交叉引用

本申請要求提交于2014年6月30日的美國臨時申請第62/019,285號的權益，該申請通過引用而并入于此。

關于聯(lián)邦資助研究的聲明

本發(fā)明是基于美國國家科學基金會第iip-1256619號撥款，在聯(lián)邦政府的支持下而進行的。

背景技術：

過去二十年里，高通量實驗的出現(xiàn)已經(jīng)改變了進行生命科學和生物醫(yī)學研究的方式。諸如基因工程、有機化學、材料科學、微加工和微電子等領域的技術融合已經(jīng)帶來了新的技術平臺(例如，微陣列技術、微流體裝置和系統(tǒng)、基于微珠的組合化合物庫和測定系統(tǒng)，以及基于微板的測定系統(tǒng))以應對從用于新藥研發(fā)的化合物庫高通量篩選到全基因組快速測序的范圍內的各種應用。

用于新藥研發(fā)的高通量篩選系統(tǒng)的實例包括用于運行連續(xù)流測定的基于微流體的平臺技術(例如，用于鑒別受體激動劑的受體-配體結合測定和基于細胞的測定)，和其中以微孔板形式運行結合反應、酶促反應或基于細胞的測定的基于微板的系統(tǒng)，以及提供自動化樣品制備、測定和檢測步驟的自動化液體分配站和板裝卸機器人。大多數(shù)用于新藥研發(fā)的現(xiàn)有高通量平臺技術利用基于熒光的光學檢測。雖然熒光技術提供了非常高的檢測靈敏度，并且總體上比二十年前在生物測定方法中占主導地位的、更傳統(tǒng)的基于放射性同位素的手段環(huán)保得多，但采用熒光尚存在很多缺點。例子包括：(i)需要復雜的光源、檢測器和光學系統(tǒng)，上述各項的性能通常對偏差或儀器漂移敏感；和(ii)光漂白現(xiàn)象，其可在經(jīng)過反復測量的樣品中導致信號隨時間推移而變差。

現(xiàn)有高通量篩選技術的另一更嚴重局限性來自于對以下情況的日益增多的認知：很多從生物學角度看是有吸引力的靶標的潛在治療靶標(例如，潛在的癌癥治療靶標)從化學觀點來看是困難的(“無法用藥”)，原因在于它們通常不適用于常規(guī)新藥研發(fā)途徑。這些蛋白質靶標在與其他蛋白質相互作用(即，通過蛋白質-蛋白質相互作用)時通常具有相對較大的接觸面積或者是由于其擁有以極高親和力與蛋白質的活性位點結合的配體這一事實。在任一情況下，尋找阻斷該相互作用(即，干擾和/或隱藏蛋白質-蛋白質相互作用情況中的大接觸面積，或者取代高親和力配體)的常規(guī)小分子或生物(蛋白質)候選藥物非常困難。針對此類“無法用藥”靶標的變構調節(jié)劑提供了有吸引力的治療解決方案。根據(jù)定義，變構分子與并非蛋白活性位點的位點相結合，從而改變具有伴隨功能效應(例如，受體的活化)的蛋白質構象。靶蛋白質的變構調節(jié)具有無需依賴于對天然配體與蛋白質的結合進行抑制或與之競爭(這可能導致非預期的臨床副作用)的額外益處。然而，很難利用目前可用的常規(guī)技術來鑒別變構調節(jié)劑。例如，從x射線晶體學或nmr方法獲得的結構信息常常由于低通量、低靈敏度、所采用的非生理條件、適用于該技術的蛋白質大小以及許多其他因素而對于新藥研發(fā)用途的價值有限。因此，所需要的是用于篩選候選化合物組群以便快速鑒別出例如能夠對靶蛋白質的構象進行變構調節(jié)的藥劑的高通量技術。

如下文進行更詳盡地描述，二次諧波發(fā)生(secondharmonicgeneration，shg)是一種非線性光學過程，其可被配置成表面選擇性檢測技術，實現(xiàn)對蛋白質和其他生物靶標中的構象變化的檢測(如前文所述，例如在美國專利第6,953,694號和美國專利申請第13/838,419號中有述)。為了進行基于shg的高通量形式構象變化檢測，可能有利的是針對用于遞送激發(fā)光的光學系統(tǒng)來設計新穎機制以快速、精確且可互換地定位基底(包含所要分析的生物靶標)，該機制同時確保激發(fā)光與基底表面之間保持有效的光耦合。用于生物樣品的高通量光學探查的一種優(yōu)選形式為玻璃底微孔板。

本文公開的系統(tǒng)和方法提供了以與高通量分析系統(tǒng)要求相一致的方式通過全內反射，將shg和其他非線性光學技術所需高強度激發(fā)光結合到基底(例如，玻璃底微孔板中的玻璃基底)的機制。

技術實現(xiàn)要素：

本文公開了用于檢測生物實體與測試實體之間相互作用的方法，包括：(a)使至少4種生物實體中的每一種與至少一種測試實體相接觸；(b)利用表面選擇性光學技術，以一個或多個激發(fā)光束照射所述至少4種生物實體中的每一種；以及(c)測定在所述至少4種生物實體中的每一種中是否通過與所述至少一種測試實體相接觸而誘導出構象變化；其中以每小時至少10種測試實體的平均速率進行構象變化測定。在一些實施方式中，以每小時至少100種測試實體的平均速率進行構象變化測定。

在一些實施方式中，所述至少4種生物實體相同。在一些實施方式中，所述至少4種生物實體不相同。在一些實施方式中，所述生物實體選自細胞、蛋白質、肽、受體、酶、抗體、dna、rna、寡核苷酸、小分子和碳水化合物，或者其任意組合。在一些實施方式中，所述生物實體是藥物靶標或其部分。

在一些實施方式中，所述至少4種生物實體中的每一種位于基底上的不同非連續(xù)區(qū)域中。在一些實施方式中，每個非連續(xù)區(qū)域包含基底表面上多達約100mm²的面積。在一些實施方式中，每個非連續(xù)區(qū)域包含支承脂雙層。在一些實施方式中，所述生物實體拴系到或嵌入在所述支承脂雙層內。

在一些實施方式中，所述至少一種測試實體選自細胞、蛋白質、肽、受體、酶、抗體、dna、rna、寡核苷酸、小分子和碳水化合物，或者其任意組合。在一些實施方式中，所述測試實體是候選藥物或其部分。

在一些實施方式中，該接觸步驟發(fā)生在溶液中，并且包括利用預編程流體分配單元來分配所述至少一種測試實體。在一些實施方式中，該接觸步驟包括使所述至少4種生物實體中的每一種與不同的測試實體相接觸。在一些實施方式中，該接觸步驟包括使所述至少4種生物實體中的每一種依序與至少100種不同測試實體相接觸。在一些實施方式中，該接觸步驟包括使所述至少4種生物實體中的每一種依序與至少10000種不同測試實體相接觸。

在一些實施方式中，由一個或多個激光器提供所述一個或多個激發(fā)光束。在一些實施方式中，表面選擇性光學檢測技術包括利用至少一個激發(fā)光束從平面基底表面的全內反射。

在一些實施方式中，該測定步驟還包括分析非線性光信號。在一些實施方式中，所述非線性光信號選自二次諧波光、和頻光以及差頻光。

在一些實施方式中，所述方法進一步包括相對于所述一個或多個激發(fā)光束的一個或多個外部源來移動所述基底。在一些實施方式中，每個非連續(xù)區(qū)域光耦合到與所述基底的底表面相集成的入口棱鏡和不同的出口棱鏡。在一些實施方式中，該照射步驟包括將入射激發(fā)光引導至定位成鄰近所述非連續(xù)區(qū)域中的每一個但不位于其正下方的入口棱鏡上。在一些實施方式中，所述方法還包括使用定位成鄰近所述非連續(xù)區(qū)域中的每一個但不位于其正下方的出口棱鏡收集當照射時在所述非連續(xù)區(qū)域中的每一個處生成的非線性光信號，并將所述非線性光信號引導至檢測器。在一些實施方式中，所述方法進一步包括在所述接觸步驟之后多次重復該照射步驟和測定步驟，從而確定作為時間函數(shù)的所述至少4種生物實體中的每一個中的構象變化。

本文還公開了裝置，包括；(a)基底，所述基底包括：(i)形成于所述基底的表面上的非連續(xù)區(qū)域的mxn陣列，其中m是所述陣列中非連續(xù)區(qū)域的行數(shù)而n是非連續(xù)區(qū)域的列數(shù)，并且每個非連續(xù)區(qū)域被配置用于容納生物實體，以及(ii)與所述基底相集成并且光耦合到所述非連續(xù)區(qū)域的棱鏡的rxs陣列，其中r是所述陣列中棱鏡的行數(shù)而s是棱鏡的列數(shù)；其中r＝m+2并且s＝n，或者r＝m并且s＝n+2。

在一些實施方式中，所述非連續(xù)區(qū)域中的每一個光耦合到至少一個輸入棱鏡和至少一個輸出棱鏡，并且其中所述輸入棱鏡和所述輸出棱鏡在空間位置上不同。在一些實施方式中，m＝8并且n＝12。在一些實施方式中，m＝16并且n＝24。在一些實施方式中，m＝32并且n＝48。在一些實施方式中，m大于4并且n大于4。在一些實施方式中，每個非連續(xù)區(qū)域包含支承脂雙層，或者被配置用于促進支承脂雙層的形成。在一些實施方式中，所述裝置進一步包括結合到所述基底的頂表面的孔形成組件，以便將每個非連續(xù)區(qū)域隔離在單獨的孔中。在一些實施方式中，所述非連續(xù)區(qū)域中的每一個包括多達約100mm²的面積。在一些實施方式中，每個非連續(xù)區(qū)域或孔位于與所述基底相集成的棱鏡陣列的單個棱鏡的正上方。在一些實施方式中，所述基底包含玻璃、熔融石英或塑料。

本文公開了用于從塑料制造棱鏡陣列部件的注射成型工藝，該工藝包括在模具脫除步驟期間利用兩個或更多個脫模器件來向所述棱鏡陣列部件施加均勻壓力。

在一些實施方式中，所述塑料選自環(huán)烯烴共聚物(coc)、環(huán)烯烴聚合物(cop)和丙烯酸。在一些實施方式中，所述兩個或更多個脫模器件僅在其中所述部件的光學性能不重要的區(qū)域中碰觸所述棱鏡陣列部件。在一些實施方式中，所述兩個或更多個脫模器件包括mxn個刀刃狀脫模器特征的陣列。在一些實施方式中，m大于2并且小于20。在一些實施方式中，n大于2并且小于20。

援引并入

本說明書中提到的所有出版物、專利及專利申請均通過引用并入本文，其程度如同特別地且單獨地指出每個單獨的出版物、專利或專利申請均通過引用而并入。

附圖說明

本發(fā)明的新穎特征在所附的權利要求書中予以具體闡述。通過參考以下對其中利用了本發(fā)明原理的說明性實施方式加以闡述的詳細描述以及附圖，將獲得對本發(fā)明的特征和優(yōu)點的更好的理解，附圖中：

圖1a提供了熒光(吸收過程)的能級圖的示意圖。

圖1b提供了二次諧波發(fā)生(雙光子散射過程)的能級圖的示意圖。

圖2提供了由配體的結合誘導的蛋白質中的構象變化(用非線性-活性標簽標明)的示意圖，以及該構象變化對非線性-活性標簽相對于該蛋白質所附接到的光學界面的距離和/或取向的影響。

圖3a-圖3d示出了數(shù)據(jù)，其說明利用二次諧波光發(fā)生對在α-突觸核蛋白中的精胺誘導或亞精胺誘導的構象變化的檢測。圖3a示出了當α-突觸核蛋白暴露于5mm精胺時的實時shg響應。箭頭表示精胺添加。shg強度的變化以即將注射之前的值進行歸一化。圖3b示出了通過shg測量(shg濃度變化被量化為移位百分比)的針對在α-突觸核蛋白中的精胺誘導構象變化的劑量響應曲線(按對數(shù)標度繪圖)。圖3c示出了當α-突觸核蛋白暴露于3mm亞精胺時的實時shg響應。箭頭表示亞精胺添加。shg強度的變化以即將注射之前的值進行歸一化。圖3d示出了通過shg測量(shg濃度變化被量化為移位百分比)的針對在α-突觸核蛋白中的亞精胺誘導構象變化的劑量響應曲線(按對數(shù)標度進行繪圖)。誤差線＝sem。n＝3。

圖4圖示了用于基于非線性光學檢測來測定生物分子或其他生物實體中的構象變化的高通量分析系統(tǒng)的系統(tǒng)架構的一個示例。

圖5示出了用于利用非線性光學檢測對生物分子中的構象變化進行分析的光學設施的一個示例的示意圖。

圖6示出了用于利用非線性光學檢測對生物分子中的構象變化進行分析的光學設施的照片。

圖7示出了描繪利用棱鏡來以適當?shù)娜肷浣且龑Ъぐl(fā)光從而使激發(fā)光在基底的頂表面經(jīng)歷全內反射的示意圖。向棱鏡右側的兩條虛線指示出反射的激發(fā)光的光路以及當非線性-活性物種拴系到基底表面時在該表面生成的非線性光信號?；卓蛇x地連接到x-y平移臺上的的致動器以便在測量之間重新定位。棱鏡的頂表面與基底的底表面之間的曲線指示出用于確保棱鏡與基底之間的高光耦合效率的折射率匹配液薄層(未按比例繪制)的存在。

圖8a-圖8c示出了利用折射率匹配液的連續(xù)再循環(huán)流動來提供棱鏡(在本示例中附接到光學儀器)與基底(在本示例中配置成微孔板的透明底部)之間的高光耦合效率的系統(tǒng)的一個示例性設計概念的不同視圖?；?微孔板)可相對于棱鏡自由平移，而同時由指示的流體通道提供的折射率匹配液的連續(xù)流動確保激發(fā)光與基底的良好光耦合。圖8a：頂-前軸側視圖。圖8b：頂-后軸側視圖。圖8c：底-前軸側視圖。

圖9示出了描繪利用附接到或鄰近于透明基底(在本示例中配置成微孔板形式)的下表面的折射率匹配彈性體材料層來確保棱鏡與基底的上表面之間的高光耦合效率的示意圖。在該方法的一些實施方式中，棱鏡的上表面略微圓拱，以便在使微孔板與棱鏡相接觸時集中壓力，從而減少或消除棱鏡與彈性體材料之間的氣隙形成。

圖10a-圖10b圖示了具有用于提供激發(fā)光對基底的頂表面的良好光耦合的集成式棱鏡陣列的微孔板。在該方法中，由附接到基底下面的棱鏡陣列替代圖4、圖5、圖7和圖9的示意圖中指示的棱鏡。圖10a：頂軸側視圖。圖10b：底軸側視圖。

圖10c-圖10d示出了圖10a-圖10b中所示的微孔板裝置的分解圖。圖10c：頂軸側視圖。圖10d：底軸側視圖。

圖11圖示了利用圖10a-圖10b中圖示的設計概念經(jīng)由全內反射用于將激發(fā)光耦合到基底表面的入射光路和出射光路。

圖12示出了圖10a-圖10b中圖示的棱鏡陣列設計概念的原型的照片。

圖13a-圖13c示出了根據(jù)本公開內容的棱鏡陣列設計的一個示例。圖13a：頂視圖。圖13b：正視圖。圖13c：右視圖。

圖14示出了利用最早的模具設計和最早的注射成型工藝制造的棱鏡陣列的交叉偏振器圖像。注意觀察到的高水平的應力誘導雙折射。

圖15示出了在并入圖13a-圖13c和圖14中圖示的棱鏡陣列設計的微孔板裝置中的不同位置測量的shg信號強度的數(shù)據(jù)。shg信號強度作為孔列數(shù)的函數(shù)針對不同的行(不同的跡線)而測得。

圖16a-圖16c示出了根據(jù)本公開內容的改進的棱鏡陣列設計的示例。圖16a：頂視圖。圖16b：正視圖。圖16c右視圖。

圖17示出了利用改進的模具設計和優(yōu)化的注射成型工藝制造的棱鏡陣列的交叉偏振器圖像。注意與圖14中所示相比，觀察到的應力誘導雙折射水平顯著降低。

圖18示出了在并入圖16a-圖16c和圖17中圖示的棱鏡陣列設計的微孔板裝置中的不同位置測量的shg信號強度的數(shù)據(jù)。shg信號強度作為孔列數(shù)的函數(shù)針對不同的行(不同的跡線)而測得。注意與圖15中所示相比，shg信號強度水平在整個微孔板上更高并且更均勻。

圖19示出了用于制造圖16a-圖16c中圖示的棱鏡陣列部件的模具工具的剖開形式。

圖20圖示了模具工具中采用的、用于在從模具中脫除棱鏡陣列部件期間在其上提供均勻壓力的刀刃狀脫模特征。

圖21圖示了經(jīng)配置用于控制本文公開的系統(tǒng)的操作的計算機系統(tǒng)。

圖22是圖示可結合本發(fā)明示例實施方式使用的計算機系統(tǒng)的第一示例架構的框圖。

圖23是示出具有多個計算機系統(tǒng)、多個蜂窩電話和個人數(shù)字助理以及網(wǎng)絡附加存儲(nas)的網(wǎng)絡的一個實施方式的視圖。

圖24是根據(jù)示例實施方式，利用共享虛擬地址存儲器空間的多處理器計算機系統(tǒng)的框圖。

具體實施方式

本文公開的系統(tǒng)和方法涉及對生物實體中的構象的高通量分析。此外，所描述的系統(tǒng)和方法同樣適用于取向變化或構象變化的高通量分析。在本公開內容的一些方面，描述了響應于使生物實體與一種或多種測試實體相接觸而確定該生物實體的取向、構象或者取向變化或構象變化的系統(tǒng)和方法。如本文所用，確定取向、構象或其變化可涉及與非線性-活性標簽或標記物的平均取向相關和/或與之成比例的非線性光信號測量。如本文所使用，“高通量”是指針對可選地與一種或多種測試實體相接觸的大量生物實體進行快速構象分析的能力，或者是指針對可選地與大量測試實體相接觸的一種或多種生物實體進行快速構象分析的能力，或者這兩種模式的任意組合?？傮w而言，所公開的系統(tǒng)和方法依靠采用二次諧波發(fā)生(shg)或相關非線性光學技術來檢測取向、構象或構象變化，例如先前在美國專利第6,953,694號和美國專利申請第13/838,491號中所描述。

采用二次諧波發(fā)生的構象檢測

與更廣泛使用的基于熒光的技術相比，二次諧波發(fā)生是一種非線性光學過程，其中同一激發(fā)波長或頻率的兩個光子與非線性材料相互作用并作為具有激發(fā)光子的兩倍能量(即，其兩倍的頻率和一半的波長)的單個光子進行重新發(fā)射(圖1)。二次諧波發(fā)生僅發(fā)生在缺乏反演對稱性的非線性材料中(即，非中心對稱材料中)，并且需要高強度激發(fā)光源。這是和頻發(fā)生的一種特殊情況，并且與例如差頻發(fā)生等其他非線性光學現(xiàn)象相關。

二次諧波發(fā)生和其他非線性光學技術可因其對非線性-活性物種的相關性而配置成表面選擇性檢測技術。例如，非線性-活性物種向表面的拴系可以緩慢形成在分子可在溶液中自由經(jīng)歷旋轉擴散的情況下缺少的總體取向度。常用于對非線性-活性物種在界面處的取向相關性建模的公式為：

χ⁽²⁾＝ns<α⁽²⁾>

其中χ⁽²⁾是非線性極化率，ns是界面處每單位面積上非線性-活性分子的總數(shù)，而<α⁽²⁾>是這些分子的非線性超極化率(α⁽²⁾)的平均取向。shg的強度與非線性極化率的平方成比例，并且因此與界面處定向的非線性-活性物種的數(shù)目和其平均取向的變化二者均相關。

可以通過使用全內反射作為向非線性-活性物種固定于其上的光學界面遞送激發(fā)光的模式來額外使得二次諧波發(fā)生和其他非線性光學技術成為表面選擇性的。入射激發(fā)光的全內反射在界面處創(chuàng)造出“迅衰波”，其可以用于選擇性地僅激發(fā)靠近表面(即，迅衰波的空間衰減距離內，其通常為幾十納米級別)的非線性-活性標簽。全內反射還可以用于以表面選擇性的方式來激發(fā)熒光，例如，激發(fā)附接到光學界面的熒光供體，該熒光供體繼而經(jīng)由熒光共振能量轉移(fluorescenceresonanceenergytransfer，fret)機制將能量轉移到適宜的受體分子中。在本公開內容中，借助于激發(fā)光的全內反射生成的迅衰波優(yōu)選用于激發(fā)非線性-活性標簽或分子。對非線性活性物種的激發(fā)效率將會強烈依賴于其平均取向和其與界面的接近程度中的二者。

可以利用shg和其他非線性光學技術的這種表面選擇性質來檢測固定于界面的生物分子中的構象變化。例如，由于配體的結合而造成的受體分子中的構象變化可采用非線性-活性標簽或部分來檢測，其中所述標簽附接到或關聯(lián)于所述受體，以便使構象變化引起標簽相對于界面的取向或距離的變化(圖2)，并從而導致非線性光信號的物理性質的變化。直到最近，由于相對少數(shù)的生物樣品本身為非線性活性，因此對表面選擇性非線性光學技術的使用還主要局限于物理和化學應用上。最近，已經(jīng)介紹了對二次諧波活性標簽(“shg標簽”)的使用，從而事實上使得幾乎任何所提供的分子或粒子均具有高非線性活性。這方面的第一個例子由使用噁唑染料標記蛋白細胞色素c并利用二次諧波發(fā)生來檢測空氣-水界面處的蛋白綴合物所證實[salafsky,j.,“`shg-labels'fordetectionofmoleculesbysecondharmonicgeneration”,chem.phys.lett.342(5-6):485-491(2001)]。在圖3中示出了表示對α-突觸核蛋白中的精胺誘導的或亞精胺誘導的構象變化進行檢測的shg數(shù)據(jù)的示例。

表面選擇性非線性光學技術也為相干技術，這意味著基本光束和非線性光束具有以明確定義的空間關系和相位關系通過空間傳播的波前。針對分析生物分子或其他生物實體的構象而采用表面選擇性非線性光學檢測技術相比于其他光學方法具有多種固有優(yōu)勢，包括：i)非線性信號對于非線性-活性物種的取向和/或一個或多個偶極矩的敏感且直接的相關性，賦予其對構象變化的敏感性；(ii)比基于熒光的檢測更高的信噪比(較低的背景)，原因在于非線性光信號僅在創(chuàng)造出非中心對稱系統(tǒng)的表面處生成，即，該技術本身具有非常窄的“景深”；(iii)作為窄“景深”的結果，該技術在必須在有覆蓋溶液的情況下進行測量時(例如，在結合過程可能被分離或沖洗步驟所消除或擾亂的情況下)有用。該技術的這一方面對于進行需要大塊物體存在的平衡結合測量或者在限定時間段內進行測量的動力學測量可能特別有用；(iv)該技術表現(xiàn)出比熒光中發(fā)生的光漂白和加熱效應更低的光漂白和加熱效應，原因在于對于給定分子，雙光子吸收截面通常遠小于單光子吸收截面，并且shg(以及和頻發(fā)生或差頻發(fā)生)涉及散射而非吸收；(v)需要最少的收集光學器件并且預期信噪比較高，原因在于基本光束和非線性光束(例如，二次諧波光)相對于界面具有明確定義的傳入和傳出方向。這與基于熒光的檢測相比特別有利，因為熒光發(fā)射是各向同性的，并且對于由焦平面外熒光物產(chǎn)生的所檢測信號可能還存在較大的熒光背景成分。

高通量系統(tǒng)和方法

本文公開了基于利用二次諧波發(fā)生或相關非線性光學檢測技術來實現(xiàn)對生物實體中的構象的高通量分析的系統(tǒng)和方法。如本文所使用，“高通量”是與利用諸如nmr或x射線晶體學等傳統(tǒng)技術進行的結構測量相比的相對術語。如下文更詳細描述，本文公開的基于shg的方法和系統(tǒng)能夠以至少比常規(guī)技術快一個數(shù)量級的速率進行結構測定。

在一個方面，本公開內容提供了一種用于一種或多種生物實體中的構象或構象變化的高通量檢測的方法，該方法包括(i)用非線性-活性標簽或標記物來標記一個或多個靶生物實體，例如，蛋白質分子；(ii)將所述一個或多個經(jīng)標記的靶生物實體固定在平面基底表面的一個或多個非連續(xù)區(qū)域，其中所述基底表面進一步包括光學界面；(iii)通過改變基底相對于外部光源的位置，依次將每個非連續(xù)區(qū)域暴露于激發(fā)光下；(iv)在每個非連續(xù)區(qū)域暴露于激發(fā)光時收集從該非連續(xù)區(qū)域發(fā)射的非線性光信號；以及(v)處理所述非線性光信號以確定所述一種或多種生物實體中的每一種的取向、構象或構象變化。在另一方面，所述方法進一步包括(vi)繼第一次暴露于激發(fā)光之后，使所述一種或多種生物實體中的每一種與一種或多種測試實體相接觸；(vii)隨后將每個非連續(xù)區(qū)域一次或多次重新暴露于激發(fā)光；(viii)在每個非連續(xù)區(qū)域暴露于激發(fā)光時收集來自該非連續(xù)區(qū)域的非線性光信號；以及(ix)處理所述非線性光信號以確定在所述一種或多種生物實體中是否由于與所述一種或多種測試實體相接觸而發(fā)生取向或構象變化。在所述方法的一個方面，在所述一種或多種生物實體與一種或多種測試實體相接觸之后僅檢測一次非線性光信號，并繼而將其用于確定是否發(fā)生構象變化。在另一方面，在所述一種或多種生物實體與一種或多種測試實體相接觸之后以限定的時間間隔反復地收集非線性光信號(即，動力學模式)，并繼而將其用于確定所述一種或多種生物實體中的構象變化的動力學。在所述方法的一個優(yōu)選方面，基底的每個非連續(xù)區(qū)域包括支承的脂雙層結構，并且生物實體通過拴系到或嵌入在脂雙層內而固定于每個非連續(xù)區(qū)域中。在所述方法的另一優(yōu)選方面，通過全內反射將激發(fā)光遞送到基底表面(即，光學界面)，并且沿著與反射的激發(fā)光相同的光軸收集從所述基底表面的非連續(xù)區(qū)域中發(fā)射的非線性光信號。

為了實現(xiàn)使用非線性光學檢測對構象或構象變化進行高通量分析，本文所述系統(tǒng)需要若干組件(圖4中的示意圖)，其包括(i)至少一個適宜的激發(fā)光源，以及用于將所述至少一束激發(fā)光束遞送到光學界面的光學器件；(ii)可互換基底，其包括光學界面，一種或多種生物實體在所述基底的非連續(xù)區(qū)域中拴系或固定到該光學界面；(iii)高精度平移臺，用于將所述基底相對于所述至少一個激發(fā)光源進行定位；以及(iv)光學器件，用于收集由于用激發(fā)光照射所述基底的每個所述非連續(xù)區(qū)域而生成的非線性光信號并將所述非線性信號遞送到檢測器；以及(v)處理器，用于分析從所述檢測器接收的非線性光信號數(shù)據(jù)并確定固定在所述基底上的所述一種或多種生物實體的構象或構象變化。在一些方面，本文公開的系統(tǒng)和方法還包括使用(vi)可編程流體分配系統(tǒng)，用于向所述基底的所述非連續(xù)區(qū)域中的每一個遞送測試實體；以及(vii)使用板裝卸機器人，用于在與光學系統(tǒng)的界面處自動化定位和更換基底。

本文公開的方法和系統(tǒng)可被配置用于對于多種測試實體相接觸的單個生物實體的分析，或者用于與單個測試實體相接觸的多個生物實體的分析，或者其任意組合。當使一種或多種生物實體與多種測試實體相接觸時，可以依次進行接觸步驟，即，通過將固定的生物實體在指定時間段內暴露于單個測試實體，隨后是可選的沖洗步驟以去除測試實體溶液并在將固定的生物實體引入到下一測試實體之前使所述固定的生物實體再生，或者接觸步驟可以并行進行，即，通過讓多個非連續(xù)區(qū)域包含相同的固定生物實體，并使所述多個非連續(xù)區(qū)域中的每一個中的生物實體暴露于不同的測試實體。本文公開的方法和系統(tǒng)可被配置用于進行針對至少1種生物實體、至少2種生物實體、至少4種生物實體、至少6種生物實體、至少8種生物實體、至少10種生物實體、至少15種生物實體或至少20種生物實體中的構象變化的分析。在一些方面，本文公開的方法和系統(tǒng)可被配置用于進行針對至多20種生物實體、至多15種生物實體、至多10種生物實體、至多8種生物實體、至多6種生物實體、至多4種生物實體、至多2種生物實體或至多1種生物實體中的構象變化的分析。類似地，本文公開的方法和系統(tǒng)可被配置用于在所述一種或多種生物實體暴露于至少1種測試實體、至少5種測試實體、至少10種測試實體、至少50種測試實體、至少100種測試實體、至少500種測試實體、至少1000種測試實體、至少5000種測試實體、至少10000種測試實體或至少100000種測試實體時進行對構象變化的分析。在一些方面，本文公開的方法和系統(tǒng)可被配置用于在所述一種或多種生物實體暴露于至多100000種測試實體、至多10000種測試實體、至多5000種測試實體、至多1000測試實體、至多500種測試實體、至多100種測試實體、至多50種測試實體、至多10種測試實體、至多5種測試實體或至多1種測試實體時進行對構象變化的分析。

生物實體和測試實體

如本文所使用，詞組“生物實體”包括但不限于細胞、蛋白質、肽、受體、酶、抗體、dna、rna、生物分子、寡核苷酸、溶劑、小分子、合成分子、碳水化合物，或者其任意組合。類似地，詞組“測試實體”也包括但不限于細胞、蛋白質、肽、受體、酶、抗體、dna、rna、生物分子、寡核苷酸、溶劑、小分子、合成分子、碳水化合物，或者其任意組合。在一些方面，生物實體可包括藥物靶標或其部分，而測試實體可包括候選藥物或其部分。

非線性-活性標簽和標記技術

如上所述，大多數(shù)生物分子并非本來就是非線性-活性的。例外包括膠原蛋白，這是一種存在于大多數(shù)結構或承重組織中的結構蛋白質。shg顯微術已在例如角膜等含膠原蛋白結構的研究中得到廣泛應用。其他生物分子或實體則必須通過引入諸如標記物或標簽等非線性-活性部分才成為非線性-活性的。在本發(fā)明中采用的標簽是指可以共價或非共價結合到分子、粒子或相(例如，脂雙層)以便使得由此產(chǎn)生的系統(tǒng)更具非線性光學活性的非線性-活性部分、標記物、分子或粒子。在分子、粒子或相(例如，脂雙層)不具非線性-活性的情況下采用標簽以使得系統(tǒng)具有非線性-活性，或者在已經(jīng)具有非線性-活性的系統(tǒng)中采用標簽以向該系統(tǒng)中增加額外的表征參數(shù)。可以向分子、粒子或其他生物實體預附接外源性標簽，并且在用于本文所述方法之前，任何未結合或未反應標簽從經(jīng)標記實體分離出來。在本文公開的方法的特定方面，在將靶分子或生物實體固定于基底表面的非連續(xù)區(qū)域中之前，在體外將非線性-活性部分附接到靶分子或生物實體。用非線性-活性標簽標記生物分子或其他生物實體允許在經(jīng)標記生物分子或實體與另一分子或實體(即，測試實體)之間的相互作用導致該生物分子或實體的取向或構象變化的情況下，利用表面選擇性非線性光學技術以直接光學手段檢測該相互作用。

在本文所述方法和系統(tǒng)的備選方面，采用至少兩種可區(qū)分的非線性-活性標簽。繼而將會選擇附接的兩種或更多種可區(qū)分的標簽的取向以便有助于發(fā)出的相干非線性光束的明確定義的方向。所述兩種或更多種可區(qū)分的標簽能夠在如下的測定中使用，在該測定中，采用了相對于光學界面以一個或多個偏振方向入射的、處于一個或多個頻率的多個基本光束，得到至少兩個非線性光束的發(fā)射。

非線性-活性標記物或標簽的示例包括但不限于表1中所列的化合物及其衍生物。

表1.非線性-活性標記物的示例

在評價某一物質是否具有非線性-活性時，以下特性可以表明出非線性活性的潛力：大偶極矩差(分子的基態(tài)與激發(fā)態(tài)之間的偶極矩差)、熒光中的大斯托克斯位移，或者芳族或共軛結合特性。在進一步評價該物質時，實驗者可以利用本領域技術人員已知的簡單技術來確認非線性活性，例如，通過檢測來自非線性-活性物種所分布于的空氣-水界面的shg檢測來進行確認。一旦已針對所進行的實驗選擇合適的非線性-活性物種，如果需要，可以將該物質綴合到生物分子或實體用于本文公開的表面選擇性非線性光學方法。

以下參考文獻和其中的參考資料描述了用于由合成染料和許多其他分子產(chǎn)生經(jīng)標記的生物實體的可行技術：gregt.hermanson,bioconjugatetechniques,academicpress,newyork,1996。

在所公開的方法和系統(tǒng)的一個特定方面，對金屬納米顆粒和組件進行改性，以獲得生物非線性-活性標記物。以下參考文獻描述了金屬納米顆粒和組件的改性：j.p.novak和d.l.feldheim,"assemblyofphenylacetylene-bridgedsilverandgoldnanoparticlearrays",j.am.chem.soc.122:3979-3980(2000)；j.p.novak等"nonlinearopticalpropertiesofmolecularlybridgedgoldnanoparticlearrays",j.am.chem.soc.122:12029-12030(2000)；vance,f.w.,lemon,b.i.和hupp,j.t.,“enormoushyper-rayleighscatteringfromnanocrystallinegoldparticlesuspensions",j.phys.chem.b102:10091-93(1999)。

在本文公開的方法和系統(tǒng)的另一方面，還可以通過向分子信標也就是已被改性以并入非線性-活性標簽(或其調節(jié)劑)而非熒光團或猝滅劑的分子信標探針引入非線性類似物來操控系統(tǒng)的非線性活性。分子信標的這些非線性光學相似物在本文中稱為分子信標類似物(mb類似物或mba)。要在所描述的方法和系統(tǒng)中采用的mb類似物可以根據(jù)本領域普通技術人員已知的規(guī)程予以合成。

所檢測的生物相互作用類型

本文公開的方法和系統(tǒng)提供了根據(jù)生物實體、測試實體以及所采用的非線性活性標記技術的選擇，對生物實體之間或者生物實體與測試實體之間的多種相互作用的檢測。在一個方面，本公開內容提供了對結合事件的定性檢測，所述結合事件例如為如受體中誘導的所產(chǎn)生的構象變化所指出的、配體到受體的結合。在另一方面，本公開內容提供了通過使用不同濃度的配體分子進行重復測量并使用所觀察到的最大構象變化中的百分比變化生成劑量響應曲線對結合事件(例如，配體到受體的結合)的定量檢測。類似地，本公開內容的其他方面可以提供用于對酶-抑制劑相互作用、抗體-抗原相互作用、生物大分子復合物的形成或者受體與變構調節(jié)劑的相互作用進行定性或定量測量的方法。

在其他特定實施方式中，可以根據(jù)本文公開的方法，將mb類似物用作雜交探針，該雜交探針能夠檢測互補核酸靶標的存在，而不必像在溶液-相雜交測定中那樣從過量探針中分離出探針-靶標雜交體，并且無需標記靶標寡核苷酸。mb類似物探針還可以用于對活細胞內rna的檢測，用于監(jiān)測從生物反應器提取的樣品等分試樣中的特定核酸的合成，以及用于構建自報告寡核苷酸陣列。它們可以用于進行均勻一孔測定(one-wellassay)，用于鑒別dna中的單核苷酸變異，以及用于檢測固定到用于界面檢測的表面的病原體或細胞。

通過當前公開的方法，可以將生物實體之間或者生物實體與測試實體之間的相互作用(例如，結合反應、構象變化等)關聯(lián)到以下可測量非線性信號參數(shù)：(i)非線性光的強度；(ii)非線性光的波長或光譜；(iii)非線性光的偏振；(iv)(i)、(ii)或(iii)中的時間進程，以及/或者vi)(i)、(ii)、(iii)和(iv)中的一種或多種組合。

激光光源和激發(fā)光學系統(tǒng)

圖5圖示了本文公開的方法和系統(tǒng)的一個方面，其中通過反射來自包括樣品界面(或光學界面)的基底表面上的入射基本激發(fā)光來生成二次諧波光。圖6示出了適宜的光學設施的一個示例的照片。激光器提供在樣品界面處生成二次諧波光所必需的基本光。這通常將會是皮秒或飛秒激光器，其為波長可調式或不可調式，并且可從市場購得(例如，ti:藍寶石分秒激光器或光纖激光器系統(tǒng))。處于基頻(w)的光射出激光器，并且例如使用適合于該光的頻率和強度的半波片來選擇其偏振(例如，可從mellesgriot,oriel或newportcorp.購得)。光束繼而穿過被設計用于讓基本光通過但阻斷非線性光(例如，二次諧波光)的諧波分離器。該濾光器用于防止二次諧波光束向激光腔中的背反射——這可能對激光性能造成干擾。繼而使用反射鏡與透鏡的組合，在光束從最終反射鏡反射之前對該光束進行轉向和塑形，所述最終反射鏡經(jīng)由棱鏡引導光束在特定位置并以特定角度θ照射在基底表面上，使得其在該基底表面經(jīng)歷全內反射。如果需要，可以使用電流計控制鏡掃描器、旋轉多面鏡掃描器、布拉格衍射儀、聲光偏轉器或本領域已知的其它手段來掃描光路中的反射鏡中之一，以允許對反射鏡位置的控制。包括光學界面和非線性-活性樣品表面的基底可以安裝在(計算機控制的)x-y平移臺上，以選擇基底表面上的特定位置用于二次諧波光束的生成。在當前描述的方法和系統(tǒng)的一些方面，期望掃描或旋轉一個反射鏡以便為了全內反射而略微改變入射角，并從而在無需大幅改變照射的激發(fā)光斑的位置的情況下使得從基底表面的非連續(xù)區(qū)域發(fā)射的非線性光信號達到最大。在一些方面，可以使用具有不同基頻的兩個(或更多個)激光器在非線性活性樣品所固定于的光學界面處生成和頻光或差頻光。

基底形式、光學界面和全內反射

如上所述，本公開內容的系統(tǒng)和方法利用平面基底來將一種或多種生物實體固定在該基底的頂表面上，其中頂部基底表面還包括用于激發(fā)非線性光信號的光學界面(或樣品界面)。基底可以是玻璃、二氧化硅、熔融石英、塑料，或者任何對基本光束和二次諧波光束透明并且當激發(fā)光以適當角度入射時支持基底/樣品界面處的全內反射的其他固體材料。在本發(fā)明的一些方面，在其內部容納有生物實體的非連續(xù)區(qū)域被配置成一維或二維陣列，并且通過疏水涂層或薄金屬層彼此隔開。在其他方面，非連續(xù)區(qū)域可以包括基底表面中的凹坑。在其他方面，非連續(xù)區(qū)域可以通過孔形成組件而彼此分離，從而使基底形成微孔板(或微板)的底部，并且每個單獨的非連續(xù)區(qū)域形成微孔板中的一個孔的底部。在本公開內容的一個方面，孔形成組件將基底的頂表面分成96個單獨的孔。在另一方面，孔形成組件將基底的頂表面分成384個孔。在又一方面，孔形成組件將基底的頂表面分成1536個孔。在所有這些方面中，基底無論配置成平面陣列、凹陷陣列或微孔板形式，都可以包括與高通量系統(tǒng)的其他光學和機械組件相接合的一次性或消耗性裝置或盒。

本文公開的方法和系統(tǒng)進一步包括對將基底表面劃分成的非連續(xù)區(qū)域或孔的數(shù)目加以規(guī)定，不論非連續(xù)區(qū)域或孔之間是如何保持分離的。在基底上具有較大數(shù)目的非連續(xù)區(qū)域或孔在提高所述方法或系統(tǒng)的樣品分析通量方面可能是有利的。在本公開內容的一個方面，每基底的非連續(xù)區(qū)域或孔的數(shù)目為10個到1600個之間。在其他方面，非連續(xù)區(qū)域或孔的數(shù)目為至少10個、至少20個、至少50個、至少100個、至少200個、至少300個、至少400個、至少500個、至少750個、至少1000個、至少1250個、至少1500個或至少1600個。在所公開的方法和系統(tǒng)的其他方面，非連續(xù)區(qū)域或孔的數(shù)目為至多1600個、至多1500個、至多1000個、至多750個、至多500個、至多400個、至多300個、至多200個、至多100個、至多50個、至多20個或至多10個。在一個優(yōu)選方面，非連續(xù)區(qū)域或孔的數(shù)目為96個。在另一優(yōu)選方面，非連續(xù)區(qū)域或孔的數(shù)目為384個。在又一優(yōu)選方面，非連續(xù)區(qū)域或孔的數(shù)目為1536個。本領域技術人員將會明白，非連續(xù)區(qū)域或孔的數(shù)目可以在以這些值中的任何一個為界的任何范圍內(例如，從約12個到約1400個)。

本文公開的方法和裝置還包括對將基底表面劃分成的非連續(xù)區(qū)域或孔的表面積加以規(guī)定，不論非連續(xù)區(qū)域或孔之間是如何保持分離的。具有較大面積的非連續(xù)區(qū)域或孔可有助于在一些情況下對關聯(lián)的生物實體的方便進入和操控，而具有較小面積的非連續(xù)區(qū)域或孔在降低測定試劑量要求和提高所述方法或系統(tǒng)的樣品分析通量方面可能有利。在本公開內容的一個方面，非連續(xù)區(qū)域或孔的表面積為1mm²與100mm²之間。在其他方面，非連續(xù)區(qū)域或孔的面積為至少1mm²、至少2.5mm²、至少5mm²、至少10mm²、至少20mm²、至少30mm²、至少40mm²、至少50mm²、至少75mm²或至少100mm²。在所公開的方法和系統(tǒng)的其他方面，非連續(xù)區(qū)域或孔的面積為至多100mm²、至多75mm²、至多50mm²、至多40mm²、至多30mm²、至多20mm²、至多10mm²、至多5mm²、至多2.5mm²或至多1mm²。在一個優(yōu)選方面，非連續(xù)區(qū)域或孔的面積約為35mm²。在另一優(yōu)選方面，非連續(xù)區(qū)域或孔的面積約為8.6mm²。本領域技術人員將會明白，非連續(xù)區(qū)域或孔的面積可以在以這些值中的任何一個為界的任何范圍內(例如，從約2mm²到約95mm²)。

通過相對于激發(fā)光源重新定位基底而將基底表面的非連續(xù)區(qū)域依次暴露于激發(fā)光(用激發(fā)光對其進行照射)。入射激發(fā)光的全內反射在樣品界面產(chǎn)生“迅衰波”，其激發(fā)非線性活性標簽并導致二次諧波光(或者在一些方面，和頻光或差頻光)的生成。由于迅衰波的強度并且由此所生成的非線性光信號的強度依賴于激發(fā)光束的入射角，因此基底平面相對于激發(fā)光束的光軸的精確取向和光束到基底的有效光耦合對于實現(xiàn)整個非連續(xù)區(qū)域陣列上的最佳shg信號至關重要。在本公開內容的一些方面，通過激發(fā)光從基底表面的單一反射來實現(xiàn)全內反射。在其他方面，基底可被配置成波導，使得激發(fā)光在其沿著該波導傳播時經(jīng)歷多次全內反射。在其他方面，基底可被配置成零模式波導，其中通過納米工藝結構來創(chuàng)造消逝場。

諸如圖5和圖7中所示的光學設施中激發(fā)光束與基底之間的有效光耦合通常將會通過使用折射率匹配液諸如礦物油、礦物油與氫化三聯(lián)苯的混合物、全氟化碳液、甘油、丙三醇或具有接近1.5的折射率的類似的流體來實現(xiàn)，其中折射率匹配液被芯吸在棱鏡與基底的下表面之間。由于在基底的快速重新定位期間有可能破壞折射率匹配液的靜態(tài)無氣泡膜，因此本文公開的系統(tǒng)和方法包括產(chǎn)生高通量系統(tǒng)中激發(fā)光束到基底的有效光耦合的備選方法。

圖8圖示了本公開內容的高通量系統(tǒng)的一個方面，其中使用折射率匹配液的連續(xù)再循環(huán)流動來保持棱鏡與基底之間的有效光耦合，該棱鏡是作為光學系統(tǒng)的部件架設的，而基底則配置成微孔板形式(例如，玻璃底微板形式)并可相對于棱鏡自由平移。在這種情況下，折射率匹配液的連續(xù)流動確保了棱鏡與基底之間的流體薄膜在這兩個組件彼此相對移動時從不會被破壞，即，流體薄膜中的任何氣泡或間斷都會通過流體流動而從棱鏡與基底之間的間隙消除或排出。折射率匹配液經(jīng)由圖中指示的兩個流體通道引入到間隙中，并且可被收集在適宜的儲器或儲槽中，從該儲器或儲槽可以使用小型泵來對折射率匹配液進行再循環(huán)。在同一概念的備選實現(xiàn)方案中，將會采用單個非連續(xù)區(qū)域與圓柱形全內反射(tir)探針之間的點接觸，而非圖8中所指示的基底與棱鏡之間的線接觸，其中折射率匹配液將會向上流過中心流體通道，并繼而向下流過圓柱形tir探針的側面，從而被收集于適宜的儲器或儲槽中。

圖9圖示了本公開內容的高通量系統(tǒng)的另一方面，其中使用折射率匹配彈性體材料薄層代替折射率匹配液來保持棱鏡與基底之間的有效光耦合。在這種情況下，基底再次封裝成微孔板形式(例如，玻璃底微板形式)，但具有附接到或相鄰于基底的下表面的折射率匹配彈性體材料薄層，以便當置于與棱鏡的上表面相接觸時，彈性體填充棱鏡與基底之間的間隙并提供有效光耦合?？梢允褂玫膹椥泽w材料的示例包括但不限于具有約1.4的折射率的硅氧烷。在本公開內容的一個方面，彈性體材料的折射率為約1.35與約1.6之間。在其他方面，折射率為約1.6或更低、約1.55或更低、約1.5或更低、約1.45或更低、約1.4或更低或者約1.35或更低。在其他方面，折射率為至少約1.35、至少約1.4、至少約1.45、至少約1.5、至少約1.55或者至少約1.6。本領域技術人員將會明白，彈性體層的折射率可以在以這些值中的任何一個為界的任何范圍內(例如，從約1.4到約1.6)。在該方法的一個方面，彈性體材料層的厚度為約0.1mm與2mm之間。在其他方面，彈性層的厚度為至少0.1mm、至少0.2mm、至少0.4mm、至少0.6mm、至少0.8mm、至少1.0mm、至少1.2mm、至少1.4mm、至少1.6mm、至少1.8mm或至少2.0mm。在該方法的其他方面，彈性層的厚度為至多2.0mm、至多1.8mm、至多1.6mm、至多1.4mm、至多1.2mm、至多1.0mm、至多0.8mm、至多0.6mm、至多0.4mm、至多0.2mm或至多0.1mm。本領域技術人員將會明白，彈性層的厚度可以在以這些值中的任何一個為界的任何范圍內(例如，從約0.1mm到約1.5mm)。在該方法的另一方面，棱鏡的上表面具有部分地為圓柱形的凸脊或者呈圓拱形(圖9)，以集中壓力并在基底、彈性體層和棱鏡表面之間提供更好的接觸。該方法還可需要使用第三平移軸來定位基底，即，在激發(fā)步驟與檢測步驟之間，將會使基底(微孔板)略微上升，以在將基底重新定位到所要分析的下一非連續(xù)區(qū)域的位置之前消除彈性體層與棱鏡之間的接觸。

圖10a-圖10d圖示了本公開內容的高通量系統(tǒng)的優(yōu)選方面，其中棱鏡或光柵陣列與基底(封裝成微孔板形式)的下表面進行集成并且用于替代固定式棱鏡，從而完全消除對于折射率匹配液或彈性體層的需求。棱鏡(或光柵)陣列以這樣的方式與基底的上表面上的非連續(xù)區(qū)域或孔陣列對準：使得入射激發(fā)光被“入口棱鏡”(“入口光柵”)以實現(xiàn)激發(fā)光束從樣品界面全內反射的入射角引導至與入口棱鏡(入口光柵)相鄰但不位于其正上方的非連續(xù)區(qū)域或孔(見圖11)，并且使得反射的激發(fā)光束以及在照射的非連續(xù)區(qū)域生成的非線性光信號被從所探查的非連續(xù)區(qū)域再度偏移(與之相鄰但不位于其正下方)的“出口棱鏡”(“出口光柵”)所收集，并且其中針對每個非連續(xù)區(qū)域的入口棱鏡和出口棱鏡(入口光柵和出口光柵)是陣列中不同的、非唯一元件。

總體而言，對于包含m行xn列單個特征的非連續(xù)區(qū)域陣列，對應的棱鏡或光柵陣列將具有m+2行xn列或者n+2列xm行單個棱鏡或光柵。在一些實施方式中，m的值可以是至少2、至少4、至少6、至少8、至少12、至少14、至少16、至少18、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45或至少50行。在一些實施方式中，m的值可以是至多50、至多45、至多40、至多35、至多30、至多25、至多20、至多18、至多16、至多14、至多12、至多10、至多8、至多6、至多4或至多2行。類似地，在一些實施方式中，n的值可以是至少2、至少4、至少6、至少8、至少12、至少14、至少16、至少18、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45或至少50列。在一些實施方式中，n的值可以是至多50、至多45、至多40、至多35、至多30、至多25、至多20、至多18、至多16、至多14、至多12、至多10、至多8、至多6、至多4或至多2列。對于本領域技術人員顯而易見，m和n可以具有相同的值或不同的值，并且可以具有上述指定范圍內的任何值，例如，m＝15而n＝45。

單個棱鏡或光柵的幾何形狀和尺寸，包括棱鏡或光柵陣列層的厚度，被優(yōu)化以確保入射光在基底的選定非連續(xù)區(qū)域經(jīng)歷全內反射，并且與基底(微孔板)相對于激發(fā)光束的位置無關地以高光耦合效率收集在所述選定非連續(xù)區(qū)域處生成的非線性光信號。圖12示出了棱鏡陣列原型的照片。棱鏡或光柵陣列可以通過本領域技術人員已知的多種技術來制造，例如，在一個優(yōu)選方面，它們可以由諸如環(huán)烯烴共聚物(coc)或環(huán)烯烴聚合物(cop)、丙烯酸、聚酯或類似的聚合物等平滑流動的低雙折射材料注射成型。在一些方面，棱鏡或光柵陣列可以制造成單獨的組件，并于隨后與基底的下表面進行集成。在其他方面，棱鏡和光柵陣列可以基底自身一體化特征予以制造。

固定化學

如本文所公開，上述任何形式的基底被進一步配置用于生物實體在指定非連續(xù)區(qū)域內的固定。生物分子或細胞的固定可以通過本領域技術人員已知的多種技術來實現(xiàn)，例如，通過采用氨丙基硅烷化學以胺官能團使玻璃或熔融石英表面功能化，隨后使用胺反應性共軛化學來直接與感興趣的生物分子共價耦合或者經(jīng)由中間間隔基或連接體分子來共價耦合。還可以直接或間接地例如通過利用bsa-nhs(bsa-n-羥基琥珀酰亞胺)來利用非特異性吸附，具體是首先將bsa分子層附接到表面并繼而用n，n'-二琥珀酰亞胺基碳酸酯將其活化。bsa上的活化賴氨酸、天冬氨酸或谷氨酸殘基與蛋白質上的表面胺類反應。

在本公開內容的一個優(yōu)選方面，生物分子可以通過拴系到或嵌入于“支承的脂雙層”中而固定在表面上，后者包含通過疏水或靜電相互作用約束于硅或玻璃表面的脂雙層小片，其中所述雙層“浮”在含水緩沖液薄層上的基底表面上方。還可以使用或不使用膜蛋白或其他膜相關成分來制備支承磷脂雙層，例如在以下文獻中所描述：salafsky等“architectureandfunctionofmembraneproteinsinplanarsupportedbilayers:astudywithphotosyntheticreactioncenters",biochemistry35(47):14773-14781(1996)；gennis,r.,biomembranes,springer-verlag,1989；kalb等“formationofsupportedplanarbilayersbyfusionofvesiclestosupportedphospholipidmonolayers”,biochimicabiophysicaacta.1103:307–316(1992)；以及brian等"allogeneicstimulationofcytotoxict-cellsbysupportedplanarmembranes",pnas-biologicalsciences81(19):6159-6163(1984)；上述文獻的相關部分通過引用而并入于此。支承磷脂雙層是本領域中公知的，并且有多種技術可以用于其制造。支承雙層通常應當浸沒在水溶液中以防止其在暴露于空氣時受損。

收集光學器件和檢測器

圖5進一步圖示了用于檢測在依次照射基底的非連續(xù)區(qū)域時生成的非線性光信號的收集光學器件和檢測器。由于表面選擇性非線性光學技術是相干技術，意味著基本光束和非線性光學光束具有以明確定義的空間關系和相位關系通過空間傳播的波前，因此需要最少的收集光學器件。通過棱鏡(或者上述微板裝置的集成式棱鏡或光柵陣列)收集發(fā)射的非線性光信號，并經(jīng)由分色反射器或反射鏡將其引導至檢測器?？蛇x地采用附加的光學組件，例如，透鏡、光學帶通濾光器、反射鏡等，在光束到達檢測器之前進一步對該光束進行塑形、轉向和/或過濾?？梢圆捎枚喾N不同的光檢測器，包括但不限于光電二極管、雪崩光電二極管、光電倍增管、cmos傳感器或ccd器件。

x-y平移臺

如圖4中所示，本文公開的高通量系統(tǒng)的實現(xiàn)方案理想情況下利用高精度x-y(或者在一些情況下，x-y-z)平移臺來相對于激發(fā)光束重新定位基底(上述任何形式的基底)。適宜的平移臺可從多個供應商處商購獲得，例如，從parkerhannifin購得。精確平移臺系統(tǒng)通常包括若干組件的組合，包括但不限于：線性驅動器、光學編碼器、伺服和/或步進馬達，以及馬達控制器或驅動單元。本文所公開的系統(tǒng)和方法要求平臺移動的高精度和可重復性，以便確保當布置進行反復的光學檢測和/或液體分配步驟時對非線性光信號的準確測量。另外，由于激發(fā)光的焦斑的大小[在直徑或邊長方面為20-200微米]顯著小于基底的非連續(xù)區(qū)域的大小，因此在本公開內容的一些方面，可能還期望在進行重復測量時返回到給定非連續(xù)區(qū)域內的略微不同的位置，或者在單次測量的過程中跨非連續(xù)區(qū)域的一部分緩慢掃描激發(fā)光束，從而消除關于長時暴露或預先暴露的光漂白效應的潛在擔憂。

因此，本文公開的方法和系統(tǒng)進一步包括指定平移臺所能夠相對于激發(fā)光束定位基底的精度。在本公開內容的一個方面，平移臺的精度為約1um與約10um之間。在其他方面，平移臺的精度為約10um或更低、約9um或更低、約8um或更低、約7um或更低、約6um或更低、約5um或更低、約4um或更低、約3um或更低、約2um或更低或者約1um或更低。本領域技術人員將會明白，平移臺的精度可以在以這些值中的任何一個為界的任何范圍內(例如，從約1.5um到約7.5um)。

流體分配系統(tǒng)

如圖4中所示，本文所公開的高通量系統(tǒng)的一些實施方式還包括用于使固定在基底表面上的生物實體或靶實體與測試實體(或測試化合物)相接觸的自動化可編程流體分配(或液體分配)系統(tǒng)，后者通常分配于包含添加或未添加例如二甲基亞砜(dmso)等少量有機溶劑成分的含水緩沖液的溶液中。適宜的自動化可編程流體分配系統(tǒng)可從多個供應商處商購獲得，例如，從beckmancoulter、perkinelmer、tecan、velocity11以及許多其他供應商購得。在本文所公開的系統(tǒng)和方法的優(yōu)選方面，流體分配系統(tǒng)還包括多通道分配頭，例如，4通道、8通道、16通道、96通道或384通道分配頭，用于將可編程體積的液體(例如，范圍從約1微升到若干微升)同時遞送到基底上的多個孔或位置。

板裝卸機器人

在本文公開的高通量系統(tǒng)的其他方面，該系統(tǒng)進一步包括微板裝卸(或板裝卸)機器人系統(tǒng)(圖4)，用于相對于光學激發(fā)和檢測光學器件更換和定位基底(上述任何形式的基底)，或者用于可選地在光學儀器與流體分配系統(tǒng)之間移動基底。合適的自動化可編程微板裝卸機器人系統(tǒng)可從多個供應商處商購獲得，包括beckmancoulter、perkinelemer、tecan、velocity11以及許多其他供應商。在本文公開的系統(tǒng)和方法的一個優(yōu)選方面，自動化微板裝卸機器人系統(tǒng)被配置用于從和向冷藏存儲單元移動包含固定的生物實體和/或測試化合物的等分試樣的多個微孔板。

處理器/控制器和基于約束的調度算法

在本公開內容的另一方面，所公開的高通量系統(tǒng)還包括處理器(或控制器，或者計算機系統(tǒng))(圖4)，該處理器被配置用于運行系統(tǒng)軟件，該系統(tǒng)軟件控制所描述的各個子系統(tǒng)(激發(fā)和檢測光學系統(tǒng)、x-y(或x-y-z)平移臺、流體分配系統(tǒng)，以及板裝卸機器人)以及對進行高通量構象分析所涉及的不同操作步驟進行同步。除了處置數(shù)據(jù)采集過程(即，從檢測器收集對應于與構象變化相關聯(lián)的非線性光信號的輸出電子信號)之外，處理器或控制器通常還被配置用于儲存數(shù)據(jù)、執(zhí)行數(shù)據(jù)處理和顯示功能(包括確定所測試的生物實體或者生物實體與測試實體的組合是否發(fā)生了取向或構象變化)，以及操作圖形用戶界面以供操作者進行交互控制。處理器或控制器還可以與其他處理器連網(wǎng)，或者連接到因特網(wǎng)以便與遠程位置上的其他儀器和計算機通信。

處理器/控制器的典型輸入?yún)?shù)可以包括設置參數(shù)，諸如所要分析的微孔板總數(shù)；每板的孔數(shù)；要針對基底的每個非連續(xù)區(qū)域或微孔板的孔執(zhí)行激發(fā)和檢測步驟的次數(shù)(例如，以便指定終點測定或動力學測定模式)；應當針對每個非連續(xù)區(qū)域或孔收集動力學數(shù)據(jù)的總時間過程；要向每個非連續(xù)區(qū)域或孔遞送的測試化合物溶液的順序、定時和體積；收集和整合非線性光信號的駐留時間；輸出數(shù)據(jù)文件的一個或多個名稱；以及本領域技術人員已知的多種系統(tǒng)設置和控制參數(shù)中的任何參數(shù)。

在本公開內容的一個優(yōu)選方面，處理器或控制器進一步被配置用于通過執(zhí)行基于約束的調度算法來進行系統(tǒng)通量優(yōu)化。該算法利用上述系統(tǒng)設置參數(shù)來確定針對可能彼此相鄰或者可能彼此不相鄰的非連續(xù)區(qū)域的穿插激發(fā)/檢測和液體分配步驟的最佳順序，從而在每小時分析的生物實體和/或測試實體數(shù)目方面使系統(tǒng)的總通量達到最大。系統(tǒng)操作步驟的優(yōu)化是實現(xiàn)高通量分析的重要方面。在所公開的方法和系統(tǒng)的一些方面，分析系統(tǒng)的平均通量范圍可以是從每小時測試約10個測試實體到每小時測試約1000個測試實體。在一些方面，分析系統(tǒng)的平均通量可以是每小時測試至少10個測試實體、每小時測試至少25個測試實體、每小時測試至少50個測試實體、每小時測試至少75個測試實體、每小時測試至少100個測試實體、每小時測試至少200個測試實體、每小時測試至少400個測試實體、每小時測試至少600個測試實體、每小時測試至少800個測試實體或者每小時測試至少1000個測試實體。在其他方面，分析系統(tǒng)的平均通向可以是每小時測試至多1000個測試實體、每小時測試至多800個測試實體、每小時測試至多600個測試實體、每小時測試至多400個測試實體、每小時測試至多200個測試實體、每小時測試至多100個測試實體、每小時測試至多75個測試實體、每小時測試至多50個測試實體、每小時測試至多25個測試實體或者每小時測試至多10個測試實體。

計算機系統(tǒng)和網(wǎng)絡

在各個實施方式中，本發(fā)明的方法和系統(tǒng)可以進一步包括安裝在計算機系統(tǒng)上的軟件程序及其用途。相應地，如上文所述，對各個子系統(tǒng)的計算機控制和對進行高通量構象分析所涉及的包括數(shù)據(jù)分析和顯示在內的不同操作步驟的同步都在本發(fā)明的范圍內。

圖21中所示的計算機系統(tǒng)500可以理解為能夠從介質511和/或網(wǎng)絡端口505讀取指令的邏輯裝置，所述網(wǎng)絡端口505能夠可選地連接到具有固定介質512的服務器509上。諸如圖21中所示的系統(tǒng)可以包括cpu501、磁盤驅動器503、可選的輸入設備諸如鍵盤515和/或鼠標516以及可選的監(jiān)視器507。通過圖中所示通向本地或遠程位置上的服務器的通信介質可以實現(xiàn)數(shù)據(jù)通信。所述通信介質可以包括任何傳輸和/或接收數(shù)據(jù)的手段。例如，通信介質可以是網(wǎng)絡連接、無線連接或者因特網(wǎng)連接。這樣的連接可以提供通過萬維網(wǎng)的通信?？梢韵氲?，與本公開內容相關的數(shù)據(jù)可以通過這樣的網(wǎng)絡或連接來傳輸，以供如圖21中所示的一方522來接收和/或審核。

圖22是圖示能夠與本發(fā)明的示例實施方式相結合使用的計算機系統(tǒng)100的第一示例架構的框圖。如圖22中所描繪，示例計算機系統(tǒng)可以包括用于處理指令的處理器102。處理器的非限制性示例包括：intelxeon^tm處理器、amdopteron^tm處理器、samsung32位riscarm1176jz(f)-sv1.0^tm處理器、armcortex-a8samsungs5pc100^tm處理器、armcortex-a8applea4^tm處理器、marvellpxa930^tm處理器，或者功能上等同的處理器。可以利用多線程執(zhí)行來進行并行處理。在一些實施方式中，還可以使用多個處理器或者具有多個核的處理器，無論是在單一計算機系統(tǒng)中、集群中，還是分布在包括多個計算機、蜂窩電話和/或個人數(shù)字助理裝置的網(wǎng)路上的系統(tǒng)之間。

如圖22中所示，高速緩存104可以連接到或者并入在處理器102中，以便為處理器102最近使用或頻繁使用的指令或數(shù)據(jù)提供高速存儲器。處理器102通過處理器總線108連接到北橋106。北橋106通過存儲器總線112連接到隨機存取存儲器(ram)110，并管理處理器102對ram110的訪問。北橋106還通過芯片組總線116連接到南橋114。南橋114轉而連接到外圍總線118。外圍總線例如可以是pci、pci-x、pciexpress或其他外圍總線。北橋和南橋通常稱為處理器芯片組并且管理處理器、ram和外圍總線118上的外圍組件之間的數(shù)據(jù)傳輸。在一些備選架構中，北橋的功能可以并入到處理器中，而不是采用單獨的北橋芯片。

在一些實施方式中，系統(tǒng)100可以包括附接到外圍總線118的加速器卡122。加速器可以包括現(xiàn)場可編程門陣列(fpga)或其他用于加速某種處理的硬件。例如，加速器可以用于自適應數(shù)據(jù)重組，或者用于評價擴展集處理中的代數(shù)表達式。

外部存儲124中的軟件和數(shù)據(jù)可以加載到ram110和/或緩存104中以供處理器使用。系統(tǒng)100包括用于管理系統(tǒng)資源的操作系統(tǒng)；操作系統(tǒng)的非限制性示例包括：linux、windows^tm、macos^tm、blackberryos^tm、ios^tm和其他功能上等同的操作系統(tǒng)，以及運行于操作系統(tǒng)之上的應用軟件用于管理數(shù)據(jù)存儲和根據(jù)本發(fā)明的示例實施方式的優(yōu)化。

在本示例中，系統(tǒng)100還包括網(wǎng)絡接口卡(nic)120和121，所述nic120和121連接到外圍總線，用于提供通向諸如網(wǎng)絡附加存儲(nas)等外部存儲和其他可用于分布式并行處理的計算機系統(tǒng)的網(wǎng)絡接口。

圖23為示出網(wǎng)絡200的視圖，該網(wǎng)絡200具有多個計算機系統(tǒng)202a和202b、多個蜂窩電話和個人數(shù)據(jù)助理202c，以及網(wǎng)絡附加存儲(nas)204a和204b。在示例實施方式中，系統(tǒng)202a、202b和202c可以管理數(shù)據(jù)存儲和優(yōu)化對儲存在網(wǎng)絡附加存儲(nas)204a和204b中的數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)訪問?？梢葬槍?shù)據(jù)采用數(shù)學模型，并且利用跨計算機系統(tǒng)202a和202b以及蜂窩電話和個人數(shù)字助理系統(tǒng)202c的分布式并行處理來對其進行評價。計算機系統(tǒng)202a和202b以及蜂窩電話和個人數(shù)字助理系統(tǒng)202c還可以提供用于對儲存在網(wǎng)絡附加存儲(nas)204a和204b中的數(shù)據(jù)進行自適應數(shù)據(jù)重組的并行處理。圖23僅圖示了一個示例，而各種各樣的其他計算機架構和系統(tǒng)均可結合本發(fā)明的各個實施方式使用。例如，可以使用刀片服務器來提供并行處理。處理器刀片可以通過背板連接，以提供并行處理。存儲也可以連接到背板，或者通過單獨的網(wǎng)絡接口作為網(wǎng)絡附加存儲(nas)而連接。

在一些示例實施方式中，處理器可以保持單獨的存儲器空間，并通過網(wǎng)絡接口、背板或其他連接器傳輸數(shù)據(jù)，以供由其他處理器進行并行處理。在其他實施方式中，一些或所有處理器可以使用共享虛擬地址存儲器空間。

圖24是根據(jù)示例實施方式，利用共享虛擬地址存儲器空間的多處理器計算機系統(tǒng)300的框圖。該系統(tǒng)包括可以訪問共享存儲器子系統(tǒng)304的多個處理器302a-f。系統(tǒng)在存儲器子系統(tǒng)304中并入了多個可編程硬件存儲器算法處理器(map)306a-f。每個map306a-f可以包括存儲器308a-f以及一個或多個現(xiàn)場可編程門陣列(fpga)310a-f。map提供了可配置的功能單元，并且特定算法或算法部分可被提供給fpga310a-f用于密切協(xié)同相應的處理器進行處理。例如，在示例實施方式中，map可以用于評價關于數(shù)據(jù)模型的代數(shù)表達式，以及進行自適應數(shù)據(jù)重組。在該示例中，每個map可由所有處理器出于這些目的而全局訪問。在一種配置下，每個map可以使用直接存儲器存取(dma)來訪問關聯(lián)的存儲器308a-f，從而允許其與相應的微處理器302a-f獨立地和異步地執(zhí)行任務。在該配置下，map可以直接將結果饋送到另一map以供算法的流水線操作和并行執(zhí)行。

上述計算機架構和系統(tǒng)僅為示例，并且各種各樣的其他計算機、蜂窩電話和個人數(shù)字助理架構和系統(tǒng)均可結合示例實施方式來使用，包括采用通用處理器、協(xié)處理器、fpga和其他可編程邏輯器件、片上系統(tǒng)(soc)、專用集成電路(asic)以及其他處理和邏輯元件的任意組合的系統(tǒng)。在一些實施方式中，整個計算機系統(tǒng)或其部分能夠以軟件或硬件來實現(xiàn)。可以結合示例實施方式使用任何種類的數(shù)據(jù)存儲，包括隨機存取存儲器、硬盤驅動器、閃速存儲器、磁帶驅動器、磁盤陣列、網(wǎng)絡附加存儲(nas)以及其他本地式或分布式數(shù)據(jù)存儲設備和系統(tǒng)。

在示例實施方式中，計算機系統(tǒng)可以利用執(zhí)行于任何上述或其他計算機架構和系統(tǒng)上的軟件模塊來實現(xiàn)。在其他實施方式中，系統(tǒng)的功能可以部分地或全部地實現(xiàn)于固件、可編程邏輯器件諸如參照圖24的現(xiàn)場可編程門陣列(fpga)、片上系統(tǒng)(soc)、專用集成電路(asic)或者其他處理和邏輯元件中。例如，可以通過利用硬件加速器卡，諸如圖22中所示的加速器卡122，利用硬件加速來實現(xiàn)集處理器和優(yōu)化器。

實施例1(說明性)

g蛋白偶聯(lián)受體(例如，血清素、多巴胺、谷氨酸、趨化因子和組胺受體)是一類在由配體活化時經(jīng)歷構象變化的蛋白質，并且因此適合利用本發(fā)明進行研究?？梢允褂梅蔷€性活性標簽來標記無固有非線性-活性的gpcr，并且經(jīng)由非線性活性標簽的取向變化來檢測構象變化。一種或多種標記的gpcr蛋白質可以通過例如將蛋白質分子嵌入在玻璃基底上的支承脂雙層結構陣列中而附接到表面，其中陣列中的每個雙層結構包含單一種類的gpcr分子。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，每個支承脂雙層結構被約束在微板的單個孔內。當配體的結合活化gpcr受體時產(chǎn)生的構象變化導致標簽相對于分子所固定于的光學界面的取向變化，并且因此導致非線性光束(例如，二次諧波光)的性質變化，諸如強度、波長或偏振的變化。

在篩選實驗中，將包含固定的gpcr的微孔板定位在高通量分析系統(tǒng)的平移臺機構上，并將其移動到用于測量第一孔中的信號的位置。通過測量來自第一孔的非線性光信號，將微孔板重新定位到第二孔以重復背景測量并以此類推，可以在固定的gpcr分子暴露于測試化合物之前針對一個或多個gpcr樣品測量背景信號。繼而在添加測試化合物之后，在一個(終點測定模式)或多個(動力學測量模式)限定的時間點，針對每個孔進行對非線性光信號的重復測量，并對其進行分析以確定測試化合物是否誘導了所述一個或多個gpcr種類中的構象變化。

在一些情況下，即使gpcr未被測試化合物活化，但測試化合物到gpcr分子的結合仍可導致測得的非線性光學性質的變化。例如，這可能是由于結合復合物中測試化合物與gpcr分子之間的相互作用，該相互作用改變附接的標簽相對于受體分子的取向而不是改變受體分子的構象。如果需要，可以例如通過采用已知會結合到給定的gpcr受體但不會產(chǎn)生構象變化的化合物來進行對照，以將測得的非線性光學性質的變化歸因于受體的結合或活化。如果必要，可以通過改變標簽的共軛化學和/或對受體進行基因修飾以引入新的標記位點來改變gpcr上的標簽的位置，以便確保觀察到的非線性光信號中的變化與受體活化或構象變化相關聯(lián)。

在上述實施例中，借助于通過使用精確x-y平移臺相對于激發(fā)光束重新定位玻璃基底(微板)，同時通過上文公開的再循環(huán)折射率匹配液、折射率匹配彈性體或棱鏡光柵設計保持有效光耦合，對固定在玻璃基底上的脂雙層結構陣列中(并進一步通過其所位于的孔而分離)的每個gpcr分子進行測量。

通常，測試化合物溶液向微板的孔中的分配將會由與光學儀器系統(tǒng)相集成的可編程自動化液體分配單元來進行。固定在微板的孔中的每個gpcr種類可以暴露于相同的測試化合物，或者可以各自暴露于不同的測試化合物。在本發(fā)明的一些方面，高通量分析系統(tǒng)將進一步包括機器人，其用于將包含待分析的gpcr樣品的微孔板從外部存儲系統(tǒng)移動到平移臺的原位，或者其利用新的樣品板來替換已完成分析的包含gpcr的微板。在本發(fā)明的其他方面，高通量分析系統(tǒng)將進一步包括附加的機器人，用于將包含多種測試化合物的標準微板移入和移出液體分配單元的原位。

在本發(fā)明的一個優(yōu)選方面，計算機系統(tǒng)(即，處理器或控制器)被配置用于運行軟件以便：(i)控制高通量分析系統(tǒng)的所有可編程組件；(ii)對將微孔板移入和移出位置、進行背景光學測量、分配測試化合物溶液以及重復用于終點或動力學模式測定的光學測量的操作步驟進行同步；(iii)儲存和處理從檢測器接收的非線性光信號數(shù)據(jù)；以及(iv)通過利用輸入系統(tǒng)設置參數(shù)(例如，待分析的微孔板數(shù)目、每板孔數(shù)、待測試的測試化合物數(shù)目、終點或動力學測量模式等)計算針對每個微板上的不同孔的穿插背景測量、測試化合物分配和重復測量步驟的最佳次序，來優(yōu)化分析的總通量(例如，在每小時分析的gpcr樣品/測試化合物組合數(shù)目方面)。

實施例2(用于制造棱鏡陣列的模具設計與工藝)

圖13中示出了創(chuàng)建用于制造原始“躍階棱鏡”設計的模具，以及由特種光學成型工廠進行的注射成型工藝(apollooptical,rochester,ny)。所得到的部件顯示出應力雙折射(見圖14中的交叉偏振器圖像)，并且測得的shg信號受到這種雙折射的不利影響(圖15)，其中信號沿著棱鏡陣列的長度削弱。

為了減少或消除對shg信號的雙折射作用，發(fā)明人對所使用的塑料類型(cop、coc、丙烯酸等)、不同的成型加工條件(溫度、壓力、流速、循環(huán)時間等)以及成型后退火進行了實驗。發(fā)明人能夠找到適度減少雙折射的材料和工藝參數(shù)，但這些條件也傾向于造成塑料部件緊貼模具并且在從模具中脫除時破裂。(注意：該模具包含僅在部件的出口端和澆口端推動的脫模器件)。對部件進行退火顯著減少了應力雙折射，但卻導致部件的過度機械翹曲，從而使其報廢。

注射成型流仿真顯示，應力主要是在從平面澆口到棱鏡結構部件(結果未示出)的過渡中產(chǎn)生的。仿真結果還預測可以將部件制作得比所需更長，并于隨后修剪成合適長度，從而機械去除成型部件的應力區(qū)域并產(chǎn)生具有與原始設計相同的最終長度的棱鏡陣列。

模流仿真的結果用于設計包括以下多種顯著改變的新模具：

1.增加部件的總長度，以允許修剪掉雙折射過渡區(qū)。

2.將澆口特征和出口特征制作得更長，以降低塑料中的剪切應力。

3.沿著部件的長度和寬度添加脫模特征，以幫助從模具中脫除并降低在脫除過程中造成部件破裂的可能性。

4.向陣列的平面?zhèn)忍砑印澳z凸點”，以控制在將棱鏡陣列層壓到玻璃底微板時的膠層厚度，并改善溫度變化期間的膠粘。

圖16中示出了新的部件設計，包括澆口(左)和出口(右)特征。圖19示出了模具工具的剖開形式。注意，存在6x3的“脫模器刀刃”器件(即，“脫模器件”)，其在模具脫除期間用于對脫除過程中的部件施加更均勻的壓力(圖20)。還在澆口區(qū)域和出口區(qū)域中使用了附加的脫模特征(未示出)?？傮w而言，光學質量模制部件根本不使用脫模器，原因在于脫模器會碰觸部件的表面并可能產(chǎn)生瑕疵。由于發(fā)明人的棱鏡陣列設計具有一些并非光學重要的區(qū)域，因此發(fā)明人能夠布置脫模器刀刃用于僅在其中部件的光學性能不關鍵的這些區(qū)域中碰觸部件。

總體而言，mxn的脫模器件陣列中刀刃狀脫模器特征的數(shù)目越大，模具脫除期間施加在部件上的壓力就越均勻。在一些實施方式中，m和/或n將具有的值為至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或者至少20。在一些實施方式中，m和/或n將具有的值為至多20、至多19、至多18、至多17、至多16、至多15、至多14、至多13、至多12、至多11、至多10、至多9、至多8、至多7、至多6、至多5、至多4、至多3或者至多2。m和n的值可以相同或者可以不同，并且可以包括上述指定范圍內的值的任意組合。

新的模具設計，特別是脫模特征允許注射成型供應商對可能在原始模具中造成釋放破裂的不同壓力和溫度特性進行實驗。這些條件有效地解除了塑料在成型加工期間的應力，但會造成部件更緊地貼附到光學模具表面。分布在部件的整個長度和寬度上的脫模器特征允許部件從模具脫出而不造成破裂。利用新模具制作的棱鏡部件具有可忽略不計的應力雙折射，如圖17中的交叉偏振器圖像所示。shg數(shù)據(jù)還顯示出沿著棱鏡陣列的長度的均勻得多的信號響應(圖18)。殘余雙折射仍可檢測到，但部件的額外長度允許優(yōu)化局部修剪，以切除其中存在最大雙折射的過渡區(qū)域(數(shù)據(jù)未示出)。

盡管本文中已經(jīng)示出并描述了本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，但對于本領域技術人員顯而易見的是這些實施方式僅以示例的方式提供。本領域技術人員在不脫離本發(fā)明的情況下現(xiàn)將想到多種變化、改變和替代。應當理解本文中所述的本發(fā)明實施方式的各種替代方案均可用于實施本發(fā)明。所附述權利要求旨在限定本發(fā)明的范圍，并由此涵蓋這些權利要求范圍內的方法和結構及其等同物。