本發(fā)明涉及啞鈴結(jié)構(gòu)寡核苷酸(dumbbellstructureoligonucleotide,dso)、包含其的核酸擴(kuò)增用引物及利用該引物的核酸擴(kuò)增方法，更具體而言，涉及一種在進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)中，能夠在每個(gè)第一周期的與模板結(jié)合之前排除非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的利用了啞鈴結(jié)構(gòu)寡核苷酸的多重基因擴(kuò)增及單核苷酸多態(tài)性分析方法。

背景技術(shù)：

現(xiàn)在，研究人員為了獲得基因試樣而最普遍使用的方法是利用了dna聚合酶的聚合酶鏈反應(yīng)方法。聚合酶鏈反應(yīng)中所利用的寡核苷酸被設(shè)計(jì)成結(jié)合于模板dna相反一側(cè)鏈。所述方法任意調(diào)節(jié)、設(shè)計(jì)能夠與模板dna結(jié)合的寡核苷酸的長(zhǎng)度和堿基序列，從而具有能夠只使靶基因的所需部位準(zhǔn)確地?cái)U(kuò)增的優(yōu)點(diǎn)，相反，由于一次反應(yīng)只能使一個(gè)目的基因擴(kuò)增，在要擴(kuò)增的目的基因數(shù)量較多的情況下，存在需要重復(fù)執(zhí)行同一作業(yè)的缺點(diǎn)。

為了解決這種問(wèn)題，正在致力于開(kāi)發(fā)將兩種以上的模板基因和與各個(gè)模板基因相應(yīng)的引物混合成為一體而進(jìn)行聚合鏈反應(yīng)的諸多方法，而且，為了改善引物的結(jié)合特異性并據(jù)此能夠?qū)崿F(xiàn)產(chǎn)物的擴(kuò)增而開(kāi)發(fā)了許多方法。諸如降落pcr(donetal.,1991)、熱啟動(dòng)pcr(daquilaetal.,1991)、巢式pcr(mullisandfaloona,1987)及加強(qiáng)pcr(ruanoetal.,1989)。作為此外的其它接近方式，利用各種增強(qiáng)劑化合物，改善pcr的特異性，在這些增強(qiáng)劑化合物中，包括有有效提高結(jié)合反應(yīng)溫度的化學(xué)物質(zhì)、dna結(jié)合蛋白、可商業(yè)利用的反應(yīng)物質(zhì)等。但是，在所有pcr方法中，無(wú)法導(dǎo)出并獲得成功的結(jié)果物，在多種結(jié)合溫度條件下測(cè)試這些添加物是需要投入大量時(shí)間和精力的工作。雖然所述接近方式在改善引物退火特異性方面發(fā)揮某種程度的貢獻(xiàn)，但所述這些方法卻無(wú)法成為對(duì)于由用于pcr擴(kuò)增的引物所導(dǎo)致的諸如非異物性產(chǎn)物及高背景問(wèn)題的根本解決方案。另外，一次能夠成功擴(kuò)增的基因數(shù)量?jī)H為3至4個(gè)，未改善各基因間的競(jìng)爭(zhēng)或干擾效應(yīng)、非特異性產(chǎn)物的擴(kuò)增等缺點(diǎn)，實(shí)質(zhì)上無(wú)法使用。

于是，為了進(jìn)行多重聚合酶鏈反應(yīng)及等位基因特異pcr，必須使目的模板基因的條件最優(yōu)化，為此需要承受大量時(shí)間和精力及樣品的消耗，由于如此最優(yōu)化的條件并不適用于其它基因，為了克服這種問(wèn)題，開(kāi)發(fā)了接頭聚合酶鏈反應(yīng)(linkerpcr)或通過(guò)連接介導(dǎo)的聚合酶鏈反應(yīng)(ligationmediatedpcr)(參照：journalofclinicalmicrobiology,43(11)：5622-5627,2005)等方法。但是，接頭聚合酶鏈反應(yīng)由于將在第一管中反應(yīng)的產(chǎn)物一部分轉(zhuǎn)移到第二管并進(jìn)行反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)特性，存在可能發(fā)生嚴(yán)重的交叉污染問(wèn)題，連接介導(dǎo)聚合酶鏈反應(yīng)由于利用了多種酶的復(fù)雜實(shí)驗(yàn)方法給研究人員帶來(lái)困難，因而只在一部分情況下利用這種實(shí)驗(yàn)方法。

因此，要求開(kāi)發(fā)一種廉價(jià)且能夠簡(jiǎn)單地實(shí)現(xiàn)基因擴(kuò)增的技術(shù)。為了迎合這種要求而開(kāi)發(fā)的技術(shù)就是通過(guò)只是簡(jiǎn)單操作引物，防止在到達(dá)pcr反應(yīng)適合溫度之前發(fā)生擴(kuò)增的方法。作為這種方法的示例，有大韓民國(guó)專(zhuān)利授權(quán)號(hào)649165所公開(kāi)的發(fā)明。在該技術(shù)中，在初始引物中附加插入有調(diào)節(jié)子(regulator)部位。該調(diào)節(jié)子部位為多聚脫氧肌苷連接(polydeoxyinosinelinker)，構(gòu)成該調(diào)節(jié)子部位的肌苷(inosine)是具有比作為構(gòu)成通常引物的普通核甘酸的g、a、t、c更低tm值的普適堿基(universalbase)，因而在特定溫度下，該多聚脫氧肌苷連接形成“泡沫狀結(jié)構(gòu)(bubblelikestructure)”，阻止引物非特異性結(jié)合于模板，發(fā)揮抑制pcr非特異擴(kuò)增的作用。該技術(shù)與前述的現(xiàn)有技術(shù)相比，在其實(shí)現(xiàn)方面雖然略微價(jià)廉，但在實(shí)際pcr中，存在需要使第一周期的結(jié)合階段的溫度(pcr反應(yīng)適合溫度)與第二周期中的結(jié)合階段的溫度互不相同的不便。這是為了從第二pcr周期開(kāi)始，使附加導(dǎo)入于引物的序列也能夠參與啟動(dòng)。當(dāng)然，并非必須要求這一“不同溫度的應(yīng)用”，但是為了高效的pcr而需要應(yīng)用不同的溫度。另外，在所述技術(shù)中還存在如下限制：需要在5'-末端部位附加預(yù)選隨機(jī)核甘酸序列，并且其不應(yīng)與模板的任何位置互補(bǔ)。這導(dǎo)致附加的不便，進(jìn)而當(dāng)無(wú)法獲知模板的所有基因序列時(shí)，導(dǎo)致無(wú)法確信能否成功地應(yīng)用所述技術(shù)。因此，需要開(kāi)發(fā)一種能夠比現(xiàn)有技術(shù)更低廉、更易實(shí)現(xiàn)的新方法。這種非特異擴(kuò)增的抑制技術(shù)在所有pcr中當(dāng)然很重要，特別是在應(yīng)用于實(shí)施基因檢查、疾病檢查等的診斷(diagnosis)領(lǐng)域的pcr中更加重要。

<在先技術(shù)文獻(xiàn)>(專(zhuān)利文獻(xiàn)1)kr10-0649165b

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

所要解決的技術(shù)問(wèn)題

因此，本發(fā)明的目的在于解決這種現(xiàn)有技術(shù)的問(wèn)題和自過(guò)去要求的技術(shù)問(wèn)題。

本發(fā)明的目的在于提供一種pcr用引物和利用其的pcr方法，其通過(guò)抑制常溫下非目的pcr擴(kuò)增，因而能夠?qū)崿F(xiàn)熱啟動(dòng)pcr，另外，pcr擴(kuò)增時(shí)，與自初始模板起的擴(kuò)增相比，使自pcr產(chǎn)物起的擴(kuò)增處于優(yōu)勢(shì)，結(jié)果，能夠抑制pcr中的非特異擴(kuò)增。

因此，本發(fā)明人為了開(kāi)發(fā)僅憑一次聚合酶鏈反應(yīng)就能夠使多個(gè)基因擴(kuò)增的方法，經(jīng)過(guò)專(zhuān)心致力于研究的結(jié)果，確認(rèn)了在制作要擴(kuò)增的基因堿基序列的引物時(shí)，當(dāng)利用由啞鈴結(jié)構(gòu)寡核苷酸(dumbbellstructureoligonucleotide,dso)構(gòu)成的引物時(shí)，通過(guò)一次聚合酶鏈反應(yīng)，就能夠使互不相同的大量基因迅速、準(zhǔn)確地同時(shí)擴(kuò)增，從而完成了本發(fā)明，上述啞鈴結(jié)構(gòu)寡核苷酸在5`-末端附加了能夠與3～5bp的3`-末端互補(bǔ)結(jié)合的任意堿基序列和用于連接該兩個(gè)部位的3～5bp普適堿基對(duì)以形成啞鈴結(jié)構(gòu)(dumbbellstructure)。

最終，本發(fā)明的主要目的是提供一種方法，該方法利用附加了3～5bp普適堿基對(duì)的引物，僅憑一次聚合酶鏈反應(yīng)就能夠使可以存在于所有樣品中的基因擴(kuò)增，該普適堿基對(duì)用于連接在5`-末端附加插入的3～5bp的與3`-末端互補(bǔ)的任意堿基序列和模板特異性堿基序列。

解決技術(shù)問(wèn)題的方案

為了解決所述課題，本發(fā)明提供以如下通式表示的啞鈴結(jié)構(gòu)寡核苷酸，

通式：5'-ap-bq-cr-3'

其中，所述a代表包含具有與所述3'-末端的連續(xù)堿基序列互補(bǔ)的堿基序列的核甘酸的5'-低tm特異性部位，所述b代表包含具有普適堿基的核甘酸的切割部位，所述c代表包含具有與模板核酸的特定連續(xù)堿基序列互補(bǔ)的堿基序列的核甘酸的3'-高tm特異性部位，所述p、q及r代表核甘酸數(shù)目。

優(yōu)選所述p包含3～5個(gè)核甘酸。

優(yōu)選所述q包含3～5個(gè)核甘酸。

優(yōu)選所述r包含18～30個(gè)核甘酸。

優(yōu)選所述5'-低tm特異性部位的tm低于所述3'-高tm特異性部位的tm。

優(yōu)選所述切割部位的tm低于所述5'-低tm特異性部位的tm及所述3'-高tm特異性部位的tm。

優(yōu)選所述5'-低tm特異性部位的tm為10～30℃。

優(yōu)選所述切割部位的tm為3～10℃。

優(yōu)選所述3'-高tm特異性部位的tm為50～65℃。

優(yōu)選所述普適堿基選自由脫氧肌苷、肌苷、7-脫氮-2'-脫氧肌苷、2-氮雜-2'-脫氧肌苷、2'-ome肌苷、2'-f肌苷及它們的組合所構(gòu)成的組中。

優(yōu)選所述啞鈴結(jié)構(gòu)寡核苷酸選自由序列號(hào)1至序列號(hào)35所構(gòu)成的組中。

另外，本發(fā)明提供包含以如下通式表示的啞鈴結(jié)構(gòu)寡核苷酸的核酸擴(kuò)增用引物，

通式：5'-ap-bq-cr-3'

其中，所述a代表包含具有與所述3'-末端的連續(xù)堿基序列互補(bǔ)的堿基序列的核甘酸的5'-低tm特異性部位，所述b代表包含具有普適堿基的核甘酸的切割部位，所述c代表包含具有與模板核酸的特定連續(xù)堿基序列互補(bǔ)的堿基序列的核甘酸的3'-高tm特異性部位，所述p、q及r代表核甘酸數(shù)目。

優(yōu)選所述p包含3～5個(gè)核甘酸。

優(yōu)選所述q包含3～5個(gè)核甘酸。

優(yōu)選所述r包含18～30個(gè)核甘酸。

優(yōu)選所述5'-低tm特異性部位的tm低于所述3'-高tm特異性部位的tm。

優(yōu)選所述切割部位的tm低于所述5'-低tm特異性部位的tm及所述3'-高tm特異性部位的tm。

優(yōu)選所述5'-低tm特異性部位的tm為10～30℃。

優(yōu)選所述切割部位的tm為3～10℃。

優(yōu)選所述3'-高tm特異性部位的tm為50～65℃。

優(yōu)選所述普適堿基選自由脫氧肌苷、肌苷、7-脫氮-2'-脫氧肌苷、2-氮雜-2'-脫氧肌苷、2'-ome肌苷、2'-f肌苷及它們的組合所構(gòu)成的組中。

優(yōu)選所述啞鈴結(jié)構(gòu)寡核苷酸選自由序列號(hào)1至序列號(hào)35所構(gòu)成的組中。

另外，本發(fā)明提供一種核酸擴(kuò)增方法，由包含模板、引物及聚合酶的混合物進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)而使核酸擴(kuò)增，其特征在于，利用核酸擴(kuò)增用引物，該核酸擴(kuò)增用引物包含以如下通式表示的啞鈴結(jié)構(gòu)寡核苷酸，

通式：5'-ap-bq-cr-3'

其中，所述a代表包含具有與所述3'-末端的連續(xù)堿基序列互補(bǔ)的堿基序列的核甘酸的5'-低tm特異性部位，所述b代表包含具有普適堿基的核甘酸的切割部位，所述c代表包含具有與模板核酸的特定連續(xù)堿基序列互補(bǔ)的堿基序列的核甘酸的3'-高tm特異性部位，所述p、q及r代表核甘酸數(shù)目。

優(yōu)選所述p包含3～5個(gè)核甘酸。

優(yōu)選所述q包含3～5個(gè)核甘酸。

優(yōu)選所述r包含18～30個(gè)核甘酸。

優(yōu)選所述5'-低tm特異性部位的tm低于所述3'-高tm特異性部位的tm。

優(yōu)選所述切割部位的tm低于所述5'-低tm特異性部位的tm及所述3'-高tm特異性部位的tm。

優(yōu)選所述5'-低tm特異性部位的tm為10～30℃。

優(yōu)選所述切割部位的tm為3～10℃。

優(yōu)選所述3'-高tm特異性部位的tm為50～65℃。

優(yōu)選所述普適堿基選自由脫氧肌苷、肌苷、7-脫氮-2'-脫氧肌苷、2-氮雜-2'-脫氧肌苷、2'-ome肌苷、2'-f肌苷及它們的組合所構(gòu)成的組中。

優(yōu)選所述啞鈴結(jié)構(gòu)寡核苷酸使用選自由序列號(hào)1至序列號(hào)35所構(gòu)成的組中的核酸擴(kuò)增用引物。

優(yōu)選所述核酸擴(kuò)增方法為利用了二種以上模板的多重聚合酶鏈反應(yīng)。

發(fā)明的效果

本發(fā)明在聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction,pcr)時(shí)，利用啞鈴結(jié)構(gòu)寡核苷酸(dumbbellstructureoligonucleotide,dso)，在常溫下抑制非目的擴(kuò)增產(chǎn)物，因而從結(jié)果上通過(guò)減少非特異擴(kuò)增產(chǎn)物來(lái)高效率地提高敏感度和特異度，改進(jìn)基因擴(kuò)增方法，所述啞鈴結(jié)構(gòu)寡核苷酸通過(guò)附加任意堿基序列和3`-末端模板依賴(lài)型特異堿基序列以及使兩堿基序列連接的普適堿基對(duì)而生成，并且將所述啞鈴結(jié)構(gòu)寡核苷酸的5'-末端寡核苷酸和3`-末端寡核苷酸設(shè)計(jì)成在每個(gè)第一周期的與模板結(jié)合之前互補(bǔ)結(jié)合。如果利用本發(fā)明的基因擴(kuò)增方法，則僅憑一次聚合酶鏈反應(yīng)就能夠使多個(gè)基因擴(kuò)增，而且可以更容易地檢測(cè)分析單核苷酸多態(tài)性，能夠有助于基因相關(guān)領(lǐng)域研究開(kāi)發(fā)的進(jìn)步。

附圖說(shuō)明

圖1是示出用于多重基因同時(shí)擴(kuò)增方法的引物的結(jié)構(gòu)性特征的圖。

圖2是示出自pcr期間的第三周期起，與基于初始模板的擴(kuò)增相比，以pcr產(chǎn)物為模板的擴(kuò)增占據(jù)優(yōu)勢(shì)的模式圖。

圖3示出在靶依賴(lài)性延伸反應(yīng)中本發(fā)明的啞鈴結(jié)構(gòu)寡核苷酸的原理。(a)顯示了在高嚴(yán)格條件下由于啞鈴結(jié)構(gòu)寡核苷酸的高雜交特異性而無(wú)法發(fā)生擴(kuò)增的環(huán)境，(b)顯示了啞鈴結(jié)構(gòu)寡核苷酸成功發(fā)生延伸反應(yīng)。

圖4是利用基因擴(kuò)增方法來(lái)擴(kuò)增的性傳播疾病病原菌的電泳照片。

圖5是示出利用了啞鈴結(jié)構(gòu)寡核苷酸和等位基因特異性聚合酶鏈反應(yīng)的mthfr基因c677t的snp解讀結(jié)果的圖。

圖6是示出利用了啞鈴結(jié)構(gòu)寡核苷酸和等位基因特異性聚合酶鏈反應(yīng)的braf基因v600e的snps解讀結(jié)果的圖。

圖7是示出利用了啞鈴結(jié)構(gòu)寡核苷酸和等位基因特異性聚合酶鏈反應(yīng)的apc基因的snps解讀結(jié)果的圖。

具體實(shí)施方式

下面詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。

本發(fā)明人在為了開(kāi)發(fā)僅通過(guò)一次聚合酶鏈反應(yīng)就能夠使多個(gè)基因擴(kuò)增的方法，在進(jìn)行各種研究的過(guò)程中，著眼于如果用作模板的各個(gè)基因和能夠與之互補(bǔ)結(jié)合的引物可以分別特異性地結(jié)合，則可以通過(guò)一次聚合酶鏈反應(yīng)而使多個(gè)基因擴(kuò)增，以期提高引物對(duì)模板基因的特異選擇性。

因此，作為本發(fā)明的優(yōu)選具體例，提供一種使用啞鈴結(jié)構(gòu)寡核苷酸，利用模板依賴(lài)性延伸反應(yīng)來(lái)制造核酸分子的方法。

作為本發(fā)明的另一優(yōu)選具體例，提供一種在一個(gè)dna或核酸混合物中，使靶核酸序列選擇性擴(kuò)增的方法。

作為本發(fā)明的又一優(yōu)選具體例，提供一種在同一反應(yīng)中利用兩個(gè)以上的引物對(duì)而同時(shí)使兩個(gè)以上的靶核甘酸序列擴(kuò)增的方法。

作為本發(fā)明的又一優(yōu)選具體例，提供一種利用模板依賴(lài)性延伸反應(yīng)檢測(cè)具有遺傳多樣性的核酸分子的方法。

作為本發(fā)明的又一優(yōu)選具體例，提供一種通過(guò)模板依賴(lài)性延伸反應(yīng)來(lái)制造核酸分子的啞鈴結(jié)構(gòu)寡核苷酸。

作為本發(fā)明又一優(yōu)選具體例，提供一種用于改善寡核苷酸的退火特異性的方法。

通過(guò)下述發(fā)明的詳細(xì)說(shuō)明、權(quán)利要求書(shū)及附圖，如上所述的本發(fā)明的多樣具體例將更加明確。

本發(fā)明涉及一種啞鈴結(jié)構(gòu)寡核苷酸及利用其的各種方法。本發(fā)明的啞鈴結(jié)構(gòu)寡核苷酸由于經(jīng)改善的特異性，使引物或探針退火到靶核酸上，能夠極大改善核酸擴(kuò)增(特別是pcr)的特異性。

因此，本發(fā)明提供以如下通式表示的啞鈴結(jié)構(gòu)寡核苷酸：

通式：5'-ap-bq-cr-3'

其中，所述a代表包含具有與所述3'-末端的連續(xù)堿基序列互補(bǔ)的堿基序列的核甘酸的5'-低tm特異性部位，所述b代表包含具有普適堿基的核甘酸的切割部位，所述c代表包含具有與模板核酸的特定連續(xù)堿基序列互補(bǔ)的堿基序列的核甘酸的3'-高tm特異性部位，所述p、q及r代表核甘酸數(shù)目。

優(yōu)選所述p包含3～5個(gè)核甘酸。

優(yōu)選所述q包含3～5個(gè)核甘酸。

優(yōu)選所述r包含18～30個(gè)核甘酸。

優(yōu)選所述5'-低tm特異性部位的tm低于所述3'-高tm特異性部位的tm。

優(yōu)選所述切割部位的tm低于所述5'-低tm特異性部位的tm及所述3'-高tm特異性部位的tm。

優(yōu)選所述5'-低tm特異性部位的tm為10～30℃。

優(yōu)選所述切割部位的tm為3～10℃。

優(yōu)選所述3'-高tm特異性部位的tm為50～65℃。

優(yōu)選所述普適堿基選自由脫氧肌苷、肌苷、7-脫氮-2'-脫氧肌苷、2-氮雜-2'-脫氧肌苷、2'-ome肌苷、2'-f肌苷及它們的組合所構(gòu)成的組中。

優(yōu)選所述啞鈴結(jié)構(gòu)寡核苷酸選自由序列號(hào)1至序列號(hào)35所構(gòu)成的組中。

另外，本發(fā)明提供核酸擴(kuò)增用引物，該核酸擴(kuò)增用引物包含以如下通式表示的啞鈴結(jié)構(gòu)寡核苷酸：

通式：5'-ap-bq-cr-3'

其中，所述a代表包含具有與所述3'-末端的連續(xù)堿基序列互補(bǔ)的堿基序列的核甘酸的5'-低tm特異性部位，所述b代表包含具有普適堿基的核甘酸的切割部位，所述c代表包含具有與模板核酸的特定連續(xù)堿基序列互補(bǔ)的堿基序列的核甘酸的3'-高tm特異性部位，所述p、q及r代表核甘酸數(shù)目。

優(yōu)選所述p包含3～5個(gè)核甘酸。

優(yōu)選所述q包含3～5個(gè)核甘酸。

優(yōu)選所述r包含18～30個(gè)核甘酸。

優(yōu)選所述5'-低tm特異性部位的tm低于所述3'-高tm特異性部位的tm。

優(yōu)選所述切割部位的tm低于所述5'-低tm特異性部位的tm及所述3'-高tm特異性部位的tm。

優(yōu)選所述5'-低tm特異性部位的tm為10～30℃。

優(yōu)選所述切割部位的tm為3～10℃。

優(yōu)選所述3'-高tm特異性部位的tm為50～65℃。

優(yōu)選所述普適堿基選自由脫氧肌苷、肌苷、7-脫氮-2'-脫氧肌苷、2-氮雜-2'-脫氧肌苷、2'-ome肌苷、2'-f肌苷及它們的組合所構(gòu)成的組中。

優(yōu)選所述啞鈴結(jié)構(gòu)寡核苷酸選自由序列號(hào)1至序列號(hào)35所構(gòu)成的組中。

另外，本發(fā)明提供核酸擴(kuò)增方法，由包含模板、引物及聚合酶的混合物進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)而使核酸擴(kuò)增，其特征在于，利用核酸擴(kuò)增用引物，該核酸擴(kuò)增用引物包含以如下通式表示的啞鈴結(jié)構(gòu)寡核苷酸，

通式：5'-ap-bq-cr-3'

其中，所述a代表包含具有與所述3'-末端的連續(xù)堿基序列互補(bǔ)的堿基序列的核甘酸的5'-低tm特異性部位，所述b代表包含具有普適堿基的核甘酸的切割部位，所述c代表包含具有與模板核酸的特定連續(xù)堿基序列互補(bǔ)的堿基序列的核甘酸的3'-高tm特異性部位，所述p、q及r代表核甘酸數(shù)目。

優(yōu)選所述p包含3～5個(gè)核甘酸。

優(yōu)選所述q包含3～5個(gè)核甘酸。

優(yōu)選所述r包含18～30個(gè)核甘酸。

優(yōu)選所述5'-低tm特異性部位的tm低于所述3'-高tm特異性部位的tm。

優(yōu)選所述切割部位的tm低于所述5'-低tm特異性部位的tm及所述3'-高tm特異性部位的tm。

優(yōu)選所述5'-低tm特異性部位的tm為10～30℃。

優(yōu)選所述切割部位的tm為3～10℃。

優(yōu)選所述3'-高tm特異性部位的tm為50～65℃。

優(yōu)選所述普適堿基選自由脫氧肌苷、肌苷、7-脫氮-2'-脫氧肌苷、2-氮雜-2'-脫氧肌苷、2'-ome肌苷、2'-f肌苷及它們的組合所構(gòu)成的組中。

優(yōu)選所述啞鈴結(jié)構(gòu)寡核苷酸使用選自由序列號(hào)1至序列號(hào)35所構(gòu)成的組中的核酸擴(kuò)增用引物。

優(yōu)選所述核酸擴(kuò)增方法為利用了二種以上的模板的多重聚合酶鏈反應(yīng)。

根據(jù)本發(fā)明的一種方式，本發(fā)明提供以如下通式表示并且通過(guò)模板依賴(lài)性延伸反應(yīng)來(lái)合成核酸分子的啞鈴結(jié)構(gòu)寡核苷酸。

通式：5`-ap-bq-cr-3`

所述a是能夠與從所述通式的3`-末端連續(xù)的一部分序列實(shí)質(zhì)性互補(bǔ)結(jié)合的堿基序列，b代表包含普適堿基對(duì)的切割部位，c代表針對(duì)雜交的模板核酸的一個(gè)位置而實(shí)質(zhì)性互補(bǔ)的堿基序列，p、q及r為核苷酸的數(shù)目，a、b及c為脫氧核甘酸或核糖核苷酸，所述切割部位在a、b及c的3個(gè)部位中具有最低tm；可知所述切割部位在所述a和b結(jié)合于所述模板核酸的條件下，形成非堿基對(duì)發(fā)卡結(jié)構(gòu)，在對(duì)所述模板核酸的結(jié)合特異性方面，使得所述a從b分離，所述寡核苷酸的結(jié)合特異性由a及b兩者決定，能夠提高引物對(duì)模板基因的特異選擇性。

本發(fā)明的啞鈴結(jié)構(gòu)寡核苷酸在多個(gè)領(lǐng)域中非常有用，該領(lǐng)域包括miller,h.i.在wo89/06700中提及的方法及davey,c.等在ep329,822中提及的方法、諸如連接酶鏈反應(yīng)(lcr,wu,d.y.etal.,genomics4：560(1989))、聚合酶連接酶鏈反應(yīng)(barany,pcrmethodsandapplic.,1：5-16(1991))、gap-lcr(wo90/01069)、修復(fù)鏈反應(yīng)(ep439,182)、3sr(kwohetal.,pnas,usa,86：1173(1989))及nasba(u.s.pat.no.5,130,238)等的引物相關(guān)核酸擴(kuò)增方法，諸如循環(huán)測(cè)序(kretzetal.,(1994)cyclesequencing.pcrmethodsappl.3：s107-s112)及焦磷酸測(cè)序(ronaghietal.,(1996)anal.biochem.,242：84-89；及(1998)science281：363-365)等的引物延伸相關(guān)技術(shù)，以及諸如使用寡核苷酸微陣列的靶核苷酸序列檢測(cè)的雜交相關(guān)技術(shù)。

圖1是示出用于多重基因同時(shí)擴(kuò)增方法的引物的結(jié)構(gòu)性特征的圖。如圖1所示，在制作要擴(kuò)增的基因的引物時(shí)，制作了由啞鈴結(jié)構(gòu)寡核苷酸構(gòu)成的引物，在進(jìn)入每個(gè)第一周期時(shí)，沒(méi)有與模板堿基序列互補(bǔ)結(jié)合，因而抑制了非特異性結(jié)合，而在聚合酶鏈反應(yīng)中與模板基因雜交時(shí)，為了能夠在中央形成凸起部(bulge)而以3bp～5bp普適堿基對(duì)進(jìn)行替代，將5'-末端部分的3～5bp堿基序列替代為能夠與3`-末端部位互補(bǔ)結(jié)合的堿基序列，3`末端部位的堿基序列能夠與要擴(kuò)增的基因互補(bǔ)結(jié)合。確認(rèn)了如果利用如此制作的引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，則即使退火溫度變化，模板基因也能正常擴(kuò)增，相反，在退火溫度變化的條件下，如果利用現(xiàn)有的引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，則隨著退火溫度的提高而擴(kuò)增率下降，模板基因沒(méi)有正常擴(kuò)增(參照：圖2)。因此確認(rèn)如果利用本發(fā)明的dso引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，則提高引物對(duì)模板基因的特異選擇性，即使在將多個(gè)模板基因和與之相應(yīng)的各個(gè)引物混合而進(jìn)行一次聚合酶鏈反應(yīng)的情況下，各個(gè)模板基因也可以正常擴(kuò)增，將通過(guò)如此使用dso引物而憑借一次聚合酶鏈反應(yīng)就能夠使多個(gè)模板基因擴(kuò)增的方法命名為“digplex^tm”。

結(jié)果，本發(fā)明的多重基因同時(shí)擴(kuò)增方法包括如下步驟：(i)從2至30個(gè)靶基因分別選擇要擴(kuò)增的部位的步驟；(ii)確定能夠與所述被選擇的各個(gè)部位的3'-末端堿基序列互補(bǔ)結(jié)合的5`-末端任意堿基序列，制作附加有位于所述確定的堿基序列中央部的3～5bp普適堿基對(duì)的正義引物的步驟；(iii)確定能夠與所述被選擇的各個(gè)部位的3'-末端堿基序列互補(bǔ)結(jié)合的堿基序列，制作附加有位于所述確定的堿基序列中央部的3～5bp普適堿基對(duì)的反義引物的步驟；(iv)將所述2至30個(gè)靶基因和分別與所述靶基因相應(yīng)的所述制作的2至30個(gè)正義引物及反義引物全部混合，利用所述混合物，進(jìn)行一次聚合酶鏈反應(yīng)的步驟；及(v)確認(rèn)利用所述聚合酶鏈反應(yīng)來(lái)獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物的步驟。此時(shí)，沒(méi)有特別限制聚合酶鏈反應(yīng)時(shí)溫度及時(shí)間條件。另外，沒(méi)有特別限制對(duì)于獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物的確認(rèn)。

如果利用本發(fā)明的多重基因同時(shí)擴(kuò)增方法，則僅憑一次聚合酶鏈反應(yīng)就可以使多個(gè)基因擴(kuò)增，可以容易地實(shí)現(xiàn)單核苷酸多態(tài)性分析，能夠有助于基因相關(guān)領(lǐng)域研究開(kāi)發(fā)的進(jìn)步。

下面，通過(guò)確認(rèn)是否存在感染性疾病病原菌的實(shí)施例和分析引起心血管疾病的mthfr基因、作為甲狀腺乳頭狀癌病因的braf基因及大腸癌相關(guān)apc基因的單核苷酸多態(tài)性，更詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明。這些實(shí)施例只用于更具體地說(shuō)明本發(fā)明，根據(jù)本發(fā)明的要旨，本發(fā)明的范圍不限定于這些實(shí)施例，這是本領(lǐng)域的技術(shù)人員不言而喻的。

[實(shí)施例]

實(shí)施例1：性傳播性疾病特異基因的擴(kuò)增

在從獲取自20名性傳播性疾病可疑患者的樣本中提取dna，對(duì)于獲取的dna，混合2μl的10x聚合酶鏈反應(yīng)緩沖溶液(750mmtris-hcl(ph9.0)、20mmmgcl2、500mmkcl、200mm(nh4)2so4)、2μl的2.5mmdntp混合物(2.5mmdatp,2.5mmdgtp,2.5mmdttp,2.5mmdctp)、2.0unit的taq聚合酶(biotools,spain)及1μl的具有序列號(hào)1至26、36及37的堿基序列的ds引物(0.5μm)，加入三蒸水，滴定至20μl后，進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(94℃下10分鐘，94℃下30秒，65℃下60秒，72℃下60秒，35個(gè)周期)，獲得了擴(kuò)增產(chǎn)物。此時(shí)，使用的各個(gè)dso引物的堿基序列如下表1所示。作為參考，在本說(shuō)明書(shū)附帶的序列目錄上的序列號(hào)1至序列號(hào)37中記載的堿基序列中，文字“n”如下表1和表2所示，意味著“肌苷(inosine),i”。

表1

1)疾病類(lèi)型

tp:treponemapallidum(梅毒螺旋體)

mg:mycoplasmagenitalium(生殖器支原體)

ng:neisseriagonorrhoeae(淋病奈瑟氏菌)

mh:mycoplasmahominis(人型支原體)

uu:ureaplasmaurealyticum(解脲支原體)

gv:gardenerellavaginalis(陰道加德納菌)

ct:chlamydiatrachomatis(沙眼衣原體)

hsv2:herpessimplexvirus(單純皰疹病毒)

2ca:candidaalbicans(白色念珠菌)

hsv1:herpessimplexvirus(單純皰疹病毒)

1up:ureaplasmaparvum(微小脲原體)

ic:gapdh

接著，在2.0％瓊脂糖凝膠中，對(duì)進(jìn)行了聚合酶鏈反應(yīng)的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行電泳(參照?qǐng)D4)。圖4是通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)而擴(kuò)增的12種性傳播疾病病原菌電泳照片，圖4的1號(hào)示出擴(kuò)增被ca感染的臨床樣本的圖像，2號(hào)示出擴(kuò)增被up、gv感染的臨床樣本的圖像，3號(hào)示出擴(kuò)增被gv感染的臨床樣本的圖像，4號(hào)示出擴(kuò)增被ct感染的臨床樣本的圖像，5號(hào)示出擴(kuò)增被gv感染的臨床樣本的圖像，6號(hào)示出擴(kuò)增被up、ca感染的臨床樣本的圖像，7號(hào)示出擴(kuò)增被mh、up、gv感染的臨床樣本的圖像，8號(hào)示出擴(kuò)增陰性樣本的圖像，9號(hào)示出擴(kuò)增被gv、ct感染的臨床樣本的圖像，10號(hào)示出擴(kuò)增被up、hsv2、ca感染的臨床樣本的圖像，11號(hào)示出擴(kuò)增被ca感染的臨床樣本的圖像，12號(hào)和13號(hào)示出擴(kuò)增陰性樣本的圖像，14號(hào)示出擴(kuò)增被gv、ct感染的臨床樣本的圖像，15號(hào)示出擴(kuò)增被ct、tv感染的臨床樣本的圖像，16號(hào)、17號(hào)、18號(hào)及19號(hào)示出擴(kuò)增陰性樣本的圖像，20號(hào)示出擴(kuò)增被up、gv感染的臨床樣本的圖像，21號(hào)示出擴(kuò)增陰性樣本的圖像，22號(hào)示出擴(kuò)增被up感染的臨床樣本的圖像，23號(hào)示出擴(kuò)增被up、gv、ca感染的臨床樣本的圖像，24號(hào)示出擴(kuò)增陰性樣本的圖像，25號(hào)示出擴(kuò)增被mh、gv感染的臨床樣本的圖像，26號(hào)示出擴(kuò)增被up感染的臨床樣本的圖像，27號(hào)示出擴(kuò)增被mh、gv感染的臨床樣本的圖像，28號(hào)示出擴(kuò)增被up、ca感染的臨床樣本的圖像，29號(hào)示出擴(kuò)增被mh、uu、gv感染的臨床樣本的圖像，30號(hào)示出擴(kuò)增被ca感染的臨床樣本的圖像，31號(hào)示出擴(kuò)增陰性樣本的圖像，32號(hào)示出擴(kuò)增陰性對(duì)照組的圖像。如以上結(jié)果所示，可以確認(rèn)當(dāng)使用利用了本發(fā)明dso引物的多重基因同時(shí)擴(kuò)增方法時(shí)，能夠通過(guò)一次聚合酶鏈反應(yīng)來(lái)使多個(gè)基因擴(kuò)增。

實(shí)施例2：利用dso引物的mthfr基因、braf基因及apc基因的單核苷酸多態(tài)性分析

為了使從商業(yè)途徑取得的人類(lèi)mthfr、braf、apc基因(wildtype,heterotype,homotype)擴(kuò)增，將人類(lèi)基因組dna(invitrogeninc.,usa)用作模板，利用具有如下堿基序列的正常引物進(jìn)行擴(kuò)增后，通過(guò)實(shí)施利用了限制酶處理的結(jié)果確認(rèn)方法以及利用本發(fā)明的dso引物的聚合酶鏈反應(yīng)，確認(rèn)了擴(kuò)增產(chǎn)物。

表2

將采集自人類(lèi)血液中的2μl(50ng/μl)的基因組dna、2μl的10x聚合酶鏈反應(yīng)緩沖溶液(750mmtris-hcl(ph9.0)、20mmmgcl2、500mmkcl、200mm(nh4)2so4)、2μl的2.5mmdntp混合物(2.5mmdatp、2.5mmdgtp、2.5mmdttp、2.5mmdctp)、1.5unit的taq聚合酶(biotools,spain)及1μl的所述各個(gè)dso引物的混合物(0.5μm)混合，加入三蒸水，滴定至20μl后，進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)。此時(shí)，聚合酶鏈反應(yīng)的條件為94℃下10分鐘，94℃下30秒，退火60秒，72℃下60秒，在這種條件下進(jìn)行35個(gè)周期，在退火溫度分別為60℃、55℃及62℃的不同溫度下進(jìn)行，然后結(jié)束反應(yīng)，將擴(kuò)增的切片在2％(w/v)瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳(參照?qǐng)D5、6、7)。

圖5用于確認(rèn)與心血管疾病有密切關(guān)聯(lián)性的mthfr基因有無(wú)突變，顯示出以通過(guò)現(xiàn)有分析方法聚合酶鏈反應(yīng)-限制酶性段長(zhǎng)度多態(tài)性法來(lái)確認(rèn)其類(lèi)型的16名臨床樣本為對(duì)象，進(jìn)行等位基因特異pcr分析的結(jié)果。在圖像中，m是確認(rèn)擴(kuò)增產(chǎn)物大小的大小標(biāo)記。臨床樣本1、3、5、7、8、9、11、12及13為高半胱氨酸濃度高的臨床樣本，在本分析中確認(rèn)了兼具wild(野生型)和mutant(突變型)，臨床樣本2、4、10、14及15為心血管疾病患者，在本分析中確認(rèn)了只具有mutant(突變型)，臨床樣本6和16為正常人，在本分析中確認(rèn)了只具有wild(野生型)。

圖6用于確認(rèn)與甲狀腺癌有密切關(guān)聯(lián)的braf基因有無(wú)突變，顯示出以通過(guò)現(xiàn)有分析方法聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性法來(lái)確認(rèn)其類(lèi)型的16名臨床樣本為對(duì)象，進(jìn)行等位基因特異pcr分析的結(jié)果。在圖像中，m是確認(rèn)擴(kuò)增產(chǎn)物大小的大小標(biāo)記。臨床樣本1、5、6、7、10、12及16為正常人，在本分析中確認(rèn)了只具有wild(野生型)，臨床樣本3、8、11、13及15出現(xiàn)甲狀腺功能異常，為患者臨床樣本，在本分析中確認(rèn)了兼具wild(野生型)和mutant(突變型)，臨床樣本2、4、9及14為甲狀腺癌患者，在本分析中確認(rèn)了只具有mutant(突變型)。

圖7用于確認(rèn)與家族性息肉病(大腸癌)有密切關(guān)聯(lián)的apc基因有無(wú)突變，顯示出以通過(guò)現(xiàn)有分析方法聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性法來(lái)確認(rèn)其類(lèi)型的16名臨床樣本為對(duì)象，進(jìn)行等位基因特異pcr分析的結(jié)果。在圖像中，m是確認(rèn)擴(kuò)增產(chǎn)物大小的大小標(biāo)記。臨床樣本1、2、3、4、8、9、10、11、12、14及16為正常人，在本分析中確認(rèn)了只具有wild(野生型)，經(jīng)大腸內(nèi)視鏡結(jié)果，確認(rèn)臨床樣本6、7、13及15有息肉，在本分析中確認(rèn)了兼具wild(野生型)和mutant(突變型)，臨床樣本5為原位癌0期患者，在本分析中確認(rèn)了只具有mutant(突變型)。

sequencelisting

<110>精確診斷有限公司(diogeneco.,ltd.)

<120>啞鈴結(jié)構(gòu)寡核苷酸、包含其的核酸擴(kuò)增用引物及利用其的核酸擴(kuò)增方法

<130>pa17012153wnp

<160>37

<170>kopatentin2.0

<210>1

<211>38

<212>dna

<213>ompa5'-引物

<220>

<221>modified_base

<222>(6)..(10)

<223>“n”指肌苷。

<400>1cgaggnnnnngactacccaaaccttcaacgacacctcg38

<210>2

<211>38

<212>dna

<213>ompa3'-引物

<220>

<221>modified_base

<222>(6)..(10)

<223>“n”指肌苷。

<400>2cgcatnnnnncaagccaagaccgcaagtgaataatgcg38

<210>3

<211>38

<212>dna

<213>pora5'-引物

<220>

<221>modified_base

<222>(6)..(10)

<223>“n”指肌苷。

<400>3ccaaannnnnttacagactggcggcggtttcgttttgg38

<210>4

<211>35

<212>dna

<213>pora3'-引物

<220>

<221>modified_base

<222>(6)..(10)

<223>“n”指肌苷。

<400>4caagcnnnnngtcgactgcacacccgaacagcttg35

<210>5

<211>36

<212>dna

<213>btub15'-引物

<220>

<221>modified_base

<222>(6)..(10)

<223>“n”指肌苷。

<400>5cagctnnnnncctcgatgtcatccgtaaggaagctg

<210>6

<211>39

<212>dna

<213>btub13'-引物

<220>

<221>modified_base

<222>(6)..(10)

<223>“n”指肌苷。

<400>6gtcagnnnnngagcttacgaaggtcggagttgagctgac39

<210>7

<211>47

<212>dna

<213>gyra5'-引物

<220>

<221>modified_base

<222>(6)..(10)

<223>“n”指肌苷。

<400>7catctnnnnntgccaatcctaagataaattccaaaccagaagagatg47

<210>8

<211>41

<212>dna

<213>gyra3'-引物<220>

<221>modified_base

<222>(6)..(10)

<223>“n”指肌苷。

<400>8gaccannnnncctagctccttataagcttgaactgctggtc41

<210>9

<211>41

<212>dna

<213>gap5'-引物

<220>

<221>modified_base

<222>(6)..(10)

<223>“n”指肌苷。

<400>9gatatnnnnncgcccgtcaaactatgggagctggtaatatc41

<210>10

<211>46

<212>dna

<213>gap3'-引物

<220>

<221>modified_base

<222>(6)..(10)

<223>“n”指肌苷。

<400>10gctttnnnnnctgagtttcctcattcggagatcaacggattaaagc46

<210>11

<211>41

<212>dna

<213>gap5'-引物

<220>

<221>modified_base

<222>(6)..(10)

<223>“n”指肌苷。

<400>11catgtnnnnnggatgaacgctggctgtgtgcctaatacatg41

<210>12

<211>39

<212>dna

<213>gap3'-引物

<220>

<221>modified_base

<222>(6)..(10)

<223>“n”指肌苷。

<400>12gactgnnnnncatcgctttctgacaaggtaccgtcagtc39

<210>13

<211>38

<212>dna

<213>16s5'-引物

<220>

<221>modified_base

<222>(6)..(10)

<223>“n”指肌苷。

<400>13cactcnnnnnggagtttttgtgcacgctcggttgagtg

<210>14

<211>32

<212>dna

<213>16s3'-引物

<220>

<221>modified_base

<222>(6)..(10)

<223>“n”指肌苷。

<400>14cgtgannnnncaacggtctgggcagattcacg32

<210>15

<211>36

<212>dna

<213>phr15'-引物

<220>

<221>modified_base

<222>(6)..(10)

<223>“n”指肌苷。

<400>15cgcaannnnncatcgaatctttgaacgcacattgcg36

<210>16

<211>34

<212>dna

<213>phr13'-引物<220>

<221>modified_base

<222>(6)..(10)

<223>“n”指肌苷。

<400>16gcggtnnnnngatatacgtggtggacgttaccgc34

<210>17

<211>34

<212>dna

<213>glyc5'-引物

<220>

<221>modified_base

<222>(6)..(10)

<223>“n”指肌苷。

<400>17ccaggnnnnngtcaacgaccatattcacgcctgg34

<210>18

<211>38

<212>dna

<213>glyc3'-引物

<220>

<221>modified_base

<222>(6)..(10)

<223>“n”指肌苷。

<400>18gagatnnnnncagacggagccgttggtgataagatctc38

<210>19

<211>41

<212>dna

<213>glyc5'-引物

<220>

<221>modified_base

<222>(6)..(10)

<223>“n”指肌苷。

<400>19cttgannnnngatgtttgcttggtcgttcctggtcctcaag41

<210>20

<211>33

<212>dna

<213>glyc3'-引物

<220>

<221>modified_base

<222>(6)..(10)

<223>“n”指肌苷。

<400>20catgannnnnccgtcgggactgaacgtctcatg33

<210>21

<211>38

<212>dna

<213>gap5'-引物

<220>

<221>modified_base

<222>(6)..(10)

<223>“n”指肌苷。

<400>21gcaagnnnnngtccatttcaacaagcacgcaaacttgc

<210>22

<211>48

<212>dna

<213>gap3'-引物

<220>

<221>modified_base

<222>(6)..(10)

<223>“n”指肌苷。

<400>22cacctnnnnntggagcattaatttggctatcatctttttgaataggtg48

<210>23

<211>42

<212>dna

<213>p475'-引物

<220>

<221>modified_base

<222>(6)..(10)

<223>“n”指肌苷。

<400>23gtatgnnnnngtgcgtactcggagcttgcagagaagacatac42

<210>24

<211>48

<212>dna

<213>p473'-引物<220>

<221>modified_base

<222>(6)..(10)

<223>“n”指肌苷。

<400>24cgaggnnnnngggctgcaattctttgttcttcgagttttcgtgcctcg48

<210>25

<211>43

<212>dna

<213>p275'-引物

<220>

<221>modified_base

<222>(6)..(10)

<223>“n”指肌苷。

<400>25gatggnnnnnggtcgcattatagccaaagttaccgctaccatc43

<210>26

<211>45

<212>dna

<213>p273'-引物

<220>

<221>modified_base

<222>(6)..(10)

<223>“n”指肌苷。

<400>26ctgaannnnntcaaatccgtcagcaaattgaagattcaacttcag45

<210>27

<211>31

<212>dna

<213>mthfr5'-引物

<220>

<221>modified_base

<222>(6)..(10)

<223>“n”指肌苷。

<400>27atcttnnnnntgctgttggaaggtgcaagat31

<210>28

<211>28

<212>dna

<213>mthfr野生型3'-引物

<220>

<221>modified_base

<222>(6)..(10)

<223>“n”指肌苷。

<400>28ccgatnnnnngcgtgatgatgaaatcgg28

<210>29

<211>28

<212>dna

<213>mthfr突變型3'-引物

<220>

<221>modified_base

<222>(6)..(10)

<223>“n”指肌苷。

<400>29tcgatnnnnngcgtgatgatgaaatcga

<210>30

<211>30

<212>dna

<213>braf5'-引物

<220>

<221>modified_base

<222>(6)..(10)

<223>“n”指肌苷。

<400>30caatgnnnnngaatatctgggcctacattg30

<210>31

<211>28

<212>dna

<213>braf野生型3'-引物

<220>

<221>modified_base

<222>(6)..(10)

<223>“n”指肌苷。

<400>31tgaaannnnncactccatcgagatttca28

<210>32

<211>28

<212>dna

<213>braf突變型3'-引物

<220>

<221>modified_base

<222>(6)..(10)

<223>“n”指肌苷。

<400>32agaaannnnncactccatcgagatttct28

<210>33

<211>28

<212>dna

<213>apc5'-引物

<220>

<221>modified_base

<222>(6)..(10)

<223>“n”指肌苷。

<400>33gaggtnnnnnccacacagaactaacctc28

<210>34

<211>28

<212>dna

<213>apc野生型3'-引物

<220>

<221>modified_base

<222>(6)..(10)

<223>“n”指肌苷。

<400>34agtttnnnnnttatgagaaaagcaaact28

<210>35

<211>28

<212>dna

<213>apc突變型3'-引物

<220>

<221>modified_base

<222>(6)..(10)

<223>“n”指肌苷。

<400>35ggtttnnnnnttatgagaaaagcaaacc28

<210>36

<211>44

<212>dna

<213>gapdg5'-引物

<220>

<221>modified_base

<222>(6)..(10)

<223>“n”指肌苷。

<400>36ggacannnnncacaagtatcactaagctcgctttcttgctgtcc44

<210>37

<211>38

<212>dna

<213>gapdh3'-引物

<220>

<221>modified_base

<222>(6)..(10)

<223>“n”指肌苷。

<400>37ccaaannnnnttacagactggcggcggtttcgttttgg