作為生物標記物的小ncRNA的制作方法
本發(fā)明提供了作為生物標記物的小ncrna，其用于對個體的健康狀況進行分類。本發(fā)明還提供了鑒定ncrna生物標記物的篩選方法。
背景技術(shù)：
人類基因組編碼大量的小非編碼蛋白質(zhì)的rna(ncrna)轉(zhuǎn)錄物。已經(jīng)描述了多種ncrna類型，包括高豐度轉(zhuǎn)運rna(trna)、核糖體rna(rrna)、小核仁rna(snorna)、微小rna(mirna)、小干擾rna(sirna)、小核rna(snrna)及與piwi相互作用的rna(pirna)(amaraletal.,2008；martens-uzunovaetal.,2013)。mirna通過與靶mrna結(jié)合而起到翻譯阻遏物的作用，其中，mirna在有足夠的序列互補性的位點與靶mrna結(jié)合(ameresetal.,2007)，而高度豐富的細胞質(zhì)yrna通過影響ro蛋白的亞細胞定位而在rna質(zhì)量控制中起作用(simetal.,2009)。除了在確定的亞細胞定位處沉默逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的pirna外，其它類型的ncrna(包括sirna和內(nèi)源sirna(endo-sirna))都有成熟mirna對mrna翻譯的抑制活性(chuma和pillai,2009)。mirna活性依賴于在細胞質(zhì)中的足夠的豐度水平，以及與位于核內(nèi)體膜(endosomalmembrane)的rna誘導的沉默復合物(risc)的相互作用(gibbingsetal.,2009；leeetal.,2009a)，而低豐度的mirna對翻譯抑制的影響較小。因此，某一mirna水平的細微變化可能已經(jīng)影響了細胞過程，而強烈的擾動可以引起疾病。除豐度外，與(risc)蛋白質(zhì)和rna伴侶的相互作用及正確的亞細胞定位也是控制mirna生理機能的相關(guān)因素(mullokandovetal.,2012；weeetal.,2012)。
mirna是一類小的、22～25個核苷酸的非編碼調(diào)節(jié)rna，其以高度特異性的方式控制翻譯后基因調(diào)節(jié)和功能的關(guān)鍵方面。由于mirna起特異性基因調(diào)節(jié)因子的作用，并且因為它們的表達在癌癥發(fā)展中經(jīng)常受到干擾，所以對其作為生物標記物的用途進行了研究。某一mirna(oncomir)的過表達(例如mir-21)或表達缺乏(例如mir200家族)似乎與臨床上的侵襲性或轉(zhuǎn)移性疾病結(jié)果相關(guān)。在慢性淋巴細胞性白血病(cll)中，循環(huán)的mirna已用于疾病歸類及對治療性干預響應的預測。
然而，雖然對mirna的圖譜分析是相對標準的技術(shù)，但由于相互矛盾的數(shù)據(jù)，循環(huán)的mirna在臨床上的廣泛實施受到了限制。故需要能更好地預測個體健康狀況的ncrna生物標記物。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的一個方面提供了用于鑒定小非編碼rna(ncrna)生物標記物對的方法，所述方法包括：
-對于ncrna，確定在第一體液樣品中和在第二體液樣品中的所述ncrna的兩個不同種類的比例，所述第一體液樣品獲得自第一個體參照，所述第二體液樣品獲得自第二個體參照，其中，所述第一個體參照相對第二個體參照具有改變的健康狀況，
-比較所述第一體液樣品的比例和所述第二體液樣品的比例，以及
-當比例在所述第一體液樣品與所述第二體液樣品之間發(fā)生改變時，鑒定所述ncrna的兩個不同種類為生物標記物對，
其中，第一種類選自典型的ncrna和具有3'非模板核苷酸添加的ncrna，并且第二種類是具有3'非模板核苷酸添加的ncrna，以及
其中，當所述ncrna是mirna時，所述第一種類選自典型的ncrna、在5'或3'末端剪切的ncrna和具有3'非模板核苷酸添加的ncrna，任選地在5'或3'末端剪切，并且所述第二種類選自在5'或3'末端剪切的ncrna和具有3'非模板核苷酸添加的ncrna，任選地在5'或3'末端剪切。
或者說，其中，第一種類選自典型的ncrna、在5'或3'末端剪切的ncrna和具有3'非模板核苷酸添加的ncrna，該具有3'非模板核苷酸添加的ncrna任選是在5'或3'末端剪切的；
其中，第二種類選自在5'或3'末端剪切的ncrna和具有3'非模板核苷酸添加的ncrna，該具有3'非模板核苷酸添加的ncrna任選是在5'或3'末端剪切的；
其中，當所述ncrna不是mirna時，所述第一種類選自典型的ncrna和具有3'非模板核苷酸添加的ncrna，并且第二種類是具有3'非模板核苷酸添加的ncrna。
優(yōu)選的，所述第一種類和所述第二種類選自典型的ncrna；在5'或3'末端剪切的和/或在5'或3'末端延伸的ncrna；和具有3'非模板核苷酸添加的ncrna，任選地在5'或3'末端剪切或者在5'或3'末端延伸；
其中，當所述ncrna不是mirna時，所述第一種類選自典型的ncrna和具有3'非模板核苷酸添加的ncrna，并且第二種類是具有3'非模板核苷酸添加的ncrna。
優(yōu)選的，所述方法包括確定在第一體液樣品中的所述ncrna的兩個不同種類的量，并且確定在第二體液樣品中的所述ncrna的兩個不同種類的量。
優(yōu)選的，第一個體參照來自一個或多個健康個體，并且所述第二個體參照來自一個或多個具有病癥的個體，其中，所述病癥優(yōu)選優(yōu)選為前列腺癌。
優(yōu)選的，第一個體參照來自具有病癥的個體，并且所述第二個體參照來自治療所述病癥后的同一個體。
在本文公開的方法的優(yōu)選方面中，通過對各樣品中的兩個不同種類進行定量并確定兩個量之間的關(guān)系，來確定生物標記物對的比例。優(yōu)選的，使用深度測序(rna-seq)對上述種類進行定量。
本發(fā)明的另一方面提供了一種收集數(shù)據(jù)的方法，用于使用小非編碼rna(ncrna)生物標記物對對個體的健康狀況進行分類。該方法包括確定來自個體的體液樣本中的生物標記物對的比例，將該比例與來自參照樣品(例如上文所述的第二個體參照)的體液中的生物標記物對的比例進行比較，
其中，所述個體的比例和參照樣品的比例之間是否存在差異有助于對所述個體的健康狀況進行分類，
其中，所述生物標記物對由ncrna的兩個不同種類組成，
其中，所述第一種類選自典型的ncrna和具有3'非模板核苷酸添加的ncrna，第二種類是具有3'非模板核苷酸添加的ncrna，以及
其中，當所述ncrna是mirna時，所述第一種類選自典型的ncrna、在5'或3'末端剪切的ncrna和具有3'非模板核苷酸添加的ncrna，任選地在5'或3'末端剪切，所述第二種類選自在5'或3'末端剪切的ncrna和具有3'非模板核苷酸添加的ncrna，任選地在5'或3'末端剪切。
或者說，其中，第一種類選自典型的ncrna、在5'或3'末端剪切的ncrna和具有3'非模板核苷酸添加的ncrna，該具有3'非模板核苷酸添加的ncrna任選是在5'或3'末端剪切的；
其中，第二種類選自在5'或3'末端剪切的ncrna和具有3'非模板核苷酸添加的ncrna，該具有3'非模板核苷酸添加的ncrna任選是在5'或3'末端剪切的；
其中，當所述ncrna不是mirna時，所述第一種類選自典型的ncrna和具有3'非模板核苷酸添加的ncrna，第二種類是具有3'非模板核苷酸添加的ncrna。
優(yōu)選的，所述第一種類和所述第二種類選自典型的ncrna；在5'或3'末端剪切和/或在5'或3'末端延伸的ncrna；和具有3'非模板核苷酸添加的ncrna，任選地在5'或3'末端剪切或者在5'或3'末端延伸；
其中，當所述ncrna不是mirna時，所述第一種類選自典型的ncrna和具有3'非模板核苷酸添加的ncrna，第二種類是具有3'非模板核苷酸添加的ncrna。
該方法中獲得的數(shù)據(jù)可以單獨或與其他因素(例如，額外的生物標記物的存在、患者的臨床癥狀等)組合，來診斷個體具有病癥。
本發(fā)明的另一個方面提供了使用小非編碼rna(ncrna)生物標記物對，來對個體的健康狀況分類的方法，所述方法包括確定來自所述個體的體液樣本中的生物標記物對的比例，以及將該比例與來自參照樣品的體液中的生物標記物對的比例進行比較，
其中，根據(jù)所述個體的比例和參照樣品的比例之間是否存在差異，對個體的健康狀況進行分類，
其中，所述生物標記物對由兩個不同種類的ncrna組成，
其中，第一種類選自典型的ncrna和具有3'非模板核苷酸添加的ncrna，第二種類是具有3'非模板核苷酸添加的ncrna，以及
其中，當所述ncrna是mirna時，所述第一種類選自典型的ncrna、在5'或3'末端剪切的ncrna和具有3'非模板核苷酸添加的ncrna，任選地在5'或3'末端剪切，所述第二種類選自在5'或3'末端剪切的ncrna和具有3'非模板核苷酸添加的ncrna，任選地在5'或3'末端剪切。
或者說，其中，所述第一種類選自典型的ncrna、在5'或3'末端剪切的ncrna和具有3'非模板核苷酸添加的ncrna，該具有3'非模板核苷酸添加的ncrna任選是在5'或3'末端剪切的；
其中，所述第二種類選自在5'或3'末端剪切的ncrna和具有3'非模板核苷酸添加的ncrna，該具有3'非模板核苷酸添加的ncrna任選是在5'或3'末端剪切的；
其中，當所述ncrna不是mirna時，所述第一種類選自典型的ncrna和具有3'非模板核苷酸添加的ncrna，所述第二種類是具有3'非模板核苷酸添加的ncrna。
優(yōu)選的，所述第一種類和所述第二種類選自典型的ncrna；在5'或3'末端剪切的和/或在5'或3'末端延伸的ncrna；和具有3'非模板核苷酸添加的ncrna，任選地在5'或3'末端剪切或在5'或3'末端延伸；
其中，當所述ncrna不是mirna時，所述第一種類選自典型的ncrna和具有3'非模板核苷酸添加的ncrna，所述第二種類是具有3'非模板核苷酸添加的ncrna。
優(yōu)選的，所述方法包括確定所述個體樣品中的所述生物標記物對的量。
優(yōu)選的，所述參照樣品來自一個或多個健康個體。
優(yōu)選的，所述參照樣品來自一個或多個具有病癥的個體。
優(yōu)選的，本文公開的病癥是癌癥，更優(yōu)選是前列腺癌、乳腺癌、chl、睪丸癌或結(jié)直腸癌。優(yōu)選的，所述病癥是前列腺癌、乳腺癌或chl。優(yōu)選的，所述病癥是阿爾茨海默氏病。
優(yōu)選的，所述參照樣品來自一個或多個個體，所述個體對病癥治療的響應良好或響應不良。
在本文公開的方法的優(yōu)選方面，ncrna選自轉(zhuǎn)運rna(trna)、核糖體rna(rrna)、snorna、微小rna(mirna)、sirna、小核(snrna)、yrna、穹窿體rna(vaultrna)、反義rna和piwirna(pirna)，其中，所述ncrna優(yōu)選選自mirna。
在本文公開的方法的優(yōu)選方面，所述體液是尿液或血液。
在本文公開的方法的優(yōu)選方面，兩個不同種類選自典型的和3'nta-a；典型的和3'nta-g；典型的和3'nta-c；典型的和3'nta-u；3'nta-g和3'nta-c；3'nta-g和3'nta-u；3'nta-g和3'nta-a；3'nta-c和3'nta-u；3'nta-c和3'nta-a；及3'nta-u和3'nta-a；典型的和5'剪切的；典型的和3'剪切的；5'剪切的和3'nta-c；5'剪切的和3'nta-u；5'剪切的和3'nta-a；5'剪切的和3'nta-g；3'剪切的和3'nta-c；3'剪切的和3'nta-u；3'剪切的和3'nta-a；3'剪切的和3'nta-g；3'剪切的和5'剪切的；延伸的和3'nta-a；延伸的和3'nta-g；延伸的和3'nta-c；延伸的和3'nta-u；延伸的和5'剪切的；延伸的和3'剪切的；5'或3'剪切的和5'或3'延伸的；(剪切的和/或延伸的)和3'nta-u；(剪切的和/或延伸的)和3'nta-a；(剪切的和/或延伸的)和3'nta-g；(剪切的和/或延伸的)和3'nta-c；(剪切的和/或延伸的)和典型的。
在本文公開的方法的優(yōu)選方面，所述生物標記物對的每一種ncrna都包括至少16個核苷酸。
圖12提供了本發(fā)明的生物標記物對的示例性實施方式。表1理解為公開了一種生物標記物是典型的序列，而另一種生物標記物是各自的3'nta-a種類，例如典型的hsa-let-7g-5p和3'nta-a的hsa-let-7g-5p。因此，表1a公開了9組獨立的生物標記物對。表1b公開了5組獨立的生物標記物對(例如，典型的hsa-mir-200c-3p和3'nta-u的hsa-mir-200c-3p)；表1c公開了4組獨立的生物標記物對(例如，典型的hsa-mir-204-5p和3'nta-c的hsa-mir-204-5p)；表1d公開了9組獨立的生物標記物對(例如，典型的hsa-let-7f-5p和3'nta-g的hsa-let-7f-5p)；表1e公開了11組獨立的生物標記物對(例如，典型的hsa-let-7f-5p和3'剪切的hsa-let-7f-5p；表1f公開了3組獨立的生物標記物對(例如，典型的hsa-mir-181b-5p和5'剪切的hsa-mir-181b-5p)。
在本文公開的方法的優(yōu)選方面，生物標記物對選自圖12中描述的生物標記物對之一。優(yōu)選的，生物標記物對選自表1a。優(yōu)選的，生物標記物對選自表1b。優(yōu)選的，生物標記物對選自表1c。優(yōu)選的，生物標記物對選自表1d。優(yōu)選的，生物標記物對選自表1e。優(yōu)選的，生物標記物對選自表1f。
圖21提供了本發(fā)明的生物標記物的進一步示例性的實施方式。表2描述了用于表征前列腺癌的trna生物標記物對。表2理解為公開了一種生物標記物是典型的序列，而另一種生物標記物是各自的變體。特別地，這些生物標記物對在確定尿液中的生物標記物對的方法中是有用的。表4和表10描述了可用于表征chl的mirna生物標記物對。特別地，這些生物標記物在確定從血液提取的胞外體囊泡(exosomalvesicle)中的生物標記物對的方法中是有用的。表4和10理解為公開了一種生物標記物是典型的序列，而另一種生物標記物是各自的變體。表5和表11描述了可用于表征chl的mirna生物標記物對。特別地，這些生物標記物對在確定從血液提取的蛋白質(zhì)組分中的生物標記物對的方法中是有用的。表5和表11理解為公開了一種生物標記物是典型的序列，而另一種生物標記物是各自的變體。表6描述了可用于表征乳腺癌的mirna生物標記物對。特別地，這些生物標記物對在確定血液樣品中的生物標記物對的方法中是有用的。表6理解為公開了一種生物標記物是典型的序列，而另一種生物標記物是各自的變體。表7描述了可用于表征睪丸生殖細胞腫瘤的mirna生物標記物對。表7理解為公開了一種生物標記物是典型的序列，而另一種生物標記物是各自的變體。表8描述了可用于結(jié)直腸癌的mirna生物標記物對。表8理解為公開了一種生物標記物是典型的序列，而另一種生物標記物是各自的變體。表9描述了可用于阿爾茨海默氏病的mirna生物標記物對。表9理解為公開了一個生物標記物是典型的序列，而另一個生物標記物是各自的變體。特別地，這些生物標記物對在確定血液樣品中的生物標記物對的方法中是有用的。
在本文公開的方法的優(yōu)選方面，生物標記物對選自表1、表2或表4～表11，優(yōu)選選自表1、表2、表4、表5、表6和表9～表11。
優(yōu)選的，在本文公開的方法中，由純化自體液樣品的胞外體囊泡，確定所述ncrna的兩個不同種類的量。優(yōu)選的，在本文公開的方法中，由純化自體液樣品的蛋白質(zhì)組分，確定所述ncrna的兩個不同種類的量。優(yōu)選的，體液樣品通過尺寸排阻色譜(sec)來純化胞外體囊泡或蛋白質(zhì)組分。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種用于表征個體中的典型霍奇金淋巴瘤(chl)的狀況的方法，所述方法包括確定來自所述個體的體液樣品中的一種或多種mirna的量，以及將所述一種或多種mirna的量與參照樣品進行比較，其中，所述一種或多種mirna的存在或量的差異表征個體的狀況。還提供了一種收集個體健康狀況相關(guān)的數(shù)據(jù)的方法，包括確定來自所述個體的體液樣品的一種或多種mirna的量，以及將所述一種或多種mirna的量與參照樣品進行比較。該數(shù)據(jù)可用于表征個體中的典型霍奇金淋巴瘤(chl)的狀況。
用于這些方法的一種或多種mirna選自表3中。
優(yōu)選的，所述一種或多種mirna選自mir21-5p、let7a-5p、mir127-3p和mir155-5p。
表3描述了可用于表征個體中的典型霍奇金淋巴瘤(chl)的狀況的mirna。特別地，這些生物標記物在確定從血液提取的蛋白質(zhì)組分中的生物標記物對的方法中是有用的。優(yōu)選的，該方法通過確定個體是否患有chl來表征chl的狀況。
優(yōu)選的，所述參照樣品來自一個或多個健康個體。
優(yōu)選的，所述參照樣品來自一個或多個具有chl的個體。
優(yōu)選的，表征chl的狀況包括確定在接受chl治療的個體中的治療效果。優(yōu)選的，所述參照樣品來自接受chl治療前的同一個體。
優(yōu)選的，表征chl的狀況包括確定患有chl的個體的預后。優(yōu)選的，所述參照樣品來自對疾病治療的響應良好的一個或多個個體，或者來自對疾病治療的響應不良的一個或多個個體。
在優(yōu)選的實施方式中，所述方法進一步包括從體液樣品純化胞外體囊泡，以及確定與純化的胞外體囊泡相關(guān)的一種或多種mirna的量。在優(yōu)選的實施方式中，所述方法進一步包括從體液樣品純化蛋白質(zhì)組分，以及確定與純化的胞外體囊泡相關(guān)的一種或多種mirna的量。優(yōu)選的，所述純化包括，通過尺寸排阻色譜(sec)對體液樣品進行處理。優(yōu)選的，通過獲得空隙體積分數(shù)來分離胞外體囊泡。
在優(yōu)選的實施方式中，所述體液是血液。
優(yōu)選的，本文公開的方法是在體外進行的，特別是量化相關(guān)生物標記物的步驟是在體外進行的。
附圖說明
圖1.來自b細胞及其胞外體的小rna全部組成。
a)樣品特征和rna-seq數(shù)據(jù)的總結(jié)。用細胞和胞外體的小rna組分構(gòu)建cdna文庫。明確說明在定位至目標基因組(hsg19；人類基因組)之前和之后的所有文庫的讀序總數(shù)。為了注釋定位至人類基因組的rna元件，針對目前已知的數(shù)據(jù)庫分析所有定位的讀序：1)來自mirbase版本19的成熟mirna和mirna前體的序列，2)于2013年2月6日下載的ncbi參照序列人refseq基因，3)來自基因組trna數(shù)據(jù)庫的trna序列，4)利用從ucsc下載的repeatmasker算法檢測的重復衍生序列，和5)從ncbi核苷酸數(shù)據(jù)庫下載的piwirna(pirna)。
b)用細胞和胞外體的小rna組分構(gòu)建cdna文庫。注明了用于生成rna測序文庫的樣品組、細胞系和樣品組分的類型。
c)來自細胞和胞外體組分的所有定位的讀序通過對細胞轉(zhuǎn)錄物的注釋進行分組，并且表示為定位的讀序的分布頻率(％)，其中所有定位的讀序都來源于細胞轉(zhuǎn)錄物。
圖2.微小rna非隨機地摻入胞外體中。
a)根據(jù)標準化(每百萬的讀序，rpm)后的從細胞釋放的mirna的量與保留在細胞中的量之間的比例，將mirna分為x軸表示的五組。將數(shù)據(jù)繪制為分布在五組中的mirna組分的百分比。
b～c)x-軸上描繪了在胞外體和細胞中顯著過多出現(xiàn)的mirna，在y-軸(對數(shù)標度)描繪了它們的超過100讀序/百萬(標準化，rpm)的讀序豐度。誤差棒是平均值的sd(lcl1～3樣品；n＝3)。
d)通過基于頸-環(huán)的qrt-pcr在lcl細胞及其配對的胞外體中進行的mirna檢測。數(shù)據(jù)表示相對于兩次獨立實驗的mir-92act值進行標準化的技術(shù)重復的δδct值。
圖3.微小rna非隨機地摻入伯基特淋巴瘤胞外體中。
作為lcl樣品，分析來自bl(bl1和bl2)的胞外體和細胞組分的mirna。edger分析產(chǎn)生在(3a)胞外體和(3b)細胞中統(tǒng)計學上顯著過多出現(xiàn)的mirna，它們的讀序豐度超過每百萬100個讀序(標準化，rpm)。y軸表示非隨機分布的mirna的相對豐度。將顯著被排出或保留的mirna與其被保留或排出的等同物進行比較。誤差棒是sd；(n＝2)；y軸以對數(shù)標度表示。
圖4.ebv編碼的mirna顯示出比人mirna更強的細胞保留趨勢。
a)根據(jù)標準化(rpm)后的從細胞釋放的mirna的量與保留在細胞中的量之間的比例，將人(lcl)和ebv的mirna分為五組。數(shù)據(jù)繪制為在五組中分布的mirna組分的百分比。
b)根據(jù)標準化(rpm)后的從細胞釋放的mirna和保留在細胞中的mirna之間的倍數(shù)變化(定義為胞外體/細胞log2)來對人(lcl1)和ebv的mirna分類。垂直線表示細胞保留或胞外體相關(guān)釋放的增加>4倍的mirna組分。紅線表示病毒mirna在人mirna(灰色)中的分布。
圖5.在各lcl樣品(lcl1、2和3；細胞對胞外體)中成熟mirna及其亞型的分布。a)將在每一文庫中檢測到的定位至注釋的mirna序列的所有mirna的測序讀序進一步解析為成熟(典型的)序列和亞型序列。它們進一步細分為轉(zhuǎn)錄后修飾的亞型(非模板核苷酸添加；nta)和轉(zhuǎn)錄后未修飾的亞型(截短和延伸)。b)樣品針對分配于每一樣品的各mirna所有讀序的總和(成熟與亞型)的百分比來作圖，和c)針對具有nta的所有mirna讀序的總和的百分比來作圖。
圖6.3'-末端nta型對mirna變體在細胞和胞外體之間分布的影響的統(tǒng)計分析和顯著性。對在所有12個樣品中表達的118種mirna的偽發(fā)現(xiàn)率校正的p值。來源于回歸模型的p值，對細胞和胞外體之間的各nta(a，u，c和g)的計數(shù)比例進行比較。在每個圖中，圓圈顏色指示效應的方向：胞外體>細胞意味著數(shù)據(jù)表明與細胞相比，胞外體中的比例更大，而胞外體<細胞意味著數(shù)據(jù)表明與胞外體相比，細胞中的比例更大。結(jié)果顯示3'末端腺苷酸化(adenylation)的mirna亞型優(yōu)先被保留(卡方檢驗，p<0.05)，而所有其他nta優(yōu)先被釋放(3'末端u：卡方檢驗，p＝0.02；3'末端c：費舍爾(fisher)精確檢驗，p＝0.04；和3'末端g：fisher精確檢驗，p＝0.02)。
圖7.3'末端轉(zhuǎn)錄后修飾界定了mirna的保留或釋放。
a～b)比較lcl樣品中成熟mirna及其nta修飾或未修飾的亞型在細胞和胞外體之間的分布。誤差棒是平均值的sd(lcl1～3樣品，n＝3)；*p值＝0.005(學生t檢驗)。
c)各lcl細胞和胞外體庫之間的mir-486-5p的分布。將定位至mir-486-5p的所有測序讀序相加，并且mir-486-5p的(亞)型的組成以百分比表示。
d)通過qpcr檢測細胞(lcl)和胞外體rna組分中的典型mir-486-5p、3'-末端腺苷酸化的mir-486-5p(3'-aaa)和3'末端尿苷化的mir-486-5p(3'-uuu)。數(shù)據(jù)表示來自兩次獨立實驗的技術(shù)重復的平均循環(huán)閾值(ct)值(誤差棒，sd)。
圖8.3'末端腺苷酸化的程度使保留增加，而3'末端尿苷化的程度區(qū)分胞外體小rna負荷。
a和d)3'-a和3'-u亞型的成對分析的頻率圖。選擇在細胞和胞外體中均發(fā)現(xiàn)表達的mirna(>300個讀序，100個mirna)來分析它們的腺苷酸化和尿苷化讀序的分布，以占全部nta修飾讀序的百分比來表示。紅色圓圈：在胞外體中具有較高百分比的亞型；紫色圓圈：在細胞中具有較高百分比的亞型；白色圓圈：均勻分布。
b～c)人mirna和病毒mirna的組分，對其腺苷酸化讀序(3'末端-a)顯示出保留或釋放的趨勢，這是針對相同mirna的非腺苷酸化讀序測量。腺苷酸化的mirna具有更高的保留概率，并且隨著添加的腺嘌呤數(shù)目而增加。
e～f)相比于3’末端腺苷酸化mirna亞型，3'末端尿苷化mirna亞型更常存在于lcl胞外體、bl胞外體和人尿液胞外體中。柱子表示具有3'末端nta的每個樣品(僅胞外體)亞型讀序的加權(quán)平均值；核苷酸類型在x軸上表示。誤差棒是3個lcl樣品的sd(n＝3)；p＝0.005；2個bl樣品(n＝2)；p＝0.001；和6個來自人尿液的樣品(n＝6)；p<0.0001(學生t檢驗)。
圖9.3'-末端轉(zhuǎn)錄后修飾影響加工的小ncrna的分布。a)具有3'末端腺苷酸化或b)3'-末端尿苷化(右圖)的yrna片段在細胞和胞外體組分間的差異化分布。對應于加工的yrna片段的rna部分針對具有3'末端修飾的rna片段的百分比作圖，其中加工的yrna片段源自rny1、rny3、rny4和rny5(x-軸)。
圖10.通過小rna測序在尿液胞外體中鑒定的定位的讀序列表。人尿液細胞外囊泡的樣品特征和rna-seq數(shù)據(jù)的總結(jié)。在純化尿液胞外體后，由胞外體小rna組分產(chǎn)生cdna文庫。確定了定位至目標基因組(hsg19/grch37，補丁5)之前和之后的所有文庫的讀序總數(shù)。為了向定位至人類基因組的rna元件提供注釋，針對當前已知的數(shù)據(jù)庫分析所有定位的讀序：1)來自mirbase第19版的成熟的和mirna前體序列，2)2013年5月下載的ncbi參照序列人refseq基因，3)來自基因組trna數(shù)據(jù)庫的trna序列，4)利用從ucsc下載的repeatmasker算法檢測的重復衍生序列，和5)從ncbi核苷酸數(shù)據(jù)庫下載的piwirna(pirna)。
圖11.健康腎組織活檢與明確的細胞腎細胞癌(腎組織)活檢
a)微小rna多樣化。每個庫中檢測到的定位至注釋的mirna序列的測序讀序被分組并且表示為一個mirna。這些定位的讀序由成熟的(典型的)和亞型序列組成。亞型進一步細分為酶修飾的亞型(3'末端nta非模板核苷酸添加)和未修飾的亞型(在3'-末端和5'-末端發(fā)生截短和延伸)。
b)通過rnaseq對來自明確的細胞腎細胞癌(ccrc；4個實驗組)的公眾可獲得的數(shù)據(jù)進行分析。基于成熟(mirbase)序列的數(shù)據(jù)分析顯示所選擇的mirna在實驗組之間難以分辨。
c)所有4個實驗組中，mirna亞型和成熟mirna之間的比例顯示3'-端腺嘌呤添加(腺苷酸化)(特別是臨床相關(guān)組之間)具有顯著差異。腺苷酸化mirna的比例的顯著差異能區(qū)分開臨床定義的組。
圖12.轉(zhuǎn)錄后修飾對健康與前列腺癌患者進行分級。盡管該表示出數(shù)據(jù)表示為“c/v”，但是該比例實際上表示“v/c”。此更改不會影響std或p值。
圖13.用于監(jiān)測惡性淋巴瘤患者中的重要腫瘤組織的非侵入性策略
a)左：治療前典型的霍奇金淋巴瘤患者的fdg/pet影像。黑色箭頭表示多個代謝活躍的腫瘤塊。右：同一患者的融合的pet/ct影像。白色箭頭表示重要的腫瘤塊。b)淋巴瘤腫瘤細胞(上部深棕色)和正常細胞(下部淺棕色)主動地分泌100納米囊泡，包括進入循環(huán)的來源于mvb的胞外體。這些細胞外囊泡(ev)含有免受外部rna酶影響的mirna。除了由ev包裹，mirna可以與蛋白質(zhì)和hdl相關(guān)聯(lián)并且經(jīng)蛋白質(zhì)和hdl保護而免于降解，然而這些不反映重要的腫瘤細胞。此外，死亡細胞將生物分子(即rna，dna，蛋白質(zhì))釋放到循環(huán)中。該圖改編自horietaletal.,2013sciencetranslmed。
圖14.為了對在患者血漿中的mirna檢測進行優(yōu)化，通過尺寸排阻色譜(sec)一步將循環(huán)的細胞外囊泡(ev)與蛋白質(zhì)/hdl中分離
a)qev尺寸排阻色譜(sec)柱(近期從izontm購得)。qev柱允許循環(huán)的ev從1～1.5ml血漿中一步可再生地分離，將它們與循環(huán)的蛋白/hdl分離(boingetal.,jev2014)。b)使用瓊脂糖cl-2bsec從chl患者分離的血漿ev的em圖像。尺寸條表示200nm，并且雖然存在更大(200nm)的囊泡，大多數(shù)ev在100nm的范圍內(nèi)。c)與b中相同的患者血漿的蛋白質(zhì)/hdl組分的em圖像。未觀察到類似于ev的顆粒。d)基于可調(diào)電阻性脈沖感測(trps)使用qnano(izontm)的顆粒分析。使用qev裝置分離chl患者血漿ev和蛋白/hdl組分。ev組分高度富集于對應于b中em圖像的尺寸分布(橙色)的顆粒中。e)通過sec分離的ev和蛋白質(zhì)/hdl組分的rt-pcr分析。ev組分9-12中vtrna1-1是高度富集的，而蛋白質(zhì)/hdl組分(19-22)中富集了mir92a，與(arroyoetal.,pnas2011)相一致。
圖15.血漿ev中候選mirna生物標記物的選擇和驗證
a)來自囊泡的mirna的分級聚類。來自chl患者(治療前)和健康對照的淋巴瘤細胞系衍生的胞外體(n＝7)和血漿細胞外囊泡的rnaseq分析顯示明確的不同的圖譜。b)血小板、pbmc和ev中10種最豐富的mirna列表(pleetal.,plosone2012)。c)血漿ev和霍奇金(hodgkin)細胞系衍生的胞外體(l1236)中mirna的水平的比較產(chǎn)生潛在的chl基質(zhì)衍生的和腫瘤相關(guān)的mirna標志物。mirna通過log(fc)>1顯示區(qū)別。d)箱線圖顯示了從chl患者(n＝10)和健康對照(n＝4)中分離的血漿ev中的4種候選mirna生物標記物的rt-pcr數(shù)據(jù)。在來自chl患者和健康對照的血漿ev中均檢測到大量mir1973。使用雙尾學生t檢驗計算p值。
圖16.成功治療期間，血漿ev中的mir-21-5p和let7a-5p水平降低
a)在兩輪一線治療(beacopp)之前(左)和之后(右)，chl患者的pet影像。箭頭表示代謝活躍的腫瘤。b)rt-pcr分析顯示在治療期間ev相關(guān)的mir-21-5p和let-7a-5p強烈降低(70％)。使用mir-1973標準化mir-21-5p和let-7a-5p水平并顯示為倍數(shù)降低(誤差棒，sem)。c+d)經(jīng)rt-pcr確定，在beacopp治療(c)期間的初治患者和在用dhap/adc治療，隨后進行自體干細胞移植的復發(fā)患者(d)中，ev中的mir-21-5p和let7a-5p水平降低。使用mir-1973標準化mir-21-5p和let-7a-5p水平并顯示為倍數(shù)降低(誤差棒，sem)。e+f)通過降低血清tarc水平(e)確定的，響應治療的chl患者中ev降低的mir-21-5p和let-7a-5p水平，而在chl患者中不降低(其中tarc水平保持高水平)(f)。使用mir-1973標準化mir-21-5p和let-7a-5p水平并顯示為倍數(shù)變化(誤差棒，sem)。
圖17.在隨訪期間候選mirna生物標記物在血漿ev中保持低水平
a)在beacopp治療期間(t＝1個月)和之后(t＝3個月)的中，chl患者血漿ev中的mir-127-3p、mir-155-5p、mir-21-5p和let-7a-5p水平降低，并在治療后6個月內(nèi)保持低水平。使用mir-1973標準化mirna水平并顯示為倍數(shù)降低(誤差棒，sem)。b)rt-pcr分析顯示，健康供體血漿ev中的mir-21-5p和let-7a-5p水平是穩(wěn)定的。數(shù)據(jù)顯示為ct值(誤差棒，sem)。
圖18：chl血漿ev中的候選mirna的水平升高是疾病特異性的
與健康對照(n＝4)相比，mir-127-3p、mir-155-5p、mir-21-5p和let-7a-5p的rt-pcr水平在chl患者血漿ev(n＝10)中增加，但在自身免疫(sle)患者中(n＝3)不增加。數(shù)據(jù)顯示為ct值(誤差棒，sem)。使用雙尾學生t檢驗計算p值。
圖19：健康的和霍奇金患者的血漿ev中mirna的nta分析
我們對來自健康供體和chl患者的多個血漿的蛋白質(zhì)和囊泡組分中進行測序，并用srnabench(http://arn.ugr.es/srnabench/)分析數(shù)據(jù)。a)顯示所有鑒定為3'-末端nta定義為a或u的mirna比例圖。只有chlev組分具有更高比例的3'-末端尿苷化mirna。b)與a相同，但現(xiàn)在數(shù)據(jù)表示基于3'末端轉(zhuǎn)錄后nta的修飾的mir-486-5p的差異。c)2個供體的各種組分中mir486-5p的taqmanrt-pcr，其證實了如b所示rnaseq數(shù)據(jù)，taqmanrt-pcr如前所述的(koppers-lalicetal.,2014)。
圖20：與mir-92a基因組序列比對的匹配讀序的圖示。5'或3'-末端核苷酸的轉(zhuǎn)錄后修飾(nta)和伸長/截短用加下劃線的字母(用于延伸)或*表示截短。
圖21：示例性生物標記物。表2描述了來自前列腺癌(pca)患者尿液的trna生物標記物對。表3描述了表征chl的mirna。表4和表10描述了從健康供體和chl患者的血漿中提取的細胞外囊泡中的ncrna生物標記物對。表5和表11描述了從健康供體和chl患者的血漿中提取的蛋白質(zhì)組分(pf)中的ncrna生物標記物對。表6描述了乳腺癌患者血清中的ncrna生物標記物對。表7描述了睪丸生殖細胞腫瘤中的ncrna生物標記物對。表8描述了在結(jié)直腸癌中的ncrna生物標記物對。表9描述了阿爾茨海默病患者血清中的ncrna生物標記物對。
具體實施方式
如本文所使用的，冠詞“一/一個/一種(a)”和“一/一個/一種(an)”指該冠詞語法上修飾的對象的一個或一個以上(即至少一個)。作為示例，“一個元件(anelement)”是指一個元件或一個以上元件。
如本文所使用的，“體液”是指含ncrna的體液，其包括血液(或血液組分，例如血漿或血清)、淋巴液、粘液、液淚、唾液、痰、尿液、精液、糞便、csf(腦脊液)、母乳和腹水。優(yōu)選的，所述體液是尿液。優(yōu)選的，所述體液選自血液。如本文所使用的，“血液”還包括血清和血漿。優(yōu)選的，所述體液是血漿。
“生物標記物”可用于指個體中以不同濃度存在的，可用于預測個體健康狀況的生物分子。
如本文所使用的，“包括/包含”及其變化形式以其非限制性意義使用，意指包括該詞之后的項目，但不排除未具體提及的項目。此外，動詞“由……組成”可被替換成“基本上由……組成”，意味著本文定義的化合物或輔助化合物可以包括除了具體指出的那些之外的額外組分，所述另外的組分不改變本發(fā)明獨特的特征。
如本文所使用的，“健康狀況”是指個體在特定時間的整體(身體/生理)癥狀。健康狀況包括是否存在疾病或病癥，例如神經(jīng)病癥(例如阿爾茨海默氏病)、癌癥/腫瘤、感染性疾病、代謝性疾病(例如淀粉樣變性)、心血管疾病和免疫性病癥。優(yōu)選的，所述病癥選自前列腺癌、乳腺癌、子宮頸癌、淋巴瘤、結(jié)腸癌、成膠質(zhì)細胞瘤和肺癌。
健康狀況還包括發(fā)生此類病癥的風險，即，一般群體(或具有相似的年齡、遺傳背景、環(huán)境風險因素等的個體)具有降低或增加的風險。健康狀況還包括疾病/病癥的特定階段，及嚴重性和預后(例如，存活預后)。健康狀況還指要經(jīng)特定藥劑有效治療的個體的預后?！皩】禒顩r分類”包括將個體分類為健康的；具有或不具有特定病癥；發(fā)生病癥的風險增加、降低或是正常；對特定治療的響應良好者或響應不良者；具有特定階段或嚴重性的疾?。簧婊蚧謴皖A后良好或不良。
如本文所使用的，“個體”是指人和動物，例如哺乳動物，如家畜(例如狗、貓)；農(nóng)場動物(例如牛、綿羊、豬、馬)；或?qū)嶒炇覄游?例如猴、大鼠、小鼠、兔、豚鼠)。優(yōu)選的，所述個體是人。
如本文所使用的，“小非編碼rna”(ncrna)是指不翻譯成蛋白質(zhì)的rna，且其包括轉(zhuǎn)運rna(trna)、核糖體rna(rrna)，snorna、微小rna(mirna)、sirna、小核(snrna)、yrna、穹窿體rna、反義rna、tirna(轉(zhuǎn)錄起始rna)、tssa-rna(轉(zhuǎn)錄起始位點相關(guān)rna)和piwirna(pirna)。小ncrna的長度小于200個核苷酸。
優(yōu)選的，所述ncrna是小poliiirna，優(yōu)選選自trna、mirna、snrna、yrna，穹窿體rna和snrna。優(yōu)選的，所述ncrna選自mirna、yrna、穹窿體rna，更優(yōu)選的，所述ncrna是mirna。
優(yōu)選的，本文所用的小ncrna長度為16～200個核苷酸，更優(yōu)選16～100個核苷酸，甚至更優(yōu)選16～40個核苷酸。ncrna可以是內(nèi)源性來源(例如，人mirna)或外源性來源(例如，病毒、細菌、寄生蟲)。
“典型的”ncrna是指從基因組序列預測的rna序列，并且是被鑒定為特定rna的最豐富的序列。對于mirna來說，這是指通過“典型的mirna通路”形成的mirna。mirna前體(pre-mirna)被切割成短發(fā)夾rna，然后輸出到細胞質(zhì)中，以通過核糖核酸內(nèi)切酶(dicer酶)進行加工。所得到的“典型的”成熟mirna的長度通常為21～22個核苷酸。
“剪切的”ncrna是指其中已經(jīng)經(jīng)由核酸外切酶介導的核苷酸剪切，去除了分子5'末端和/或3'末端的一個或多個核苷酸的ncrna。優(yōu)選的，所述剪切是3'剪切。優(yōu)選的，從典型序列的3'末端剪切一個核苷酸。由于典型的mirna的起始位點和終止位點是已知，所以可以容易地檢測到剪切的mirna。在圖20和圖21中(參見例如表11c)描述了剪切的ncrna的實例。
3'非模板核苷酸添加(3'nta)是指通常通過rna核苷酸轉(zhuǎn)移酶，例如papd4、papd5、zcchc6和zcchc11，翻譯后在rna的3'末端添加一個或多個核苷酸(burroughsetal.,2010；polikepahadandcorry,2013)。最常見的形式是腺苷酸化(3'nta-a)和尿苷化(3'nta-u)，但是也可添加胞嘧啶(3'nta-c)和鳥嘌呤(3'nta-g)。雖然通常添加一個或兩個核苷酸，但也可添加三個或更多個核苷酸。在nta發(fā)生之前，典型的序列任選地在5'末端或3'末端剪切。優(yōu)選的，3'nta是選自3'nta-a、3'nta-g、3'nta-u和3'nta-c的單核苷酸添加。在圖20和圖21中(參見例如表2a)描述了3'ntancrna的實例。
“延伸的ncrna”是指比典型的mirna序列長的mirna，并且是本領(lǐng)域中公認的術(shù)語。構(gòu)成延伸的核苷酸對應于前體序列的核苷酸，因此與非模板核苷酸添加不同，構(gòu)成延伸的核苷酸是由基因組編碼的。不希望被理論所束縛，認為延伸的ncrna是mirna前體差異化加工的結(jié)果。通常來說，與典型的mirna序列相比，該延伸可以包括1～5個，通常1～3個額外的核苷酸。由于典型的mirna的起始位點和終止位點是已知，所以可以容易地檢測到延伸的mirna。在圖20和圖21中(參見例如表11a)描述了延伸的ncrna的實例。
ncrna變體選自ncrna的典型序列，ncrna的5'或3'剪切形式，ncrna的5'或3'延伸形式，ncrna的5'或3'剪切形式或ncrna5'或3'延伸形式(本文中統(tǒng)稱為“長度變體”)，和具有3'非模板核苷酸添加(3'nta)的ncrna。如本文所使用的，“ncrna變體”是指源自一個ncrna基因的一組序列。每個變體例如通過5'或3'剪切，或存在或不存在3'nta，而在序列上彼此不同。變體可具有相同或不同的生物學功能。
不希望被理論所束縛，認為剪切的ncrna(即截短的)和延伸的ncrna(即延長的)在pre-mirna加工中可導致相似的低效率。在一些實施方式中，ncrna變體是“長度變體”，即剪切的或延伸的ncrna。例如，表5b列出了生物標記物對，其中一個變體是典型的結(jié)構(gòu)，而第二變體是3'長度變體。在一些實施方式中，優(yōu)選將長度變體分成延伸的ncrna和剪切的ncrna。表11是對相同數(shù)據(jù)的分析，但是其中長度變體被分成延伸的ncrna(參見對于3'末端延伸的表11a)和剪切的ncrna(參見對于3'末端剪切的變體的表11b)。
定量(quantify)和量化(quantification)可以互換使用，并且是指確定樣品中的物質(zhì)(例如，生物標記物)的(相對或絕對的)量或豐度的過程。例如，可以通過包括但不限于微陣列分析、qrt-pcr、rna印記(northernblot)上的條帶強度、定向小rna測序的方法，或通過本領(lǐng)域已知的各種其它方法，來定量。
術(shù)語“治療”包括預防性和/或治療性治療。術(shù)語“預防性或治療性”治療是本領(lǐng)域公知的，包括將一種或多種受試組合物給藥予受體。如果在臨床表現(xiàn)出不想要的癥狀(例如，受體動物的疾病或其他不想要的狀況)之前給藥，則治療是預防性的(即，保護受體免于發(fā)生不想要的癥狀)，而如果在表現(xiàn)出不想要的癥狀之后給藥，則治療是治療性的(即，旨在減少、改善或穩(wěn)定現(xiàn)有的不想要的癥狀或其副作用)。
一方面，本發(fā)明提供了一種鑒定小非編碼rna(ncrna)生物標記物對的方法。優(yōu)選的，ncrna生物標記物的長度至少為16個核苷酸。實施例3描述了用于將健康患者與前列腺癌患者區(qū)分開的生物標記物對，其使用本文所述的方法來鑒定。最好的生物標記物對公開于圖12中。
上述方法包括確定ncrna在第一體液樣品中和在第二體液樣品中所述ncrna的兩個不同種類的比例，所述第一體液樣品獲得自第一個體參照，所述第二體液樣品獲得自第二個體參照，其中，所述第一個體參照相對于第二個體參照健康狀況發(fā)生改變。
所述體液樣品來自一個或多個個體，或者可以是個體群體中的平均比例。所述第一個體參照(其可以是一個以上的個體，優(yōu)選一個)相對于第二個個體參照(其可以是一個以上的個體，優(yōu)選一個)健康狀況發(fā)生改變。在一些實施方式中，第一個體參照和第二個體參照來自同一個體，其中個體的健康狀況發(fā)生了改變，例如，樣品獲得自治療方案之前和之后的個體。
診斷和預后生物標記物的鑒定方法是本領(lǐng)域公知的。樣品的選擇完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員的范圍內(nèi)，并且可以根據(jù)待鑒定的生物標記物的類型而改變。
在疾病的生物標記物的情況下，示例性實施方式提供了來自具有病癥的個體的第一個體參照，以及來自不具有所述病癥的個體參照的第二樣品。優(yōu)選的，所述病癥是癌癥，更優(yōu)選選自宮頸癌、淋巴瘤、結(jié)腸癌、成膠質(zhì)細胞瘤和肺癌、前列腺癌。
在風險的生物標記物的情況下，示例性實施例提供了來自病癥發(fā)生風險增加的個體的第一個體參照，以及來自風險未增加的個體的第二個體參照。例如，可由肺癌發(fā)病前的重度吸煙個體提供樣品。分析比例，并且在一定的時間(例如1年或2年)后監(jiān)測個體中的肺癌狀況。
在預后的生物標記物的情況下，示例性實施例提供來自成功治療的個體的第一個體參照，以及來自未成功治療的個體的第二樣品。
可通過技術(shù)人員已知的方法確定rna種類的比例。優(yōu)選的，通過定量每一樣品中的兩個不同種類，并確定兩個量之間的關(guān)系來確定所述比例。這優(yōu)選表示為一個量除以另一個量的商。優(yōu)選的，確定每一種類的豐度。更優(yōu)選的，確定每一種類的相對豐度。
在一個示例性實施方式中，比例等于(ncrna種類1的豐度除以典型的ncrna的豐度)除以(ncrna種類2的豐度除以典型的ncrna的豐度)。
定量rna水平的方法是眾所周知的。有幾種方法向ncrna添加額外的序列，以便于引發(fā)和檢測。特別地，可以向各ncrna添加共同序列，以允許使用單一的通用延伸引物。特別地，基于qpcr的ncrna檢測方法向mirna添加額外的序列，以在逆轉(zhuǎn)錄之前或期間增加其長度。還存在許多用于對小rna進行pcr測定的市售系統(tǒng)(例如appliedbiosystemscustom
所述方法還包括比較來自所述第一體液樣品的比例和所述第二體液樣品的比例，并且當所述比例在所述第一體液樣品和所述第二體液樣品之間發(fā)生改變時，將所述ncrna的兩個不同種類鑒定為生物標記物對。在第一樣品和第二樣品之間發(fā)生改變的比例將所述ncrna鑒定為ncrna生物標記物。更準確地說，兩個ncrna種類被共同鑒定為生物標記物。改變的比例是兩個樣品的比例之間存在統(tǒng)計學的顯著性差異。優(yōu)選的，當來自第一樣品的比例落在第二樣品的約1.0標準偏差、約1.5標準偏差、約2.0標準偏差或約2.5標準偏差之外時，則鑒定為改變的比例。
ncrna種類選自典型的ncrna序列，5'或3'剪切形式的ncrna，5'或3'延伸形式的ncrna，5'或3'剪切形式的ncrna或5'或3'延伸形式的ncrna(即“長度變體”)，和具有3'非模板核苷酸添加(3'nta)的ncrna。優(yōu)選的，第一種類選自典型的ncrna，而第二種類是具有3'非模板核苷酸添加的ncrna，并且當所述ncrna是mirna時，第一種類選自典型的ncrna、在5'末端或3'末端剪切的ncrna和具有3'非模板核苷酸添加的ncrna，任選地在5'末端或3'末端剪切，第二種類選自在5'末端或3'末端剪切的ncrna和具有3'非模板核苷酸添加的ncrna，任選地在5'末端或3'末端剪切。清楚地是該比例是相同ncrna的兩個不同種類的比例。
在示例性實施方式中，所述比例選自典型的：3'nta-a；典型的：3'nta-g；典型的：3'nta-c；典型的：3'nta-u；3'nta-g：3'nta-c；3'nta-g：3'nta-u；3'nta-g：3'nta-a；3'nta-c：3'nta-u；3'nta-c：3'nta-a；和3'nta-u：3'nta-a；典型的：5'剪切的；典型的：3'剪切的；5'剪切的：3'nta-c；5'剪切的：3'nta-u；5'剪切的：3'nta-a；5'剪切的：3'nta-g；3'剪切的：3'nta-c；3'剪切的：3'nta-u；3'剪切的：3'nta-a；3'剪切的：3'nta-g；3'剪切的：5'剪切的；延伸的和3'nta-a；延伸的和3'nta-g；延伸的和3'nta-c；延伸的和3'nta-u；延伸的和5'剪切的；延伸的和3'剪切的；5'或3'剪切的和5'或3'延伸的；(剪切的和延伸的)和3'nta-u；(剪切的和延伸的)和3'nta-a；(剪切的和延伸的)和3'nta-g；(剪切的和延伸的)和3'nta-c；(剪切的和延伸的)和典型的。優(yōu)選的，所述比例選自典型的：3'nta，或3'nta：不同的3'nta。比例中的分子和分母可以顛倒對于技術(shù)人員來說是清楚的。優(yōu)選的，ncrna是mirna。
在示例性實施方案中，所述比例選自典型的：3'nta-a；典型的：3'nta-g；典型的：3'nta-c；典型的：3'nta-u；3'nta-g：3'nta-c；3'nta-g：3'nta-u；3'nta-g：3'nta-a；3'nta-c：3'nta-u；3'nta-c：3'nta-a；和3'nta-u：3'nta-a。比例中的分子和分母可以顛倒對于技術(shù)人員來說是清楚的。
本發(fā)明證明了通過觀察ncrna的兩個種類的比例，可以改進ncrna生物標記物的預測能力。實施例2表明，四種不同的mirna的典型序列無法區(qū)分健康組織和腎癌。然而，當使用比例3'nta-a：典型的mirna時，可通過這四種相同的mirna來區(qū)分臨床相關(guān)組。
因此，本發(fā)明還提供了使用小非編碼rna(ncrna)生物標記物對，來區(qū)分個體的健康狀況和收集關(guān)于個體的健康狀況的數(shù)據(jù)的方法。ncrna對可以基于任何已知的ncrna生物標記物或者那些例如通過本文所述的方法鑒定的ncrna生物標記物。優(yōu)選的，每一ncrna生物標記物的長度都為至少16個核苷酸。已經(jīng)建議將各種ncrna分子(特別是)mirna用作生物標記物(參見例如，關(guān)于黑素瘤標記物的wo2009099905，關(guān)于肺病標記物的wo2011025919；關(guān)于阿爾茨海默病標記物的wo2013003350；關(guān)于氣道疾病標記物的us2012289420等)。這些ncrna分子中的任何一種都可以用于上述方法的實施方式中。
用于對健康狀況進行分類的方法包括，確定來自個體的體液樣品中的生物標記物對的比例，將該比例與來自參照樣品的體液中的生物標記物對的比例進行比較，其中，根據(jù)所述個體的比例與參照樣品的比例之間是否存在差異(即，其中的比例發(fā)生改變)來區(qū)分所述個體的健康狀況。
可從一個個體或從一群個體的平均值來獲得的參照樣品。參照樣品的比例可通過本文所述方法來確定，或者它可以是先前獲得的信息。與參照樣品相比，所述個體的比例發(fā)生改變意味著與參照相比健康狀況發(fā)生改變。
選擇合適的參照樣品在本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識范圍內(nèi)。在一些實施方式中，參照樣品來自具有特定病癥的個體，而改變意味著所述個體沒有患該病癥。
在優(yōu)選的實施方案中，來自個體的比例與兩個參照樣品進行比較，其中第一參照樣品是“健康的”對照樣品，第二參照樣品來自健康狀況(例如，處于發(fā)展特定疾病的風險)發(fā)生改變的個體。技術(shù)人員應認識到，當個體的比例更接近于來自“改變的健康狀況”的比例時，則該個體的健康狀況很可能也發(fā)生了改變。
所述生物標記物對由ncrna的兩個不同種類組成，其中，第一種類選自典型的ncrna和具有3'非模板核苷酸添加的ncrna，并且第二種類是具有3'非模板核苷酸添加的ncrna，其中，當所述ncrna是mirna時，第一種類選自典型的ncrna、在5'或3'末端剪切的ncrna，和具有3'非模板核苷酸添加的ncrna，任選地在5'或3'末端剪切；而第二種類選自5'或3'末端剪切的ncrna和具有3'非模板核苷酸添加的ncrna，任選地在5'或3'末端剪切。比例的確定和優(yōu)選的rna種類如本文先前所述的。優(yōu)選的，生物標記物對由ncrna的兩個同種類組成，其中第一種類和第二種類選自典型的ncrna；在5'或3'末端剪切的ncrna和/或在5'或3'末端延伸的ncrna；和具有3'非模板核苷酸添加的ncrna，任選地在5'或3'末端剪切或在5'或3'末端延伸；
其中，當所述ncrna不是mirna時，第一種類選自典型的ncrna和具有3'非模板核苷酸添加的ncrna，而第二種類是具有3'非模板核苷酸添加的ncrna。
在優(yōu)選的實施方式中，本文公開的方法確定了個體對進行的特定治療做出響應的可能性。優(yōu)選的，所述方法還包括治療所述個體的所述疾病或病癥的步驟。在優(yōu)選的實施方式中，所述方法確定個體發(fā)生特定病癥的風險。
在優(yōu)選的實施方式中，本文公開的方法診斷患有疾病或病癥的個體。在優(yōu)選的實施方式中，所收集的數(shù)據(jù)可以用作輔助執(zhí)業(yè)醫(yī)師進行診斷或預后的一個因素。優(yōu)選的，所述方法還包括治療所述個體的所述疾病或病癥的步驟。
在優(yōu)選的實施方式中，所述病癥是前列腺癌，并且生物標記物對選自表12(來自實施例3)或表2。在優(yōu)選的實施方式中，所述病癥是chl，并且生物標記物對選自表4或表5。在優(yōu)選的實施方式中，所述病癥是乳腺癌，并且生物標記物對選自表6。在優(yōu)選的實施方式中，所述病癥是阿爾茨海默氏病，并且生物標記物對選自表9。
本發(fā)明還提供了用于表征個體中典型霍奇金淋巴瘤(chl)的狀況的方法，和收集關(guān)于個體的健康狀況的數(shù)據(jù)的方法。所述方法包括確定所述個體的體液樣品中的一種或多種mirna的量，并將所述一種或多種mirna的量與參照樣品進行比較?？扇绫疚囊呀?jīng)公開的方法確定所述mirna的量。
實施例6描述了鑒定用于對chl進行分類的mirna。相應地，在這些方法中所使用的一種或多種mirna選自表3。優(yōu)選的，一種或多種mirna選自let-7a-5p、mir-1908-5p、mir-5189-5p、mir-92b-3p、mir-425-3p、mir-625-3p、mir-7706、mir-125b-5p、mir-760、mir-21-5p、mir-122-5p，更優(yōu)選的，選自mir-21-5p、let-7a-5p、mir-127-3p和mir-155-5p。
可能已經(jīng)從單一個體或從個體群體的平均值獲得了參照樣品。
在一些實施方式中，參照樣品來自一個或多個健康個體(即，未患有chl的個體)、一個或多個患有chl的個體、在接受chl治療前的同一個體，對病癥治療的響應良好的一個或多個個體，或來自對病癥治療的響應不良的一個或多個個體。例如，所述一種或多種mirna的量與從健康或患病個體獲得的參照水平相比，可用于表征個體是否患有chl。治療后的所述一種或多種mirna的量與治療前個體中的水平相比，可用于表征對治療的響應，例如治療是否有效或患者是否已復發(fā)。治療后的所述一種或多種mirna的量與從已知對治療的響應良好或不良的患者獲得的參照水平相比，可用于表征個體治療的預后是否良好。
在本發(fā)明的另一方面中，可以通過純化體液(即，將體液分成不同的生化組分)，來改善生物標記物/生物標記物對的鑒定，以及所述生物標記物/生物標記物對健康狀況的表征。血液中的大多數(shù)細胞外ncrna與可溶性生化組分相關(guān)，其中可溶性生化組分包括蛋白質(zhì)復合物、脂質(zhì)囊泡(ldl和hdl)、細胞外囊泡。在優(yōu)選的實施方式中，優(yōu)選使用尺寸排阻色譜法富集體液，使體液富含細胞外囊泡(即胞外體囊泡)或富含高蛋白質(zhì)(蛋白質(zhì)/hdl)組分。圖14e描述了使用尺寸排阻色譜法分離胞外體囊泡和高蛋白質(zhì)組分，以及在這兩種組分之間mirna分布的差異的實例。表4進一步公開了可區(qū)分健康供體和chl患者之間的血液中的胞外體囊泡組分的生物標記物對。表5公開了可區(qū)分健康供體和chl患者之間的血液中的蛋白質(zhì)組分的生物標記物對。
本說明書中引用的所有專利和參考文獻通過引用方式整體并入本文中。
通過以下實施例進一步解釋本發(fā)明。這些實施例僅用于闡明本發(fā)明，而并不限制本發(fā)明的范圍。
實施例
實施例1
eb病毒(ebv)-轉(zhuǎn)化的淋巴母細胞b細胞(lcl)組成型分泌大量的內(nèi)體來源的細胞外囊泡(ev)，該細胞外囊泡(ev)被稱為胞外體，其包含人和病毒的mirna?？截悢?shù)測量表明胞外體介導mirna的細胞-細胞傳遞，導致了在受體細胞中的積累和靶mrna的抑制(pegteletal.,2010)。越來越多的體外和體內(nèi)數(shù)據(jù)暗示，內(nèi)體膜處的mirna分選支持了胞外體在細胞-細胞通訊中的功能(vanbalkometal.,2013；kosakaetal.,2010；mittelbrunnetal.,2011；montecalvoetal.,2012；pegteletal.,2010；umezuetal.,2013；zhangetal.,2010；zhuangetal.,2012)。值得注意的是，在內(nèi)體膜處干擾胞外體的形成減少了功能性mirna的分泌(kosakaetal.,2013；mittelbrunnetal.,2011)。雖然mirna通過ev的分泌可能以非隨機方式發(fā)生(bellinghametal.,2012；guduric-fuchsetal.,2012；nolte-’thoenetal.,2012；palmaetal.,2012)，但對純化的胞外體群和生產(chǎn)細胞一直缺乏全面的對比分析。
小非編碼rna家族在b細胞和胞外體之間差異化分布。
為了確定小于200個核苷酸的小rna種類是否經(jīng)歷摻入胞外體的選擇，我們生成了細胞和相應的胞外體的小rna文庫，用于對ebv驅(qū)動的lcl(n＝3)和三個淋巴瘤細胞系(n＝3)進行測序。這一方式提供了全面的數(shù)據(jù)集，以在定義的細胞背景內(nèi)對細胞內(nèi)和細胞外的全部rna進行高性能的統(tǒng)計分析。rna-seq產(chǎn)生了每個樣品>100萬個基因組定位讀序(mappedread)(圖1中為各讀序和比對統(tǒng)計)，這些基因組定位讀序與人和ebv基因組都進行了比對。與rna參照文庫的比較揭示了細胞和胞外體的小rna組分含有來自不同類別的rna的產(chǎn)物。除了小rna序列的較大的多樣性之外，幾類rna似乎富集于細胞(圖1；黑色柱)中，而其他的rna過多地存在于胞外體(灰色柱)中。在所有轉(zhuǎn)化的b細胞類型中，mirna類型(mirbasev19)代表小rna庫的約50％。然而在胞外體中，這一百分比僅為20％，表明mirna保留在細胞中。即使其他ncrna類型(即trna、pirna、rrna、yrna和穹窿體rna)的的分布在不同細胞類型間是有差異的(圖1b)，但衍生自該其他ncrna類型的rna元件通常富集于胞外體中。值得注意的是，trna和衍生自trna的片段在彌漫性大b細胞淋巴瘤(dlbcl)(mauteetal.,2013)和其他腫瘤組織(leeetal.,2009b)中表達失調(diào)。與lcl來源的胞外體相比，衍生自trna的片段在dlbcl來源的胞外體中高度富集(24％對7.4％；圖1b)。lcl和淋巴瘤的胞外體之間最顯著的區(qū)別是人類yrna片段的極端豐富(38％；圖1)。為了研究觀察到的小rna片段的讀序豐度(圖1)是否反映全長轉(zhuǎn)錄物的存在，我們對胞外體rna進行了半定量莖環(huán)rt-pcr，其中對胞外體rna進行測序。我們在胞外體中檢測到高水平的完整的yrna種類(即rny1、rny3、rny4和rny5)和穹窿體rna1-1(圖1)。在從人尿樣分離的囊泡組分中，也檢測到完整的yrna和穹窿rna(i.v.b.,d.k-l和d.m.p.,未發(fā)表的數(shù)據(jù))。該數(shù)據(jù)支持了先前認為小細胞質(zhì)調(diào)節(jié)rna可能有非細胞自主功能的意見(nolte-’thoenetal.,2012)?？傮w而言，我們發(fā)現(xiàn)了由rna聚合酶iii得到的yrna轉(zhuǎn)錄物及其片段具有胞外體摻入一致的傾向性，其對轉(zhuǎn)化的b細胞而言似乎是最顯著的。有趣的是，人類小rna，特別是yrna被包裝于有包膜和無包膜的病毒顆粒中(garciaetal.,2009；khanetal.,2007；routhetal.,2012)。將小poliiirna從宿主細胞選擇性招募到(逆轉(zhuǎn)錄)病毒顆粒和胞外體中，暗示共同的分子機制驅(qū)動了這一包裝過程。這一認知可能有助于未來對控制胞外體生物發(fā)生和貨物選擇的細胞組分進行表征(koppers-lalicetal.，2012)。
高豐度和低豐度的microrna非隨機地摻入胞外體中
雖然mirna的轉(zhuǎn)錄和生物發(fā)生是有據(jù)可查的(ebertandsharp,2012)，但是仍然未完全了解控制mirna周轉(zhuǎn)、亞細胞運輸和經(jīng)由胞外體的釋放的機制，以及這些不同因素如何影響基因調(diào)節(jié)活性(ameresandzamore,2013)。
為了更好地了解mirna分布在細胞與胞外體之間可能的巨大差異，我們計算了所有細胞樣品和配對胞外體(n＝12)的標準化mirna讀數(shù)之間的斯皮爾曼相關(guān)系數(shù)(spearmancorrelations)，并確定了數(shù)據(jù)集之間的差異。通過聚類分析將lcl樣品與淋巴瘤樣品分離開。對于所有樣品，斯皮爾曼相關(guān)系數(shù)(r)在0.48至0.81之間。lcl胞外體(r＝0.76至0.8)和lcl細胞(r＝0.72至0.76)顯示出相對適度的樣品變化性，表明其適合用作生物學重復。接下來，使用r程序包edger將定位的mirna計數(shù)擬合在廣義線性模型中(robinsonetal.,2010)，并比較細胞和胞外體中的各mirna的相對豐度。最豐富的細胞mirna(>10000讀序/百萬(rpm))通常代表胞外體中最豐富的mirna(表s2，數(shù)據(jù)1)。盡管在胞外體組分中的mirna分布明顯受細胞mirna豐度的影響，但我們鑒定出了在細胞和胞外體之間分布不一致的一個mirna子集(錯誤發(fā)現(xiàn)率fdr＝0.05)。
為了研究哪些mirna在lcl、伯基特淋巴瘤(burkittlymphoma，bl)和dlbcl背景中優(yōu)先被保留或釋放，將所有mirna根據(jù)胞外體相對于細胞的mirna讀序(rpm)的富集倍數(shù)進行分組和排序。我們觀察到分布最不一致的mirna優(yōu)先被保留(15％至42％)，而不是優(yōu)先被釋放(8％至15％)(圖2a)。保留和釋放的mirna在其細胞組分與胞外體組分中的重現(xiàn)證明，所有樣品組所共有的釋放的mirna的數(shù)目與從概率中預期的(z-分數(shù)＝26.2)顯著不同。重要的是，許多“釋放的”mirna具有100～1000rpm以上的高相對豐度(圖2b～圖2c)，其足以抑制基因調(diào)節(jié)活性(mullokandovetal.,2012)。
為了評估被定義為“保留的”或“釋放的”的mirna的分布是否可通過其他方法檢測，我們制備了新批次的b細胞分泌的胞外體(生物學重復)，并從細胞和胞外體中提取了rna。接下來，我們進行了基于莖環(huán)的定量rt-pcr分析，并觀察到釋放的人mirnamir-451、mir-127-3p和mir-410在胞外體組分中高度富集，這與rna-seq方法的結(jié)果一致。引人注目的是，與優(yōu)先“保留”的mirnamir-1275、mir-744和mir-130b(圖2d)相比，mir-451和127-3p在細胞中幾乎檢測不到。mir-127-3p的排出可能與其作為b細胞淋巴瘤6(bcl6)mrna的負調(diào)節(jié)子的功能相關(guān)，所述b細胞淋巴瘤6(bcl6)mrna是淋巴瘤生成中的轉(zhuǎn)錄阻遏物(lujambioandesteller,2007；parekhetal.,2007)。事實上，mir-127-3p顯示出腫瘤抑制活性(saitoetal.,2006)，并且它的釋放可以有利于b細胞淋巴瘤細胞的生長和存活。
人與病毒的mirna分布的差異
ebv-mirna為ebv感染的增殖性b細胞和ebv驅(qū)動的淋巴瘤提供了必要的生長優(yōu)勢(feederleetal.,2011；setoetal.,2010；vereideetal.,2013)。我們假設，與內(nèi)源性腫瘤抑制因子mirna不同，ebv-mirna會被優(yōu)先保留且不完全呈現(xiàn)在胞外體中。我們分組并分析了由轉(zhuǎn)化的b細胞和淋巴瘤細胞中的ebv編碼的44種mirna的分布(qiuetal.,2011)。與之前對ebv感染的b細胞系的rna-seq研究一致(rileyetal.,2012；skalskyetal.,2012)，我們證實了ebv-mirna豐度變化很大，最高豐度的ebv-mirna屬于bart-簇的mirna。在基于其分布頻率進行讀序標準化后，我們計算了細胞釋放的所有mirna的量與保留在細胞中的量之間的比例(圖4a)。而宿主mirna傾向于釋放(17％是被細胞保留的)，大多數(shù)病毒mirna不被分泌出去(54％是被強保留的)。這在圖4b中示出，其中由ebv編碼的病毒mirna表示為紅色。這一觀察結(jié)果與riley等人的結(jié)果一致，他們發(fā)現(xiàn)大量的ebvbart簇mirna靶向132個凋亡相關(guān)的細胞mrna(rileyetal.,2012)，表明ebvmirna阻止細胞死亡?；虮倔w分析表明，已知抑制mapk/pi3k存活通路的許多宿主mirna被優(yōu)先釋放。所觀察到的生理相關(guān)mirna的一致且非隨機的分布與介導分選進入胞外體中的機制一致。
3'末端nta界定了體外和體內(nèi)的mirna的保留或釋放
來自mirna前體發(fā)夾結(jié)構(gòu)的豐度最高的mirna序列通常用于定義相應的mirna，通常被稱為成熟的mirna(mirbase)。然而，對各mirna讀序的分析及其在相應mirna前體序列上的定位，表明在細胞和胞外體的rna組分中mirna的3'末端序列有很多變化。低效drosha或dicer介導的mirna前體的加工產(chǎn)生3'末端的長度變體(例如截短和延伸)。此外，mirna亞型通過核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導的轉(zhuǎn)錄后修飾(也稱為非模板末端核苷酸添加(nta))主動產(chǎn)生(burroughsetal.,2010；morinetal.,2008；wymanetal.,2011)(圖5a)。對mirna的3'末端變體的整體分析顯示，3'末端長度的亞型在細胞和胞外體之間平均分布，而具有3'末端nta的mirna顯示出差異分布。各nta類型(即a、u、c或g)與具有nta的所有讀序的總和相比顯示出腺苷酸化的mirna亞型在細胞組分中富集。相比之下，3'末端尿苷化的mirna在所分析的所有l(wèi)cl樣品的胞外體中過多出現(xiàn)(圖5c)。為了分析nta修飾的讀序(a，u，c或g)的比例在細胞和胞外體樣品之間是否有顯著改變，從所有12個樣品中提取每一具有3'末端nta的mirna序列(lcln＝6，bln＝4，dlbcln＝2)，并擬合在回歸模型(logisticmodel)中，其也針對細胞系效應進行校正(得到成對設計)。結(jié)果表明3'末端腺苷酸化的mirna亞型優(yōu)先被保留(卡方檢驗，p<0.05)，而所有其他的nta優(yōu)先被釋放(3'末端-u：卡方檢驗，p＝0.02；3'末端-c：費舍爾(fisher)精確檢驗，p＝0.04；和3'末端-g：fisher精確檢驗，p＝0.02)。
除了nta分布整體分析，在三個lcl樣品(即生物學上的一式三份)中，我們觀察到3'末端腺苷酸化或尿苷化的mirna亞型在細胞和胞外體之間的差異是顯著的(p＝0.005，學生t檢驗)且未觀察到成熟mirna(基于mirbase的注釋)序列或未修飾的(延長的或截短的)亞型。為了分析3'末端nta對各mirna分布的影響，我們在lcl細胞中選擇了100個大量表達的mirna，并與胞外體組分匹配進行成對分析。結(jié)果表明，具有3'末端腺苷酸化的各mirna序列與細胞組分更相關(guān)，而具有3'末端尿苷化的相同mirna更傾向于胞外體釋放。因此我們得出結(jié)論，添加的核苷酸類型(即腺嘌呤或尿苷)影響mirna亞型在細胞和胞外體之間的分布。
對各mirna序列的更深入分析揭示了許多mirna的3'末端有不止一個的非模板核苷酸的延伸，其中各mirna序列允許在界定和注釋的3'末端序列之外具有更多的錯配和更長的側(cè)翼區(qū)域(+6nt)。為了解決轉(zhuǎn)錄后添加的核苷酸的數(shù)量是否對分布具有累積效應，我們在考慮添加的核苷酸的數(shù)目的同時，首先計算了細胞和胞外體之間具有未修飾形式的特定nta類型的序列讀數(shù)的倍數(shù)變化比例(被定義為排出系數(shù)(expelcoefficient)；參見實驗步驟)。3'末端腺苷酸化增加保留的概率，并且該概率隨著添加的a的數(shù)目成比例地增加(圖8b～圖8c)。引人注目的是，三腺苷酸化的人mirna在lcl細胞中的頻率比相應的胞外體中高5倍(p＝0.03；非配對t檢驗)，而三腺苷酸化的病毒mirna僅在lcl細胞組分中檢測到(圖8c)。3'末端腺苷酸化與病毒mirna在細胞中保留增加之間的關(guān)聯(lián)，進一步證實了我們的觀察，即病毒mirna顯示出強的維持細胞相關(guān)的趨勢(圖4a～圖4b)。重要的是，我們沒有觀察到廣泛的3'末端的聚腺苷酸化(4個以上的腺嘌呤)，其中3'末端的聚腺苷酸化(4個以上的腺嘌呤)是backes等人最近證明的mirna降解信號(backesetal.,2012)。
與3'末端腺苷酸化相比，在3'末端具有尿苷酸的小rna的不成比例的出現(xiàn)似乎定義了胞外體rna負荷。為了研究這一現(xiàn)象是否不限于培養(yǎng)的b細胞(圖8f)，我們使用胞外體分離方案從人尿液中收集并純化了天然存在的細胞外囊泡(bijnsdorpetal.,2013；verweijetal.,2013)。我們對來自健康個體的六個尿液胞外體樣品的小rna成分進行了測序(圖10)。與在b細胞胞外體中觀察到的3'末端尿苷化介導的mirna亞型分布完全相符(圖8f；p值p<0.005；學生t檢驗)，人尿液胞外體顯著富含3'末端尿苷化的mirna(圖8f；p值<0.0001；學生t檢驗)?？偟膩碚f，這些數(shù)據(jù)表明在體外以及在體內(nèi)，細胞優(yōu)先釋放3'末端尿苷化的mirna，而mirna亞型的細胞保留取決于添加到mirna的3'末端的腺嘌呤核苷酸的數(shù)量。
3'末端nta對各mirna的胞外體分選的影響
我們的結(jié)果表明nta界定mirna在細胞和胞外體之間的分布。然而，nta對各mirna的影響可能不同。例如，大量胞外體富集的mirna486-5p、143-3p和101-3p的3'末端尿苷化讀序示出高于胞外體組分中存在的所有尿苷化亞型的平均百分比(38％)。但同時，mir-486-5p似乎在成熟mirna水平分布相同(圖7c；灰色)。值得注意的是，定位于成熟mir-486-5p序列的所有讀序中的50％是腺苷酸化亞型或者是尿苷化亞型(圖7c)。當使用lcl樣品中所有mirna的加權(quán)平均值時，我們觀察到，三尿苷化讀序在lcl胞外體中的頻率比細胞內(nèi)容物高9倍(p＝0.01；非配對t檢驗)。為了證實這種分布差異，我們開發(fā)了基于莖環(huán)的引物，其設計用于區(qū)分mir-486-5p的3'末端三腺苷酸化亞型和3'末端三尿苷化亞型，這些亞型比典型的(成熟的)基于mirbase的序列長三個核苷酸。如預期的，對3'末端未添加核苷酸的成熟mir-486-5p的檢測顯示在細胞和胞外體之間分布幾乎相等，而3'末端三腺苷酸化亞型富集于細胞中(10倍)且3'末端三尿苷化亞型(5倍)富集于胞外體中(圖7d)。這種獨立的方案支持之前rnaseq的數(shù)據(jù)(圖6)，并且證明不同類型的3'末端轉(zhuǎn)錄后修飾可通過rt-pcr檢測并反映細胞保留和胞外體分選過程。因此，大量的mirna及其亞型代表具有獨特分布特性的亞群，其中的獨特分布特性取決于3'末端轉(zhuǎn)錄后修飾的類型和程度。
除了人類和病毒的mirna，我們發(fā)現(xiàn)腺苷酸化和尿苷化也可以發(fā)生在源自小細胞質(zhì)yrna的加工片段的3'末端(圖9)。重要的是，大多數(shù)3'末端修飾的小rna分子在胞外體分選方面遵循與mirna亞型相同的命運，這表明作為分選信號的nta修飾不受mirna類別的限制。這些結(jié)果強調(diào)了3'末端nta的相關(guān)性，并且擴展了我們對于酶的核苷酸轉(zhuǎn)移酶家族的小rna底物多樣性的知識(martinandkeller,2007)。
細胞和胞外體的全部mirna之間的比較為大量mirna經(jīng)由胞外體的選擇性排出和釋放提供了決定性證據(jù)。此外，我們觀察到3'末端腺苷酸化的程度似乎阻礙mirna亞型經(jīng)由胞外體的摻入和分泌。這一發(fā)現(xiàn)與這種特定修飾類型增加特定mirna的穩(wěn)定性和活性的觀點(burnsetal.,2011；d’ambrogioetal.,2012；jonesetal.,2009)一致。重要的是，我們發(fā)現(xiàn)了3'末端尿苷化的mirna亞型具有相反的行為。我們得出結(jié)論，mirna的運輸、分選和經(jīng)由胞外體的釋放(這顯而易見地也天然發(fā)生在人尿液囊泡中)部分通過nta的轉(zhuǎn)錄后修飾來界定。盡管這些細微的3'末端修飾在選擇性mirna周轉(zhuǎn)、豐度和活性中的確切作用還沒有完全理解并且是復雜的(ameresandzamore,2013)，但目前它們的功能意義正在被闡明(baccarinietal.,2011；d’ambrogioetal.,2012；jonesetal.,2009；katohetal.,2009；rüeggerandgroβhans,2012；scottandnorbury,2013)。我們的研究提供了對胞外體的小rna負荷選擇的進一步理解，并提供了研究與胞外體生物學相關(guān)的mirna加工、修飾和周轉(zhuǎn)的基礎理論。
實驗步驟
用于深度測序的rna樣品的制備
對于每一細胞或胞外體的樣品，根據(jù)制造商的說明書(illuminasandiegocausa)使用truseq小rna樣品制備(truseqsmallrnasampleprep)制備等量的輸入rna(600ngrna)用于測序。在agilent2100生物分析儀(agilent,santaclaracausa)上測量序列文庫，并且每次運行時將多達12個樣品等摩爾合并在一起。在hiseq2000(illuminasandiegocausa)運行配對末端100循環(huán)(pe100)以進行測序。
具有非模板核苷酸添加的rna讀序的檢測和統(tǒng)計分析
通過逐步分析檢索mirna亞型或異構(gòu)體。簡言之，為了檢測定位的rna元件的3'-末端的nta，我們從讀序的第18位核苷酸開始，將讀序序列與比對的mirna前體序列進行比較。如果算法在第18位后發(fā)現(xiàn)讀序和微小rna前體之間的錯配位置，則從錯配位置到讀序末端來進一步分析讀序，同時所有后續(xù)核苷酸需要與錯配位置處的那個核苷酸相同。如果遇到不同的核苷酸，則在下一個錯配位置繼續(xù)搜索或?qū)⒆x序標記為無nta。在檢測了所有nta讀序之后，我們通過將以給定核堿基(a，u，c和g)的nta結(jié)尾的讀序的數(shù)值除以定位至mirna的讀序的總數(shù)值，計算每個樣品的加權(quán)平均值。每個mirna和每個樣品，除了定位至該mirna的讀序的總數(shù)值外，我們計算以給定核堿基的nta結(jié)尾的讀序的總數(shù)值。因此，對于每個核堿基，我們可以使用邏輯回歸模型中的相對于總數(shù)值的讀序數(shù)值，其中邏輯回歸模型還包括樣本類型(細胞或胞外體)以及細胞系(提供配對設計)。基于這個模型，我們?nèi)〉昧思毎桶怏w之間，具有給定核苷酸的nta的mirna計數(shù)的比例間的差異的p值。在擬合每個mirna的此模型后，將本-霍氏(benjamini-hochberg)的偽發(fā)現(xiàn)率(fdr)應用于p值以校正多重測試。
具有非模板核苷酸添加的小rna的排出趨勢
采用以下方式，對轉(zhuǎn)錄后修飾的讀序(nta)在細胞和胞外體之間的分布進行評估。為了測試mirna相關(guān)的讀序是否具有摻入到胞外體中或保留在細胞內(nèi)的趨勢，我們將其與給定mirna(被定義為除了屬于所分析的mirna亞型外的所有其他讀序)的基線分布趨勢進行了比較。我們通過計算以特定類型的非模板核苷酸(被定義為nta)結(jié)尾的讀序和那些沒有末端修飾的(被定義為無nta)結(jié)尾的讀序在胞外體和細胞之間的倍數(shù)變化的比例，來定義排出系數(shù)(ec)。小ncrna序列的nta讀序和無nta讀序具有相同的釋放或保留的趨勢時，系數(shù)將趨近于0。如果nta讀序與無nta讀序相比具有更強的被釋放的趨勢，則為正值。最后，負系數(shù)表明nta讀序與無nta讀序相比具有更強的保留在細胞內(nèi)的趨勢。
胞外體的收集步驟
為了收集胞外體，將每一細胞系在補充有10％去除胞外體的fbs的rpmi-1640中進行連續(xù)三輪培養(yǎng)，隨后收獲含胞外體的上清液(一輪收集表示一個含有胞外體的制備物；200ml培養(yǎng)基中有100×106細胞)。通過臺盼藍排除法對細胞死亡進行常規(guī)分析，生存力≤90％的培養(yǎng)物不考慮用于胞外體收集。使用如(verweijetal.,2013)描述的差速離心方法，從上清液中分離和純化胞外體。簡言之，最后一步包括以70000×g離心1小時使胞外體沉淀成塊，并在進行最終的超速離心步驟(70000×g)之前用pbs清洗沉淀塊。將成塊的外胞體溶解于100μl的pbs中并儲存在-80℃。如前所述((pegteletal.,2010；verweijetal.,2011)，通過免疫印跡分析所有胞外體制備物以確認胞外體的存在和純度(數(shù)據(jù)未顯示)。為了提取尿液的胞外體，在簽署知情同意后從健康男性(n＝6)收集新鮮尿液樣品(50ml體積)。這些健康男性是在泌尿科參與與該項目無關(guān)的研究的患者對照組(vu大學醫(yī)學中心，阿姆斯特丹，荷蘭)。通過差速離心分離胞外體。首先，將尿液以500×g離心20分鐘，以2000×g離心20分鐘，10000×g離心30分鐘，100000×g離心1.5小時，再用pbs洗滌一次。將完整的胞外體收集在pbs中，用rna酶(rnase)a(400ng/ml,sigma-aldrichchemicals,茲韋恩德雷赫特,荷蘭)處理，然后進行rna分離。
rna提取、質(zhì)量評估和半定量pcr測定
從細胞和從配對的胞外體沉淀塊中提取rna。用400ng/ulrnasea(sigma)在37℃預處理胞外體制備物1小時。通過trizol試劑(lifetechnologies)，從所有的胞外體制備物提取總rna。當預期產(chǎn)量低時，在異丙醇沉淀步驟之前加入5μl糖原(roche)。為了能比較細胞樣品和配對的胞外體(已知包含多數(shù)大小<200nt的小rna變體)之間的小rna譜，使用基于玻璃纖維濾器的方法(mirvanamirna分離試劑盒；lifetechnologies)提取細胞的rna，以富集存在于細胞樣品中的小rna種類。提取后，所有細胞rna樣品都包括小rna種類(<200nt)。小細胞和胞外體rna譜顯示其大小分布的模式相似。使用小rna芯片平臺(agilent2100生物分析儀)測定所提取的小rna(細胞和胞外體)的質(zhì)量和數(shù)量。
使用sybr綠色通過基于莖-環(huán)的半定量逆轉(zhuǎn)錄酶pcr(rt-pcr)檢測細胞樣品和胞外體樣品中的全長小非編碼rna的存在，并通過lightcycler480(roche)進行分析。該方法使用用于rt反應的莖-環(huán)引物。設計莖-環(huán)引物以與感興趣的小rna的3'-末端最后8個核苷酸的一段互補，且使用時終濃度為12.5nm。使用taqmanmicrornart試劑盒(appliedbiosystems)，并按照制造商的說明書孵育反應物。通過rna特異性正向引物，并且通過針對靶標的重疊區(qū)特異的反向引物和莖-環(huán)rt引物擴增產(chǎn)物。擴增產(chǎn)物通過lightcycler480軟件(roche)進行分析。按照制造商的說明書，通過taqmanmicrorna測定和customtaqman小rna測定(lifetechnologies)檢測細胞和胞外體的mirna。從經(jīng)appliedbiosystems7500fastreal-timepcr系統(tǒng)及所提供的分析軟件所分析的樣品中，獲得所有mirna的數(shù)據(jù)。所有rt-pcr反應都使用等量的rna。除了圖2d中使用δδct方法將ct值對于mir-92a進行標準化外，結(jié)果以圖4b中的重復實驗的兩個技術(shù)重復的平均循環(huán)閾值(ct)值(平均ct值)來表示。ct值大于40的樣品視為陰性。
深度測序數(shù)據(jù)和小rna的表達譜的分析
使用基于miranalyzer程序(hackenbergetal.,2011)(包括額外的分析步驟和自定義的腳本)的方式分析小rna的表達譜。簡言之，對fastq格式的讀序的預處理包括：i)接頭剪切(需要檢測到至少10nt的接頭，允許讀序和接頭序列之間有1個錯配)，ii)刪除短于15nt的清除后的讀序，和iii)將具有相同序列的所有讀序縮小成一個條目(唯一讀序)。唯一讀序的讀序計數(shù)是表示相應rna分子已經(jīng)被測序了多少次的數(shù)目。
在接頭剪切及唯一讀序分組后，利用鮑蒂(bowtie)算法(langmeadetal.,2009)將讀序與人(grch37補丁發(fā)布5；下載自ucsc上的hg19)和ebv基因組(基因庫登錄號nc_007605)的合并索引(pooledindex)進行比對。我們使用長度為19bp的比對種子，允許1個錯配，僅取回那些定位至基因組中的小于40個位置的比對結(jié)果。為了從那些滿足標準的比對結(jié)果中僅取回最佳比對結(jié)果，我們使用了如hackenberg等人(hackenbergetal.,2011)所解釋的種子擴展方法。需要注意的是，bowtie種子比對方法僅允許比對讀序的前l(fā)個堿基。常常通過在小rna的3'-末端的rna測序，來檢測腺嘌呤(a)、尿嘧啶(u)、胞嘧啶(c)和鳥嘌呤(g)的非基因組模板的核苷酸添加(nta)。轉(zhuǎn)錄后添加的堿基不存在于基因組序列中，因此比對時將檢測為錯配。種子比對能檢測到在種子區(qū)域外作為錯配的那些讀序，且不會解釋為允許的錯配。在與基因組(人和ebv基因組組合)比對后，幾個注釋用于小rna品種的表達譜分析。通常，讀序位置必須完全位于由小rna注釋所界定的區(qū)域內(nèi)：[染色體起始-3nt：染色體末端+6nt]。為了能夠檢測長度變體和nta，我們允許有側(cè)翼區(qū)域。給定小rna的表達值只是定位在相應基因組區(qū)域內(nèi)的所有讀序的總和。此外，我們通過將各讀序數(shù)(rc)除以定位的染色體位置的數(shù)目，來計算調(diào)整后的rc。最后，我們計算對于各小rna元件的每百萬表達值的讀序(rpm)，利用定位至給定rna種類的讀序總進行標準化。rpm是使表達值不依賴于讀序總數(shù)的最常見的標準化類型。
為了對定位至人和ebv基因組的rna元件提供注釋，針對當前已知的數(shù)據(jù)庫分析了所有定位的讀序：1)來自mirbase第19版的成熟mirna序列和mirna前體序列(kozomaraandgriffiths-jones,2011)，2)2013年2月6日下載的ncbi參考序列人類refseq基因(pruittetal.,2012)，3)來自基因組trna數(shù)據(jù)庫的trna序列(chanandlowe,2009)，4)通過從ucsc下載的repeatmasker算法檢測的重復衍生序列，和5)從ncbi核苷酸數(shù)據(jù)庫下載piwirna(pirna)。對于fasta格式中的那些注釋，我們通過將序列定位至基因組而得到基因組坐標。
比較細胞樣本和胞外體樣本的統(tǒng)計分析
rna-seq文庫每一細胞系涉及一對文庫，對應于來自全細胞的rna或僅來自胞外體的rna。為了比較各mirna在細胞樣品和胞外體樣品之間的豐度，使用r程序包edger(robinsonetal.,2010)將觀察到的計數(shù)擬合在廣義線性模型中，其包括用于配對設計的細胞系，以及樣品類型(細胞或胞外體)。該模型不僅包括常見和趨勢離散度，而且還包括tagwise離散度評估，從而允許由于文庫間波動而產(chǎn)生額外的可變性。使用benjamini-hochberg的偽發(fā)現(xiàn)率(benjamini,2010)，對多次檢驗的p值進行校正，其中p值對應于樣本類型效應的似然比檢驗統(tǒng)計量。此外，我們還將觀察到的6個樣本之間的交集與隨機期望進行比較。簡言之，我們i)計算表達值在所有6個樣品的胞外體和細胞之間的log2比例，ii)提取所有排出的(log2>＝2)mirna，iii)提取給定組的共有mirna，即，在該組的所有樣品中都被排出的那些mirna，iv)每一條件下隨機提取10000次xmirna(x是觀察到的數(shù)目，即排出的mirna)，v)我們檢測10000次隨機運行中每一次的共有mirna的數(shù)目，vi)從10000次隨機運行中，我們計算隨機共有的rna的平均值和標準偏差，其作為期望值及其在隨機假設下的波動，vii)利用觀察到的共有rna的數(shù)量和隨機平均值和標準偏差，我們計算z分數(shù)來評估統(tǒng)計學意義。我們認為z分數(shù)為1.645或更高，對應于p≤0.05，具有顯著意義。
實施例2
我們選擇了明確的細胞腎細胞癌(ccrcc)的實驗，由11個健康(非腫瘤腎皮質(zhì)-nrc)和22個明確的細胞腎細胞癌樣品組成(osanto,s.etal.plosone2012)。此外，22位ccrcc患者屬于3個預后亞組，即在診斷時沒疾病未復發(fā)、有復發(fā)以及具有轉(zhuǎn)移性疾病(iv期)。從shortreadarchive(sra)下載sra登錄號為srp012546的數(shù)據(jù)。為了描述mirna表達模式并確定isomir的程度，我們擴展了我們以前開發(fā)的廣泛使用的程序miranalyzer，其注釋了復雜(小)rnaseq數(shù)據(jù)(hackenberg,m.etal.nucleicacidres.2009&2011)。在接頭剪切后，將唯一讀序定位至人類基因組。為了檢測所有序列變體，我們允許與典型的序列相比有波動：在5'末端的3nt波動和在3'末端的5nt波動。
在檢測到屬于給定mirna的所有讀序后，對讀序進行分級分類(按isomir類型分配)：i)典型的mirna序列，ii)非模板添加(nta)和iii)源自典型序列的5'和/或3'序列長度變體(例如截短或延伸)。計算各mirna和isomirna類型的isomir比例。我們將它們定義為屬于給定isomir類型的讀序數(shù)除以定位至給定mirna的讀序總數(shù)(典型讀序的計數(shù)加上所有isomir)。
在用我們的方式分析數(shù)據(jù)之后，我們比較了所有4個實驗組(健康、未復發(fā)、復發(fā)、iv期)之間觀察到的isomir比例。為了獲得那些在兩組之間存在統(tǒng)計學顯著差異的mirna，我們采用了標準t檢驗。我們發(fā)現(xiàn)臨床相關(guān)組之間存在腺嘌呤添加(腺苷酸化)的明顯差異。我們提取了4個mirna，其在至少一個組(>＝35％)中和在至少一個顯著比較中顯示出非常高的腺苷酸化百分比的讀序。這4個成熟的mirna是：mir-199b-3p，mir-125b-5p，mir-210-3p和mir-151a-3p。圖11描述了所有4個不同患者組的這四種mirna的isomirna的比例。
初步結(jié)果的簡要概述
1.不同的mirna顯示腺苷酸化頻率和表達水平(包括對應于成熟mirna序列的穩(wěn)定的mir-210-3p)之間有強相關(guān)性(d’ambrogioetal.cellreports2012)。在rcc進展期間mir-210-3p水平增加，這可能是通過轉(zhuǎn)錄后修飾以3'-末端腺苷酸化的形式使mirna穩(wěn)定化的結(jié)果。
2.在iv期和健康個體之間，成熟的mir-199b-3p未差異化表達(參見圖11)，然而在腺苷酸化模式中存在高顯著差異(p值：3.83e-06)。此外，mir-199b-3p靶向4種與腎癌發(fā)生高度相關(guān)的基因(med6、krt7、met、junb)。因此推定該mirna參與腫瘤發(fā)生，但是通過傳統(tǒng)分析途徑不會檢測到該mirna，強調(diào)了獨立地確定isomir含量的重要性。
3.患ccrrc的經(jīng)治療未復發(fā)的個體顯示出更接近健康個體的mir-199b-3p腺苷酸化比例(35％，p值＝0.13)，而復發(fā)的個體的腺苷酸化比例確實接近iv期的個體(22％，p值＝4.72*10-4)。對于mir-125b-5p，可觀察到非常相似的模式(參見圖11)。這表明isomir具有意想不到的預后生物標記物的潛能。
實施例3：生物流體中的isomir區(qū)分癌癥亞型和健康患者
尿液收集自4名健康的志愿者和9名診斷為前列腺癌的患者。如實施例1所述收集細胞外體并提取rna。如實施例1和實施例2那樣，進行小ncrna的表達譜分析和數(shù)據(jù)分析。
在檢測到屬于給定mirna的所有讀序之后，對讀序進行分級分類(按isomir類型分配)：i)典型的mirna序列，ii)非模板添加(nta)，和iii)5'和/或3'剪切變體。計算各mirna和isomir類型的isomir比例。圖12中描繪了最有統(tǒng)計學意義的比值(由p值確定)。變體與典型mirna序列的比例在健康患者和那些前列腺癌患者之間是顯著的。
實施例4：用于從人血漿中一步分離囊泡的尺寸排阻色譜(sec)
測量血液中的循環(huán)ncrna(例如mirna)可用于早期癌癥檢測、預后和監(jiān)測。對組織和培養(yǎng)細胞進行的全面rna測序揭示了復雜且動態(tài)的ncrna的全部組成。已經(jīng)鑒定了超過2000個成熟mirna種類，其中許多已經(jīng)在循環(huán)和其他生物流體(例如唾液和尿液)中檢測到。然而，一個基因組位點可以產(chǎn)生許多功能上不同的ncrna變體。
血液中的大多數(shù)細胞外ncrna與可溶性生物化學組分相關(guān)，其中可溶性生物化學組分包括蛋白質(zhì)復合物、脂質(zhì)囊泡(ldl和hdl)和細胞外囊泡。由于技術(shù)限制，在總血清或血漿中進行全面的ncrna表達譜分析是冗長的。制備循環(huán)的小rna及其變體的小rna文庫需要可用于接頭連接的完整ncrna種類具有足夠高的富集和純度。
為了增加測量與個體健康狀況相關(guān)的ncrna的信噪比，我們采用如下方式測量經(jīng)純化的胞外體囊泡(ev)和蛋白質(zhì)組分中的mirna。
瓊脂糖cl-2b的預處理
·在燒杯中倒入20ml瓊脂糖cl-2b(每柱)，讓瓊脂糖cl-2b靜置至少15分鐘。
·棄去上清液
·加入15ml緩沖液，渦旋混勻
·使瓊脂糖靜置至少15分鐘
·重復清洗兩次
·棄去上清液，加入10ml緩沖液
柱的準備
·使用10ml注射器
·將尼龍軟管(pantyhose)壓入注射器的出口中
·用移液管將洗過的瓊脂糖移入柱中(使用塑料的巴斯德(pasteur)移液管)
·使瓊脂糖靜置，避免柱子變干；柱子應該精確地垂直，沒有角度(使用水平儀)
·加入瓊脂糖直至達到10ml堆積的瓊脂糖
·避免柱子變干。添加緩沖液，直至使用或蓋上注射器插頭(幾個小時內(nèi)使用柱子)
樣品上樣
讓緩沖液幾乎完全流入瓊脂糖柱(但防止柱子變干)
-在柱子上上樣1.5ml血漿
-立即開始收集0.5ml樣品
-當血漿樣品幾乎完全進入瓊脂糖時，小心地加入緩沖液直到完全充滿注射器
-重復添加緩沖液，直到收集到所有組分(多達26種組分)
測序來自臨床樣品的循環(huán)小rna
-使用trizol分離方法從單一組分中分離總rna
-在生物分析儀上測量rna并使用rt-pcr進行質(zhì)量控制
-按照制造商的指南(illuminatruseq)制備小rna文庫
-按照制造商的說明書(illuminahiseq)制備序列文庫
對獲自典型霍奇金淋巴瘤患者的血漿進行如上所述的sec。如圖14所示，sec能夠從血漿中一步分離循環(huán)的ev。mirna的分布在ev組分和蛋白質(zhì)/hdl組分間是不同的(圖14e)。
使用上述方法，我們發(fā)現(xiàn)了多個囊泡相關(guān)的mirna以及蛋白質(zhì)組分相關(guān)的mirna，其能監(jiān)測霍奇金患者的治療響應。這些結(jié)果在實施例5中進行了討論。
實施例5：從霍奇金淋巴瘤的血漿中分離的ev
如實施例4所述，對獲自霍奇金淋巴瘤患者的血漿進行sec。結(jié)果如圖16～圖18所示。
實施例6：生物流體中的isomir將健康個體與霍奇金淋巴瘤患者區(qū)分開。如實施例4和實施例5中所述，進行了細胞外囊泡和蛋白質(zhì)結(jié)合rna組分的分離。如實施例1和實施例2中所述，進行了小ncrna的表達譜分析和數(shù)據(jù)分析。
在檢測到屬于給定mirna的所有讀序之后，對讀序進行分級分類(按isomir類型分配)：i)典型的mirna序列，ii)非模板添加(nta)，和iii)源自典型序列的5'和/或3'序列變體(例如截短或延伸)。計算各mirna和isomir類型的isomir比例。我們將它們定義為屬于給定isomir類型的讀序數(shù)除以定位至給定mirna的讀序總數(shù)(典型讀序的計數(shù)加上所有isomir)。圖15中描繪了最有統(tǒng)計學意義的比值(由p值確定)。變體與典型序列的比例在健康個體和那些患有霍奇金淋巴瘤的個體之間是顯著的。
實施例7：生物流體中的isomir將乳腺癌ii期與疾病iii期區(qū)分開，并且將疾病復發(fā)的乳腺癌患者與無復發(fā)的乳腺癌患者區(qū)分開。
數(shù)據(jù)源和實驗程序是公開可用的，并可從http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra？term＝srp027589和http://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject？linkname＝sra_bioproject&from_uid＝455584獲得。
分析血清中公開可用的ncrna序列數(shù)據(jù)，以確定ncrna變體的比例是否可用于分類健康狀況。如實施例2進行小ncrna的表達譜分析和數(shù)據(jù)分析。
在檢測到屬于給定mirna的所有讀序之后，對讀序進行分級分類(按isomir類型分配)：i)典型的mirna序列，ii)非模板添加(nta)，和iii)源自典型序列的5'和/或3'序列變體(例如截短或延伸)。計算各mirna和isomir類型的isomir比例。我們將它們定義為屬于給定isomir類型的讀序數(shù)除以定位至給定mirna的讀序總數(shù)(典型讀序的計數(shù)加上所有isomir)。表6描繪了最具統(tǒng)計學意義的比值(由p值確定)。變體與典型序列的比例在ii期患者與iii期乳腺癌患者之間是顯著的。
實施例8：組織中的isomir將癌旁的非腫瘤組織與睪丸生殖細胞腫瘤區(qū)分開
數(shù)據(jù)源和實驗程序是公開可用的，并可從http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra？term＝srp007946和http://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/154993獲得。分析血清中公開可用的ncrna序列數(shù)據(jù)，以確定ncrna變體的比例是否可用于分類健康狀況。
如實施例2進行小ncrna的表達譜分析和數(shù)據(jù)分析。
在檢測到屬于給定mirna的所有讀序之后，對讀序進行分級分類(按isomir類型分配)：i)典型的mirna序列，ii)非模板添加(nta)，和iii)源自典型序列的5'和/或3'序列變體(例如截短或延伸)。計算各mirna和isomir類型的isomir比例。我們將它們定義為屬于給定isomir類型的讀序數(shù)除以定位至給定mirna的讀序總數(shù)(典型讀序的計數(shù)加上所有isomir)。表7描繪了最具統(tǒng)計學意義的比值(由p值確定)。變體與典型序列的比例在癌旁組織和來自睪丸生殖細胞腫瘤的組織之間是顯著的。
實施例9：組織中的isomir將結(jié)直腸正常組織與結(jié)直腸腫瘤組織和結(jié)直腸癌相關(guān)轉(zhuǎn)移組織區(qū)分開
數(shù)據(jù)源和實驗程序是公開可用的，并可從http://www.ncbi.nlm.nih.gov/traces/sra/？study＝srp022054和http://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/prjna201245和
如實施例2進行小ncrna的表達譜分析和數(shù)據(jù)分析。
在檢測到屬于給定mirna的所有讀序之后，對讀序進行分級分類(按isomir類型分配)：i)典型的mirna序列，ii)非模板添加(nta)，和iii)源自典型序列的5'和/或3'序列變體(例如截短或延伸)。計算各mirna和isomir類型的isomir比例。我們將它們定義為屬于給定isomir類型的讀序數(shù)除以定位至給定mirna的讀序總數(shù)(典型讀序的計數(shù)加上所有isomir)。表8描繪了最具統(tǒng)計學意義的比值(由p值確定)。變體與典型序列的比例在正常結(jié)直腸組織和來自結(jié)直腸腫瘤的組織之間，在正常結(jié)直腸組織和結(jié)直腸腫瘤相關(guān)轉(zhuǎn)移之間，以及在結(jié)直腸腫瘤組織和結(jié)直腸腫瘤相關(guān)轉(zhuǎn)移之間都是顯著的。
實施例10：生物流體中的isomir將健康個體與診斷為阿爾茨海默病的患者區(qū)分開
數(shù)據(jù)源和實驗程序是公開可用的，并可從http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra？term＝srp022043和http://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject？linkname＝sra_bioproject&from_uid＝87967和leidingerpetal.,"abloodbased12-mirnasignatureofalzheimerdiseasepatients.",genomebiol,2013jul29；14(7):r78中獲得。
分析血清中公開可用的ncrna序列數(shù)據(jù)，以確定ncrna變體的比例是否可用于分類健康狀況。如實施例2進行小ncrna的表達譜分析和數(shù)據(jù)分析。
在檢測到屬于給定mirna的所有讀序之后，對讀序進行分級分類(按isomir類型分配)：i)典型的mirna序列，ii)非模板添加(nta)，和iii)源自典型序列的5'和/或3'序列變體(例如截短或延伸)。計算各mirna和isomir類型的isomir比例。我們將它們定義為屬于給定isomir類型的讀序數(shù)除以定位至給定mirna的讀序總數(shù)(典型讀序的計數(shù)加上所有isomir)。表9描繪了最具統(tǒng)計學意義的比值(由p值確定)。變體與典型序列的比例在健康個體與那些阿爾茨海默病患者之間是顯著的。
參考文獻
amaral,p.p.,dinger,m.e.,mercer,t.r.,andmattick,j.s.(2008).theeukaryoticgenomeasanrnamachine.science319,1787–1789.
ameres,s.l.,andzamore,p.d.(2013).diversifyingmicrornasequenceandfunction.nat.rev.mol.cellbiol.14,475–488.
ameres,s.l.,martinez,j.,andschroeder,r.(2007).molecularbasisfortargetrnarecognitionandcleavagebyhumanrisc.cell130,101–112.
ameres,s.l.,horwich,m.d.,hung,j.-h.,xu,j.,ghildiyal,m.,weng,z.,andzamore,p.d.(2010).targetrna-directedtrimmingandtailingofsmallsilencingrnas.science328,1534–1539.
baccarini,a.,chauhan,h.,gardner,t.j.,jayaprakash,a.d.,sachidanandam,r.,andbrown,b.d.(2011).kineticanalysisrevealsthefateofamicrornafollowingtargetregulationinmammaliancells.curr.biol.21,369–376.
backes,s.,shapiro,j.s.,sabin,l.r.,pham,a.m.,reyes,i.,moss,b.,cherry,s.,andtenoever,b.r.(2012).degradationofhostmicrornasbypoxviruspoly(a)polymeraserevealsterminalrnamethylationasaprotectiveantiviralmechanism.cellhostmicrobe12,200–210.
balaj,l.,lessard,r.,dai,l.,cho,y.-j.,pomeroy,s.l.,breakefield,x.o.,andskog,j.(2011).tumourmicrovesiclescontainretrotransposonelementsandamplifiedoncogenesequences.nat.commun.2,180.
vanbalkom,b.w.m.,dejong,o.g.,smits,m.,brummelman,j.,denouden,k.,debree,p.m.,vaneijndhoven,m.a.j.,pegtel,d.m.,stoorvogel,w.,würdinger,t.,etal.(2013).endothelialcellsrequiremir-214tosecreteexosomesthatsuppresssenescenceandinduceangiogenesisinhumanandmouseendothelialcells.blood121,3997–4006,s1–15.
bellingham,s.a.,coleman,b.m.,andhill,a.f.(2012).smallrnadeepsequencingrevealsadistinctmirnasignaturereleasedinexosomesfromprion-infectedneuronalcells.nucleicacidsres.40,10937–10949.
bijnsdorp,i.v,geldof,a.a.,lavaei,m.,piersma,s.r.,vanmoorselaar,r.j.a.,andjimenez,c.r.(2013).exosomalitga3interfereswithnon-cancerousprostatecellfunctionsandisincreasedinurineexosomesofmetastaticprostatecancerpatients.j.extracell.vesicles2.
burns,d.m.,d’ambrogio,a.,nottrott,s.,andrichter,j.d.(2011).cpebandtwopoly(a)polymerasescontrolmir-122stabilityandp53mrnatranslation.nature473,105–108.
burroughs,a.m.,ando,y.,dehoon,m.j.l.,tomaru,y.,nishibu,t.,ukekawa,r.,funakoshi,t.,kurokawa,t.,suzuki,h.,hayashizaki,y.,etal.(2010).acomprehensivesurveyof3’animalmirnamodificationeventsandapossiblerolefor3'adenylationinmodulatingmirnatargetingeffectiveness.genomeres.20,1398–1410.
chairoungdua,a.,smith,d.l.,pochard,p.,hull,m.,andcaplan,m.j.(2010).exosomereleaseofβ-catenin:anovelmechanismthatantagonizeswntsignaling.j.cellbiol.190,1079–1091.
chitwood,d.h.,andtimmermans,m.c.p.(2010).smallrnasareonthemove.nature467,415–419.
chuma,s.,andpillai,r.s.(2009).retrotransposonsilencingbypirnas:ping-pongplayersmarktheirsub-cellularboundaries.plosgenet.5,e1000770.
cullen,b.r.(2009).viralandcellularmessengerrnatargetsofviralmicrornas.nature457,421–425.
d’ambrogio,a.,gu,w.,udagawa,t.,mello,c.c.,andrichter,j.d.(2012).specificmirnastabilizationbygld2-catalyzedmonoadenylation.cellrep.2,1537–1545.
ebert,m.s.,andsharp,p.a.(2012).rolesformicrornasinconferringrobustnesstobiologicalprocesses.cell149,515–524.
feederle,r.,haar,j.,bernhardt,k.,linnstaedt,s.d.,bannert,h.,lips,h.,cullen,b.r.,anddelecluse,h.-j.(2011).themembersofanepstein-barrvirusmicrornaclustercooperatetotransformblymphocytes.j.virol.85,9801–9810.
fernandez-valverde,s.l.,taft,r.j.,andmattick,j.s.(2010).dynamicisomirregulationindrosophiladevelopment.rna16,1881–1888.
garcia,e.l.,onafuwa-nuga,a.,sim,s.,king,s.r.,wolin,s.l.,andtelesnitsky,a.(2009).packagingofhostmyrnasbymurineleukemiavirusmayoccurearlyinyrnabiogenesis.j.virol.83,12526–12534.
gibbings,d.j.,ciaudo,c.,erhardt,m.,andvoinnet,o.(2009).multivesicularbodiesassociatewithcomponentsofmirnaeffectorcomplexesandmodulatemirnaactivity.nat.cellbiol.11,1143–1149.
guasparri,i.,bubman,d.,andcesarman,e.(2008).ebvlmp2aaffectslmp1-mediatednf-kappabsignalingandsurvivaloflymphomacellsbyregulatingtraf2expression.blood111,3813–3820.
guduric-fuchs,j.,o’connor,a.,camp,b.,o’neill,c.l.,medina,r.j.,andsimpson,d.a.(2012).selectiveextracellularvesicle-mediatedexportofanoverlappingsetofmicrornasfrommultiplecelltypes.bmcgenomics13,357.
guo,l.,yang,q.,lu,j.,li,h.,ge,q.,gu,w.,bai,y.,andlu,z.(2011).acomprehensivesurveyofmirnarepertoireand3’additioneventsintheplacentasofpatientswithpre-eclampsiafromhigh-throughputsequencing.plosone6,e21072.
jones,m.r.,quinton,l.j.,blahna,m.t.,neilson,j.r.,fu,s.,ivanov,a.r.,wolf,d.a.,andmizgerd,j.p.(2009).zcchc11-dependenturidylationofmicrornadirectscytokineexpression.nat.cellbiol.11,1157–1163.
kai,z.s.,andpasquinelli,a.e.(2010).micrornaassassins:factorsthatregulatethedisappearanceofmirnas.nat.struct.mol.biol.17,5–10.
katoh,t.,sakaguchi,y.,miyauchi,k.,suzuki,t.,kashiwabara,s.-i.,baba,t.,andsuzuki,t.(2009).selectivestabilizationofmammalianmicrornasby3’adenylationmediatedbythecytoplasmicpoly(a)polymerasegld-2.genesdev.23,433–438.
khan,m.a.,goila-gaur,r.,opi,s.,miyagi,e.,takeuchi,h.,kao,s.,andstrebel,k.(2007).analysisofthecontributionofcellularandviralrnatothepackagingofapobec3gintohiv-1virions.retrovirology4,48.
koppers-lalic,d.,hogenboom,m.m.,middeldorp,j.m.,andpegtel,d.m.(2012).virus-modifiedexosomesfortargetedrnadelivery；anewapproachinnanomedicine.adv.drugdeliv.rev.
kosaka,n.,iguchi,h.,yoshioka,y.,takeshita,f.,matsuki,y.,andochiya,t.(2010).secretorymechanismsandintercellulartransferofmicrornasinlivingcells.j.biol.chem.285,17442–17452.
kosaka,n.,iguchi,h.,hagiwara,k.,yoshioka,y.,takeshita,f.,andochiya,t.(2013).neutralsphingomyelinase2(nsmase2)-dependentexosomaltransferofangiogenicmicrornasregulatecancercellmetastasis.j.biol.chem.288,10849–10859.
lee,y.s.,pressman,s.,andress,a.p.,kim,k.,white,j.l.,cassidy,j.j.,li,x.,lubell,k.,lim,d.h.,cho,i.s.,etal.(2009a).silencingbysmallrnasislinkedtoendosomaltrafficking.nat.cellbiol.11,1150–1156.
lee,y.s.,shibata,y.,malhotra,a.,anddutta,a.(2009b).anovelclassofsmallrnas:trna-derivedrnafragments(trfs).genesdev.23,2639–2649.
lujambio,a.,andesteller,m.(2007).cpgislandhypermethylationoftumorsuppressormicrornasinhumancancer.cellcycle6,1455–1459.
martens-uzunova,e.s.,olvedy,m.,andjenster,g.(2013).beyondmicrorna--novelrnasderivedfromsmallnon-codingrnaandtheirimplicationincancer.cancerlett.340,201–211.
martin,g.,andkeller,w.(2007).rna-specificribonucleotidyltransferases.rna13,1834–1849.
maute,r.l.,schneider,c.,sumazin,p.,holmes,a.,califano,a.,basso,k.,anddalla-favera,r.(2013).trna-derivedmicrornamodulatesproliferationandthednadamageresponseandisdown-regulatedinbcelllymphoma.proc.natl.acad.sci.u.s.a.110,1404–1409.
mittelbrunn,m.,andsánchez-madrid,f.(2012).intercellularcommunication:diversestructuresforexchangeofgeneticinformation.nat.rev.mol.cellbiol.13,328–335.
mittelbrunn,m.,gutiérrez-vázquez,c.,villarroya-beltri,c.,gonzález,s.,sánchez-cabo,f.,gonzález,
montecalvo,a.,larregina,a.t.,shufesky,w.j.,stolz,d.b.,sullivan,m.l.g.,karlsson,j.m.,baty,c.j.,gibson,g.a.,erdos,g.,wang,z.,etal.(2012).mechanismoftransferoffunctionalmicrornasbetweenmousedendriticcellsviaexosomes.blood119,756–766.
morin,r.d.,o’connor,m.d.,griffith,m.,kuchenbauer,f.,delaney,a.,prabhu,a.-l.,zhao,y.,mcdonald,h.,zeng,t.,hirst,m.,etal.(2008).applicationofmassivelyparallelsequencingtomicrornaprofilinganddiscoveryinhumanembryonicstemcells.genomeres.18,610–621.
mullokandov,g.,baccarini,a.,ruzo,a.,jayaprakash,a.d.,tung,n.,israelow,b.,evans,m.j.,sachidanandam,r.,andbrown,b.d.(2012).high-throughputassessmentofmicrornaactivityandfunctionusingmicrornasensoranddecoylibraries.nat.methods9,840–846.
nolte-’thoen,e.n.m.,buermans,h.p.j.,waasdorp,m.,stoorvogel,w.,wauben,m.h.m.,and’thoen,p.a.c.(2012).deepsequencingofrnafromimmunecell-derivedvesiclesuncoverstheselectiveincorporationofsmallnon-codingrnabiotypeswithpotentialregulatoryfunctions.nucleicacidsres.40,9272–9285.
palma,j.,yaddanapudi,s.c.,pigati,l.,havens,m.a.,jeong,s.,weiner,g.a.,weimer,k.m.e.,stern,b.,hastings,m.l.,andduelli,d.m.(2012).micrornasareexportedfrommalignantcellsincustomizedparticles.nucleicacidsres.40,9125–9138.
parekh,s.,polo,j.m.,shaknovich,r.,juszczynski,p.,lev,p.,ranuncolo,s.m.,yin,y.,klein,u.,cattoretti,g.,dallafavera,r.,etal.(2007).bcl6programslymphomacellsforsurvivalanddifferentiationthroughdistinctbiochemicalmechanisms.blood110,2067–2074.
pegtel,d.m.,cosmopoulos,k.,thorley-lawson,d.a.,vaneijndhoven,m.a.j.,hopmans,e.s.,lindenberg,j.l.,degruijl,t.d.,würdinger,t.,andmiddeldorp,j.m.(2010).functionaldeliveryofviralmirnasviaexosomes.proc.natl.acad.sci.u.s.a.107,6328–6333.
pegtel,d.m.,vandegarde,m.d.b.,andmiddeldorp,j.m.(2011).viralmirnasexploitingtheendosomal-exosomalpathwayforintercellularcross-talkandimmuneevasion.biochim.biophys.acta1809,715–721.
polikepahad,s.,andcorry,d.b.(2013).profilingofthelpercell-derivedsmallrnasrevealsuniqueantisensetranscriptsanddifferentialassociationofmirnaswithargonauteproteins1and2.nucleicacidsres.41,1164–1177.
qiu,j.,cosmopoulos,k.,pegtel,m.,hopmans,e.,murray,p.,middeldorp,j.,shapiro,m.,andthorley-lawson,d.a.(2011).anovelpersistenceassociatedebvmirnaexpressionprofileisdisruptedinneoplasia.plospathog.7,e1002193.
riley,k.j.,rabinowitz,g.s.,yario,t.a.,luna,j.m.,darnell,r.b.,andsteitz,j.a.(2012).ebvandhumanmicrornasco-targetoncogenicandapoptoticviralandhumangenesduringlatency.emboj.31,2207–2221.
robinson,m.d.,mccarthy,d.j.,andsmyth,g.k.(2010).edger:abioconductorpackagefordifferentialexpressionanalysisofdigitalgeneexpressiondata.bioinformatics26,139–140.
routh,a.,domitrovic,t.,andjohnson,j.e.(2012).hostrnas,includingtransposons,areencapsidatedbyaeukaryoticsingle-strandedrnavirus.proc.natl.acad.sci.u.s.a.109,1907–1912.
rüegger,s.,andgroβhans,h.(2012).micrornaturnover:when,how,andwhy.trendsbiochem.sci.37,436–446.
saito,y.,liang,g.,egger,g.,friedman,j.m.,chuang,j.c.,coetzee,g.a.,andjones,p.a.(2006).specificactivationofmicrorna-127withdownregulationoftheproto-oncogenebcl6bychromatin-modifyingdrugsinhumancancercells.cancercell9,435–443.
scott,d.d.,andnorbury,c.j.rnadecayvia3’uridylation.biochim.biophys.acta1829,654–665.
scott,d.d.,andnorbury,c.j.(2013).rnadecayvia3′uridylation.biochim.biophys.acta-generegul.mech.1829,654–665.
seto,e.,moosmann,a.,
sim,s.,weinberg,d.e.,fuchs,g.,choi,k.,chung,j.,andwolin,s.l.(2009).thesubcellulardistributionofanrnaqualitycontrolprotein,theroautoantigen,isregulatedbynoncodingyrnabinding.mol.biol.cell20,1555–1564.
skalsky,r.l.,corcoran,d.l.,gottwein,e.,frank,c.l.,kang,d.,hafner,m.,nusbaum,j.d.,feederle,r.,delecluse,h.-j.,luftig,m.a.,etal.(2012).theviralandcellularmicrornatargetomeinlymphoblastoidcelllines.plospathog.8,e1002484.
song,l.,lin,c.,gong,h.,wang,c.,liu,l.,wu,j.,tao,s.,hu,b.,cheng,s.-y.,li,m.,etal.(2013).mir-486sustainsnf-κbactivitybydisruptingmultiplenf-κb-negativefeedbackloops.cellres.23,274–289.
umezu,t.,ohyashiki,k.,kuroda,m.,andohyashiki,j.h.(2013).leukemiacelltoendothelialcellcommunicationviaexosomalmirnas.oncogene32,2747–2755.
vereide,d.t.,seto,e.,chiu,y.-f.,hayes,m.,tagawa,t.,grundhoff,a.,hammerschmidt,w.,andsugden,b.(2013).epstein-barrvirusmaintainslymphomasviaitsmirnas.oncogene.
verweij,f.j.,vaneijndhoven,m.a.j.,middeldorp,j.,andpegtel,d.m.(2013).analysisofviralmicrornaexchangeviaexosomesinvitroandinvivo.methodsmol.biol.1024,53–68.
villarroya-beltri,c.,gutiérrez-vázquez,c.,sánchez-cabo,f.,pérez-hernández,d.,vázquez,j.,martin-cofreces,n.,martinez-herrera,d.j.,pascual-montano,a.,mittelbrunn,m.,andsánchez-madrid,f.(2013).sumoylatedhnrnpa2b1controlsthesortingofmirnasintoexosomesthroughbindingtospecificmotifs.nat.commun.4,2980.
wee,l.m.,flores-jasso,c.f.,salomon,w.e.,andzamore,p.d.(2012).argonautedividesitsrnaguideintodomainswithdistinctfunctionsandrna-bindingproperties.cell151,1055–1067.
wyman,s.k.,knouf,e.c.,parkin,r.k.,fritz,b.r.,lin,d.w.,dennis,l.m.,krouse,m.a.,webster,p.j.,andtewari,m.(2011).post-transcriptionalgenerationofmirnavariantsbymultiplenucleotidyltransferasescontributestomirnatranscriptomecomplexity.genomeres.21,1450–1461.
yao,b.,la,l.b.,chen,y.-c.,chang,l.-j.,andchan,e.k.l.(2012).defininganewroleofgw182inmaintainingmirnastability.emborep.13,1102–1108.
zhang,y.,liu,d.,chen,x.,li,j.,li,l.,bian,z.,sun,f.,lu,j.,yin,y.,cai,x.,etal.(2010).secretedmonocyticmir-150enhancestargetedendothelialcellmigration.mol.cell39,133–144.
zhuang,g.,wu,x.,jiang,z.,kasman,i.,yao,j.,guan,y.,oeh,j.,modrusan,z.,bais,c.,sampath,d.,etal.(2012).tumour-secretedmir-9promotesendothelialcellmigrationandangiogenesisbyactivatingthejak-statpathway.emboj.31,3513–3523.
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