0.2-1 μ M G-DNA溶液，并加入EDTA螯合去除其中存在干擾的其他二價(jià)金屬離子，加熱變性后，分別與等體積的樣品溶液、多種標(biāo)準(zhǔn)品溶液混合并冷卻至室溫，得到多份混合溶液一； 所述步驟⑷中，多份混合溶液二中KAC終濃度為ImM，Triton X-1OO終濃度為.0.05% ； 所述步驟(5)中，多份混合溶液三中NMM的終濃度為I μ M0
【文檔編號(hào)】G01N21/64GK104132919SQ201410371127
【公開日】2014年11月5日 申請(qǐng)日期:2014年7月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月30日
【發(fā)明者】徐升敏, 陳少鵬, 吳李君 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院合肥物質(zhì)科學(xué)研究院